Abstract
Fundo
Apenas um subconjunto de ressecado radicalmente adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC ) pacientes beneficiar de quimioterapia, e identificação de fatores prognósticos se justifica. Recentemente miRNAs emergiu como biomarcadores de diagnóstico e alvos terapêuticos inovadores, enquanto matrizes de alto rendimento estão abrindo novas oportunidades para avaliar se eles podem prever o resultado clínico. O presente estudo avaliou se a expressão miRNA abrangente Profiling correlacionada com sobrevida global (OS) em pacientes PDAC ressecados.
Metodologia /principais conclusões
de alta resolução perfis de miRNA foram obtidos com o Toray
3D-Gene
™ -miRNA-chip, a detecção de mais de 1200 miRNAs humanos. RNA foi isolado com sucesso de tumores primários embebidos em parafina de 19 dos 26 stage-pT3N1 pacientes homogeneamente tratados (gemcitabina adjuvante 1000 mg /m
2 /dia, dias-1/8/15, a cada 28 dias), cuidadosamente seleccionados de acordo para o seu resultado (OS 12 (N = 13) vs. OS 30 meses (N = 6), ou seja, a curto /longo OS). Altamente estatísticas rigorosas incluído t-teste, matriz de distância com a correlação de Spearman-classificado, e abordagens iterativos. A análise hierárquica sem supervisão revelou que PDACs agrupados de acordo com sua curta longa OS classificação /, enquanto o algoritmo ALÍVIO seleção de recurso identificou o top 4 discriminar miRNAs entre os dois grupos. Estes miARN alvo mais de 1500, incluindo as transcrições 169 alvo de duas ou mais. MiR-211 emergiu como a melhor discriminar miRNA, com expressão significativamente maior no longo vs. pacientes de curto OS. A expressão deste miARN foi subsequentemente avaliada por PCR quantitativa em uma coorte independente de PDACs laser de microdissecado dos 60 pacientes ressecados tratados com o mesmo regime de gemcitabina. Os pacientes com baixa expressão de miR-211 de acordo com o valor mediano teve um OS mediana significativamente menor (14,8, IC95% = 13,1-16,5, versus 25,7 meses, 95% CI = 16,2-35,1, log-rank-P = 0,004). A análise multivariada mostrou que a baixa expressão de miR-211 foi um fator independente de mau prognóstico (hazard ratio 2.3, P = 0,03) após o ajuste para todos os fatores que influenciam o resultado.
Conclusões /Significado
Através microarrays análise abrangente e validação de PCR foram identificados miR-211 como fator prognóstico no PDAC ressecado. Estes resultados rápidos estudos prospectivos e pesquisas sobre o papel biológico de miR-211 em PDAC
Citation:. Giovannetti E, van der Velde A, Funel N, Vasile E, Perrone V, Leon LG, et al. (2012) High-throughput MicroRNA (miRNAs) Arrays Desvendar o papel prognóstico de miR-211 no cancro do pâncreas. PLoS ONE 7 (11): e49145. doi: 10.1371 /journal.pone.0049145
editor: Nathan A. Ellis, da Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América
Recebido: 03 de julho de 2012; Aceito: 04 de outubro de 2012; Publicação: 14 de novembro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Giovannetti et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes. Este trabalho foi parcialmente apoiado por subsídios da Holanda Organização de Investigação Científica, concessão VENI (número do projeto 91.611.046 (Elisa Giovannetti)) e Stimuleringfonds Open Access (Elisa Giovannetti), CCA-VICI Foundation subvenção (Elisa Giovannetti, Amir Avan, Godefridus J Peters) , AIRC Marie Curie Internacional Fellowship (Elisa Giovannetti) e Ministro italiano da Investigação, PRIN-2009 (Elisa Giovannetti, Niccola Funel, Ugo Boggi). Toray Industries, Inc. é um financiador, devido ao emprego de Hiroko Sudo, que forneceu apoio técnico para a realização desse projeto, mas não tinha um papel no desenho do estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes. Neste estudo, os autores usam produtos da Toray Industries, Inc., 3D-GeneTM “para o microarray miRNA, mas isso não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS ONE sobre a partilha de dados e materiais.
Introdução
Com uma taxa de sobrevida em 5 anos inferior a 5%, pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC), incluindo mais de 90% dos cânceres de pâncreas, é o mais letal entