Sumário

O Bit1 mitocondrial (Bcl-2 inibidor de transcrição 1) a proteína é uma parte de uma via de apoptose que é regulado de forma única por ligação mediada por integrina. Como um efetor anoikis, Bit1 é liberado para o citoplasma após perda de aderência celular e induz uma forma independente de caspase de apoptose. Considerando que a resistência anoikis é um determinante crítico da transformação, a hipótese de que as células cancerosas podem contornar a via apoptótica Bit1 para atingir ancoragem-independência e potencial tumorigénico. Aqui, nós proporcionam a primeira evidência do efeito supressor do tumor de Bit1 através de um mecanismo que envolve a indução anoikis em células A549 derivadas de adenocarcinoma do pulmão humano. Restituição de Bit1 em células A549 resistentes anoikis é suficiente para induzir descolamento induzida por apoptose, apesar de defeito na activação da caspase e prejudica seu crescimento independente de ancoragem. Por outro lado, a regulação negativa de Bit1 estável nestas células aumenta significativamente a resistência as suas anoikis e crescimento independente de ancoragem. As células knockdown bit1 exibem aumentou significativamente tumorigenecity

in vivo

. Foi previamente mostrado que a co-repressor TLE1 nuclear é um oncogene putativo no cancro do pulmão, e mostramos aqui que bloqueia TLE1 Bit1 anoikis em parte mediada por sequestrar o parceiro pró-apoptótica de Bit1, o intensificador do terminal amino de Split (AES) proteína, no núcleo. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem um papel supressor de tumor do anoikis efetoras independente de caspase Bit1 no câncer de pulmão. Consistente com o seu papel como um supressor tumoral, descobrimos que Bit1 é regulada negativamente no cancro do pulmão de células não pequenas humano tecidos (NSCLC)

Citation:. Yao X, Jennings S, Irlanda SK, Pham T, Temple B, Davis, M. et ai. (2014) O anoikis Effector Bit1 Exibe Tumor supressores da função em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 9 (7): e101564. doi: 10.1371 /journal.pone.0101564

Autor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos da América

Recebido: 20 Março, 2014; Aceito: 08 de junho de 2014; Publicação: 08 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e suas informações dos arquivos de apoio

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC) Inicie Grant (HB), NIH RCMI G12RR026250-03 Grant (para Xavier University of Losuiana) e NIH 1R15CA158677-01A1 Grant (HB). Esses financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

um factor decisivo para um fenótipo epitelial maligna é a independência de ancoragem. A perda de dependência de ancoragem para a matriz extracelular por células malignas lhes permite crescer na ausência de adesão da célula, para se propagar numa matriz tridimensional, de invadir tecidos adjacentes e metástases para órgãos distantes [1], [2]. Os mecanismos moleculares e vias celulares subjacentes ancoragem-independência das células cancerosas têm sido extensivamente estudadas [3], e a maioria dessas alterações moleculares conferem as células malignas a capacidade de iludir o programa anoikis que está em vigor em células normais. Considerando que a repartição do controle anoikis contribui para o crescimento e malignidade de muitos tumores sólidos, restaurando a sensibilidade anoikis representa uma estratégia terapêutica importante na redução da agressividade de tumores e metástases. Assim, a identificação de novos alvos moleculares da via de morte celular mediada por anoikis tem implicações terapêuticas significativas.

Duas vias apoptóticas, o mitocondrial (intrínseco) e de receptor de morte celular (extrínseca), têm sido mostrados para regular a anoikis processo. Após a perda induzida pelo desprendimento de sobrevivência mediada por integrina de sinalização, o circuito apoptótico intrínseca é desencadeada através da activação dos membros pró-apoptóticos da família Bcl de proteínas (incluindo a Bax, Bad, Bid e BIM). Estas proteínas desencadear a permeabilização da membrana mitocondrial externa que conduz à libertação de citocromo c citossólico e activação de caspases a jusante das enzimas [5], [6]. Esta ansa de activação da caspase-dependente mitocondrial, o qual pode ser ainda mais amplificado por regulação negativa da expressão dos membros anti-apoptóticos Bcl familiares (tais como Bcl-2 e Bcl-XL), que funcionam em guardar a integridade mitocondrial [7], pode em última análise, levar a fragmentação do ADN e morte celular. O receptor de morte (extrínseca) via depende da ligação de ligandos de morte (Fas ou TRAIL) que utiliza receptor de morte e a formação de um indutor de morte complexo de sinalização (DISCO) na activação de caspase-8 a jusante. Esta morte mediada pelo receptor de caspase 8 de activação pode efectuar a desestabilização da membrana mitocondrial conduzindo a apoptose [8], [9]. Embora a convergência e crosstalk entre vias apoptóticas extrínsecos e intrínsecos existem em vários níveis, ambas as vias contar com alça de ativação caspase para efetuar a morte celular. No entanto, as evidências surgiram indicando a existência de mecanismos independentes de caspase em anoikis [10],. Em particular, a inibição da activação de caspase, quer através de sobre-expressão de Bcl-2 ou o tratamento com inibidores da caspase globais é incapaz de bloquear anoikis basais em células tumorais como determinado por análise de escada de ADN [10]. O modo alternativo independente de caspase-anoikis é um importante alvo terapêutico em tumores que exibem uma via de apoptose dependente da caspase-deficientes.

Ruoslahti e colegas identificaram recentemente uma nova via apoptótica dependente de integrina, que é mediada pela mitocondrial bit1 (Bcl2, inibidor de transcrição 1) proteína [11]. Após a perda de fixação celular mediada pela integrina, Bit1 é libertado para o citoplasma, forma um complexo com o coregulator transcricional AES, e, subsequentemente, induz um modo independente de caspase da apoptose. Enquanto vários factores anti-apoptóticos conhecidos, tais como Bcl-2, Bcl-XL, Akt são ineficazes no bloqueio da apoptose Bit1, ligação mediada por integrina é o único tratamento anti-apoptótica que podem suprimir a função da apoptose Bit1 [11]. Considerando-se que a adesão celular mediada pela integrina, particularmente a integrina α5β1, é o único tratamento a montante, que pode bloquear a via de apoptose Bit1, Bit1 pode desempenhar um papel importante na anoikis como uma guarda de dependência de ancoragem [11] – [15]. Com base na incapacidade dos inibidores de caspase para inibir Bit1 apoptose e a ausência de activação da caspase em células transfectadas Bit1, a via Bit1 pode representar um dos mecanismos anoikis independente de caspase em células malignas [11]. Assim, a via apoptótica Bit1 parece ser um alvo terapêutico atractivo para contornar a resistência anoikis particularmente em células tumorais que apresentam deficiente actividade de caspase. Utilização de Bit1 como um alvo terapêutico requer um exame detalhado do mecanismo da sua função de apoptose, o que temos encontrado para ser dependente, em parte, desligando um programa de transcrição de genes que promovem a sobrevivência controlada pelo groucho transcricional corepressor TLE1 [15].

O papel de Bit1 em anoikis foi demonstrada em várias linhas de células transformadas. Através de métodos de manipulação genética, que mostraram que a expressão exógena de blocos Bit1 mitocondriais a resistência anoikis de várias linhas de células de tumor, enquanto a regulação negativa da expressão endógena Bit1 confunde ainda mais a sua insensibilidade anoikis [11] – [15]. Uma vez que a aquisição de resistência anoikis é um determinante importante da transformação neoplásica e potencial metastático [1], [2], a supressão da Bit1 anoikis via em células malignas pode contribuir para a progressão do cancro, particularmente na aquisição de comportamento tumorigénico e metastático avançado. De facto, os nossos estudos anteriores demonstraram que Bit1 pode funcionar como um supressor de metástase

In vivo

[14]. Embora o mecanismo exacto subjacente ao seu efeito inibidor de metástases continua a ser definido, a função Bit1 anoikis indutor pode desempenhar um passo limitante da taxa no processo de metástase. Curiosamente, o papel de Bit1 na tumorigénese não foi demonstrada até à data.

Para abordar o papel da Bit1 na formação do cancro, nós temos realizada pesquisa preliminar banco de dados on-line para examinar se a expressão Bit1 é alterado em vários tipos de tumores humanos, em comparação com os seus homólogos normais. Curiosamente, verificou-se que a expressão Bit1 é selectivamente e significativamente suprimida no cancro do pulmão. Esta constatação preliminar, em conjunto com a evidência recente que ateste o TLE1 pode funcionar como um oncogene específica de pulmão [16], nos levou a investigar o significado da via apoptótica Bit1 na insensibilidade anoikis e potencial tumorigénico de não pequenas células do pulmão Carcinoma ( NSCLC), que é a forma mais agressiva do cancro do pulmão e é altamente resistente à quimioterapia, em parte devido a uma via de apoptose dependente da caspase deficiente [17], [18]. Aqui, mostramos que exógeno Bit1 contorna a resistência anoikis de células de adenocarcinoma do pulmão humano A549 por meio de activação de apoptose independente de caspase e prejudica o seu crescimento independente de ancoragem. Consistentemente, knockdown de Bit1 endógena nessas células aumenta ainda mais as suas anoikis insensibilidade e potencial de

in vitro

independente de ancoragem e potencializa seu crescimento tumorigénico

in vivo

. Em linha com a sua função supressora de tumor, expressão Bit1 foi encontrado para ser reprimidos em tumores NSCLC.

Materiais e Métodos

ensaios

cultura de células e transfecção

célula

NSCLC A549 e H460 linhas obtidas a partir de American Type Culture Collection (ATCC) foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com glutamina contendo 10% de soro fetal bovino, penicilina e estreptomicina. O controlo A549 estável derivada e Bit1 shRNA piscina de células foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo glutamina, com soro bovino fetal a 10%, penicilina, estreptomicina, e 1 ug /ml de puromicina (Invitrogen). Os ensaios de transfecção transiente foram efectuadas com lipofectamina 2000 (Invitrogen) para células A549 e reagente Lipofectamine LTX (Invitrogen) para H460 células em meio OPTI-MEM (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante, com a quantidade total de plasmídeo utilizado por transfecção normalizado com o correspondente construção de vector vazio.

reagentes químicos, anticorpos e plasmídeos

o poli (metacrilato de 2-hidroxietilo (poliHEMA) e o monoclonal de ratinho anti-FLAG, anti-AES, anti-GFP e anti anticorpos -B-actina foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO). o anticorpo anti-TLE1 policlonal foi obtido a partir de Abcam (Cambridge, MA). o inibidor de caspase zVAD-fmk e o anticorpo anti-myc foram adquiridos a partir de Calbiochem ( La Jolla, CA). O anti-caspase-3, anti-caspase-3, Bcl-2, Bcl-XL, os anticorpos Bax, Bad e anti-PARP foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). O codificação de mamífero vector de expressão para Bit1 mitocondrial foram gerados como descrito anteriormente [11]. Os plasmídeos GFP-TLE1 foram obtidos a partir de Origene (Rockville, MD). A construção que codifica o domínio de morte celular (CDD) de Bit1 foi obtido de Dr. Erkki Ruoslahti (Sanford-Burnham Medical Research Institute) e foi previamente caracterizada [19].

siRNA e shRNA transfecção

os siRNAs específicos TLE1 e os siRNAs de controlo não-alvo foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). Para as experiências de transfecção transiente, as células A549 (2 × 10

5) foram transfectadas com 25? M de cada ARNsi utilizando o reagente de transfeco Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen). 48 horas após a transfecção, as células foram colhidas e submetidas a ensaios de imunotransferência ou anoikis como descrito abaixo. Para gerar A549 estável bit1 knockdown e controle piscinas, células parentais A549 foram transfectadas com vector pRS contendo o RNA curto hairpin contra TLE1 (Origene) ou o shRNA não-segmentação mexidos (Origene). 48 h pós-transfecção, 1 ug /ml de puromicina (Invitrogen) foi adicionado ao meio para seleccionar os clones resistentes à puromicina. Os clones resistentes puromicina individuais foram testados para Bit1 regulação negativa por imunotransferência, utilizando um anticorpo específico para Bit11 [15]. Dois Bit1 shRNA clones knockdown-positivos e dois clones shRNA controle foram reunidas para posterior caracterização.

Análise de apoptose, anoikis e viabilidade celular

A apoptose foi determinada pela quantificação do nível de fragmentos nucleossomais citosólicas com a utilização de ELISA de detecção celular Morte kit (Roche Molecular Biochemicals) segundo as instruções do fabricante [14], [15]. Para avaliar a morte celular anoikis, as células foram plaqueadas em poliHEMA revestidas placas de 96 poços em meio de crescimento completo contendo 0,5% de metilcelulose a uma densidade de 1,0 x 10

4 /poço em vários pontos de tempo, como descrito anteriormente [14], [15 ]. As células separadas foram então colhidos e sujeitos ao ensaio de apoptose ELISA Cell Death. A viabilidade celular foi quantificada por coloração com azul de alarmar (Invitrogen) e subsequente leitura de fluorescência (485 nm de comprimento de onda de excitação e comprimento de onda de 520 nm de emissão) utilizando o leitor de microplacas (Biotek Instruments).

proliferação celular e ensaios de agar mole

de crescimento de Anchorage-dependente foi determinada por plaqueamento de células, num volume de 150 ul a uma densidade de 2000 células por poço em placas de 96 poços. A cada tempo indicado, o número de células metabolicamente activas foi medida com a utilização do ensaio de MTT, tal como descrito anteriormente [15]. Resumidamente, dez microlitros de reagente MTT a 5 mg /ml (Sigma) foi adicionado a cada poço numa placa de 96 poços. A placa foi então incubada a 37 ° C, 5% de CO2 durante 3 h. Em seguida, o precipitado de MTT resultante foi dissolvido em 100 ul de uma solução 50% de DMSO% de MeOH-50 e submetido a uma leitura de absorvância de 550 nm através de um leitor de microplacas (Biotek Instruments). O crescimento independente de ancoragem de células foi assesed utilizando o formato de placas de 96 poços [15]. Como descrito anteriormente, 5000 células em solução de agar a 0,3% foi plaqueada em poços pré-revestidas com 0,6% de agar em meio de cultura. O crescimento das colónias resultantes foi quantificado por coloração com azul de alarmar (Invitrogen) e leitura da fluorescência a 485 nm de comprimento de onda de excitação e 520 nm de comprimento de onda de emissão, com um leitor de placas de microplacas.

Caspase ensaio de activação

Caspase -3 atividade foi determinada fluorimetricamente utilizando o substrato Ac-DEVD-AFC substrato e foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Roche Applied Science).

preparação de proteínas e ensaios de transferência western

preparação de proteína e oeste blot foram realizados tal como descrito anteriormente [14], [15]. Resumidamente, as células foram colhidas 24-48 h após a transfecção com várias construções ou ARNsi pela adição de NP-40 tampão de lise arrefecido em gelo (1% de NP-40; 20 mM de Tris-HCl [pH 7,4]; NaCl 150 mM; glicerol a 10% , 2 mM de vanadato de sódio, fluoreto de henylmethylsulfonyl 1 mM; 10 ug /ml de leupeptina e 5 ug /mL de aprotinina) e incubou-se a 4 ° C durante 20 min. Para análise de imunomarcação, quantidades iguais de proteínas foram resolvidas em géis 4-20% de gradiente de Tris-glicina (Invitrogen) e transferidas electroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose. As membranas foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, seguido de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano. As membranas foram reveladas utilizando o sistema de detecção ECL.

subcelular fraccionamento

fraccionamento subcelular foi efectuada como descrito anteriormente [15]. células Resumidamente, transfectadas cultivadas em condições montado ou desmontado nos tempos indicados foram colhidas lavadas uma vez com PBS, ressuspensas em 1 ml de tampão mitocondrial isotónica (manitol 250 mM, sacarose 70 mM, EDTA 1 mM, HEPES 10 mM [pH 7,5]) , e homogeneizados com 40 golpes num homogeneizador Dounce. Os lisados ​​foram centrifugados a 500 x g durante 5 minutos para eliminar os núcleos e as células intactas. O sobrenadante foi ainda centrifugado a 10000 × g durante 30 min a 4 ° C para isolar o sedimento enriquecido mitocondrial. O sobrenadante citosólico resultante foi submetido a electroforese em SDS-PAGE e imunotransferência. Para a separação de citosol e fracção nuclear, o kit de isolamento nuclear NE-PER (Pierce, N ° 78833) foi usado e realizado tal como indicado pelo fabricante [15]. A concentração de proteína nas diferentes fracções foi quantificada utilizando o kit de ensaio de proteína Bio-Rad, com BSA como padrão.

Coimmunoprecitation ensaio

ensaio

Coimmunoprecipitation foi realizada como descrito anteriormente [15]. Resumidamente, as células transfectadas foram colhidas por lavagem uma vez com PBS e ressuspendeu-se em gelo-frio de Nonidet P-40 tampão de lise (1% de Nonidet P-40, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, glicerol a 10%, 2 mm vanadato de sódio, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 10 ug /ml de leupeptina, e 5 ug /ml de aprotinina) seguida por uma incubação de 20 min a 4 ° C. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação. Marcada com myc Bit1 foi imunoprecipitada com conjugado anti-Myc-agarose (Abcam) enquanto TLE1 GFP foi imunoprecipitada com anticorpo anti-GFP-agarose (Médico e Biological Laboratories). O imunoprecipitado foi cuidadosamente lavado com tampão de lise. As proteínas ligadas foram resolvidas por SDS-PAGE e Western blot foi realizada utilizando o anticorpo correspondente.

In vivo

tumorigênese ensaio

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pela Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais de laboratório de Xavier University of Louisiana Institutional animal Care e Use Committee (IACUC, o número de homologação 060911-001BI). ratinhos atímicos fêmea com oito semanas de idade nu (BALB /c) foram usadas para os ensaios de tumorigénese. Os A549 derivada de controle células shRNA e Bit1 shRNA (1,0 × 10

6) foram injectados por via subcutânea. Os tamanhos de tumor foram medidos com um compasso de calibre periodicamente, e o volume do tumor foi determinado com a fórmula (d1 d2 ×

2) /2, em que D1 representa o diâmetro maior e o diâmetro menor d2. Os ratos foram sacrificados quando os tumores primários atingiram 2 cm de diâmetro.

In Situ Detecção de apoptose

A detecção de células em apoptose no controle shRNA e bit1 secções de tumor shRNA foi realizada utilizando o colorimétrico TUNEL Sistema deadend ( Promega), seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, os cortes foram desparafinados, re-hidratados, e incubadas com Proteinase K durante 20 minutos a temperatura ambiente. Após lavagem com PBS, as secções foram incubadas com uma concentração de trabalho de terminal recombinante desoxinucleotidil-transferase (IDTE) a 37 ° C durante 1 h. As secções foram lavadas com o PBS e mergulhado em peróxido de hidrogénio a 0,3% para bloquear a actividade da peroxidase endógena. As secções foram depois lavadas com PBS e incubadas com a solução de estreptavidina-HRP. O sinal de castanho escuro resultante foi visualizada com diaminobenzidina (DAB) como cromógeno.

tumor de pulmão humano análise de arranjo de tecido

tecidos tumorais humanas lâminas de matriz contendo carcinomas de células escamosas, o adenocarcinoma, o carcinoma de células maiores, e tecidos pulmonares normais correspondentes foram obtidos a partir de US Biomax, Inc. (Rockville, MD). O procedimento de imunohistoquímica foi realizada por Biomax Inc. em duas lâminas de tissue microarray. Tal como descrito anteriormente [14], [15], as lâminas de matriz de tecido foram deparaffinised, hidratado e submetida a recuperação de antigénios. As lâminas foram então incubadas em soro normal de cavalo a 2,5% durante 30 min à temperatura ambiente, seguido de incubação com o anticorpo primário (diluição 1:100) durante 1 h à temperatura ambiente. O anticorpo de coelho purificado por afinidade anti-Bit1 (HPA012897) que foi previamente testados quanto à sua especificidade [14], [15] foi adquirido a partir de Sigma. Soro de coelho normal foi usado como anticorpo de controlo negativo para substituir o anticorpo primário na lâmina de controlo, com 1 h de incubação. lâminas de matriz de tecido foram então lavadas e incubadas com o reagente ImmPRESS (Vector Laboratories) seguido por tratamento com solução de substrato de peroxidase DAB (Dako Cytomation). As lâminas foram marcou para a média intensidade de coloração Bit1 por dois investigadores sem conhecimento do estado patológico das amostras. A coloração média foi classificada como 0, nenhuma coloração; 1, ligeira coloração; 2, coloração moderada; e 3, coloração forte.

A análise estatística

Os dados são apresentados como médias (± S.E..). Para manchas e ensaios de anoikis ocidental, as experiências foram realizadas pelo menos três vezes com triplicados. As diferenças estatísticas entre grupos foram estabelecidos em um valor P 0,05 pelo teste t de Student de duas caudas. Para a análise de matriz de tecido de tumor de pulmão, uma ANOVA de uma via com o teste subsequente post hoc utilizando o teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer foi utilizado para comparar a intensidade de coloração média de cada tipo de caso [14], [15]. Todos os cálculos foram feitos usando o software estatístico NCSS (NCSS, Kasville, UT)

Resultados

The Resistance anoikis de células A549 está associada à falta de significativa Caspase Atividade

NSCLC As células são notoriamente conhecidas como sendo resistentes a várias formas de estímulos apoptóticos incluindo a estimulação de receptor de morte, fármacos citotóxicos, e radiação. A capacidade de NSCLC para evadir a apoptose tem sido atribuído em parte a uma caspase-independente máquinas ineficiente [17], [18]. No entanto, os mecanismos de como NSCLC blocos anoikis não foram minuciosamente examinados. Para abordar a utilidade potencial de mecanismos independente de caspase em contornar a resistência anoikis de células NSCLC, primeiro examinaram a contribuição da via da caspase em anoikis. Consistente com relatórios anteriores [20], a linha celular A549 NSCLC mostraram níveis muito baixos de apoptose quando cultivadas em suspensão (Figura 1A). Estaurosporina (STS), um potente inibidor de quinase, induziu significativamente a apoptose nestas células (Figura 1A). Para abordar o papel da via dependente de caspase no bloqueio anoikis em células A549, examinamos a liberação citosólica de proteína mitocondrial citocromo c (um fator crucial na ativação dos atuadores de caspases a jusante) durante o desapego. Em contraste com as células tratadas STS que mostraram quantidades substanciais de citocromo C no citoplasma, as células isoladas exibiram apenas quantidades vestigiais de citocromo c na fracção citoplasmática (Figura 1B). A seguir, monitorizada a activação do executor a jusante ou caspase 3 através da clivagem do fluorescente de caspase-3 substrato (Figura 1C) e o processamento da pró-caspase 3 através de imunotransferência (Figura 1D). De acordo com a falta de libertação citosólica significativa de citocromo c, as células destacadas A549 não mostraram substancial activação da caspase 3 (Figura 1C) e exibido sem processamento de pró-caspase 3 (Figura 1D). O objectivo final da maquinaria de caspase é para clivar o poli nuclear (ADP-ribose) polimerase (PARP) proteína [5], [6]. Como mostrado na Fig. 1E, PARP permaneceu relativamente intacto, na sua forma nativa 116 kDa nas células A549 isolada (Figura 1e). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a resistência de células A549 anoikis está associada a um citocromo c /via de morte celular dependente de caspase ineficiente.

. As células foram cultivadas a ser ligado (A) ou separado da ECM durante 24 horas (D24) e 48 horas (D48) e foram colhidas para análise de apoptose utilizando a morte celular Elisa ELISA. Em paralelo, as células foram também tratadas com 1 uM estaurosporina (STS) durante 24 horas e submetida a morte celular Elisa ELISA. B. fracções citossólicos foram obtidos a partir de células em A e analisado para a presença de citocromo C por western blot. C. A presença de actividade da caspase-3-em, como os lisados ​​celulares a partir de células tratadas em A foi determinada pela clivagem de um substrato fluorescente Z-DEVD-AFC (DEVD). D. e E. células num foram sujeitos a Western blotting para detectar o processamento da pró-caspase 3 (D) e PARP (E). Em A e C, três experimentos independentes foram realizadas em triplicata, * indica p . 0,05, em comparação com condições associadas (teste t de Student)

bit1 prejudica a resistência anoikis de células Lung Carcinoma

Considerando a falta de activação de caspases induzida por descolamento significativa em células A549, que, em seguida, exploraram o papel da via de morte celular Bit1 na sobrevivência independente de ancoragem destas células. Nós aumentou a expressão de Bit1 mitocondrial em células A549 através de transfecção com uma construção Bit1 que expressa a proteína Bit1 exclusivamente na mitocôndria (Bit1 Mito) [11], [15], e testada a capacidade das células para sobreviver na ausência de fixação a partir de ECM. O Mito Bit1 e as células de controlo transfectadas tinha o mesmo nível de apoptose espontânea quando cultivada ligado a um prato de cultura (Figura 2A). Em contraste marcante, as células de mito transfectadas bit1 exibiram um aumento significativo da apoptose do que as células controle sobre o desapego. Resultados semelhantes foram encontrados quando Bit1 mito foi introduzido na linha celular NSCLC H460 humano (figura S1). Para abordar a especificidade da indução anoikis por Bit1 Mito, nós alvo expressão Bit1 no citoplasma das células A549 com o uso de uma construção de Bit1 que contém uma marca na região N-terminal da proteína Bit1 (Bit1 cito) [11] , [15]. expressão exógena de citoplasmática Bit1 localizada (Bit1 cito) em A549 (Figura 2B) e células H460 (Figura S2) desencadeada apoptose. O domínio de morte celular (CDD) de Bit1 foi recentemente mapeada nos aminoácidos N-terminais 62 e foi demonstrado ser eficaz na indução de apoptose em células de cancro da mama [19]. Introdução do péptido CDD também resultou em apoptose em A549 (Figura 2C) e células H460 (Figura S3). A caracterização adicional do Bit1 anoikis via em células A549 confirmou que Bit1 desencadeada a morte celular independente de caspases. Primeiro, encontramos nenhum processamento significativa da caspase carrasco 3 em células Bit1 transfectadas (Figura 2D). Em segundo lugar, o substrato de caspases a jusante nuclear, PARP, permaneceu intacta (Figura 2D). Em terceiro lugar, o inibidor da pan-caspase z-VAD-FMK foi ineficaz no bloqueio anoikis-induzidas Bit1 (Figura 2E). Consistente com a falta de efeito na activação da caspase Bit1, a expressão da família de reguladores de apoptose que controlam a via de apoptose mitocondrial dependente de caspase não foi alterada pela Bit1 (Figura 2D). Em particular, os níveis de estado estacionário das Bcl-2 e Bcl-XL proteínas anti-apoptóticas bem como a Bax pró-apoptótica e proteínas Bad permaneceu inalterada por Bit1 ectópica em ambas as condições conectados e desconectados. Estes resultados indicam que Bit1 pode contornar a resistência anoikis de células de cancro do pulmão através da indução de um circuito apoptótico independente de caspases.

. As células foram transfectadas com o mitocondrial C-terminalmente marcada com myc localizada Bit1 (Bit1 Mito) ou a construção de vector vazio. 24 h pós-transfecção, as células foram cultivadas a ser ligado ou separado da ECM. Após 48 h em cultura, as células foram colhidas e analisadas quanto a apoptose através da medição da quantidade de fragmentos de ADN histona (morte celular ELISA). B e C. As células foram transfectadas com o N-terminal etiquetado myc citoplasmática localizada Bit1 (Bit1 cito) (B), Bit1 domínio de morte celular (CDD) (C), ou construção de vector e 48 h mais tarde, as células foram sujeitas a morte celular ELISA. D. vector ou Bit1 Mito células transfectadas foram cultivadas a ser ligado (A) ou individual (D) a partir da ECM durante os tempos indicados. As células foram então colhidas e submetidas a transferência de Western contra anticorpos específicos para a caspase-3, a PARP, Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad, myc, e B-actina. E. Bit1 Mito células transfectadas foram cultivadas em condições montado ou desmontado na presença de Z-VAD-fmk (50 uM) ou DMSO durante 48 h. As células foram então recolhidas e sujeitas to Cell ELISA morte. Em A, B, e C, três experiências independentes foram realizados em triplicado, * indica P . 0,05 pelo teste t de Student

Para confirmar adicionalmente o papel de Bit1 como um efector anoikis no cancro do pulmão, examinamos se knockdown de expressão Bit1 endógena terá impacto sobre o anoikis insensibilidade de células A549. Nós fundamentado que as células A549 vai sofrer anoikis sobre a cultura prolongada em suspensão e se ablação da via apoptótica Bit1 pode fornecer proteção anoikis. Com efeito, após uma cultura de 72 h prolongada em suspensão, as células A549, eventualmente, separadas mostraram evidência de apoptose (Figura 3A). A indução anoikis observada foi associado com nenhum processamento significativo de caspase 3 e PARP (Figura 3B), indicando que o mecanismo (s) de morte celular alternativa que não seja a via dependente de caspase está envolvido. Em seguida, a expressão regulada negativamente Bit1 em células A549 através de RNAs curtos interferente (siRNAs) e submeteu as Bit1 ARNsi de controlo e tratados células para ensaio anoikis. Dois ARNsi específicos Bit1 # 1 e # 2 mostrou uma regulação negativa significativa 70-80% da expressão Bit1 (Figura 3C). Em comparação com as células de ARNsi de controlo ou tratados parentais A549, as células transfectadas exibiram Bit1 siARN diminuiu a apoptose após 72 h uma cultura em suspensão (Figura 3D). Para complementar estes resultados, foram também gerados dois clones estáveis ​​Bit1 knockdown A549 derivados, nomeadamente Bit1 shRNA1 e Bit1 shRNA2, com cada clone expressando uma distinta Bit1 shRNA que tem como alvo uma sequência diferente na região não codificadora 3 ‘do ARNm Bit1. Em paralelo, de controlo estável shRNA clones 1 e 2 foram gerados a partir da nontargeting shRNAs scrambled. Como se mostra na Figura 3E, o estável Bit1 shRNA1 shRNA2 e mostraram uma redução na expressão Bit1 por 70% e 80% respectivamente, como comparado com o controlo clones shRNA. O estábulo Bit1 shRNA1 e shRNA2 foram então combinados para gerar a piscina Bit1 shRNA enquanto o controle shRNA clones 1 e 2 compreendido o controle shRNA piscina (Figura 3E). Consistente com os dados derivados a partir de estudos de siRNA, a piscina Bit1 shRNA exibido um nível significativamente reduzido de apoptose do que o controlo shRNA piscina na sequência de um 72 h de cultura em suspensão (Figura 3F). Consistente com a falta de efeito do Bit1 ectópica na via mitocondrial (Figura 2D), a maior resistência anoikis observada em células knockdown Bit1 não foi associada com as alterações nos níveis da família Bcl-2 de reguladores de apoptose (Figura S4) de expressão. Estes resultados, em conjunto com os nossos resultados indicam que exógena mitocondrial Bit1 pode induzir anoikis, fornecem fortes evidências de que a via apoptótica Bit1 representa um importante mecanismo anoikis independente de caspase em células de câncer de pulmão.

a. e B. As células foram cultivadas em anexo (A) ou condições isolada (D) para os tempos indicados e, em seguida, submetido a submetida a morte celular ELISA (A) ou Western blot (B) com anticorpos contra a caspase-3, PARP, e B actina. Em A, três experiências independentes foram realizados em triplicado; *, P 0,05, em comparação com as células aderentes (teste t de Student). C. e D. As células foram transfectadas com ARNsi específicos de controle ou Bit1, e 48 h mais tarde, as células foram sujeitas a imunotransf erência (C) com anticorpos contra Bit1 e B-actina para confirmar o knockdown de expressão Bit1.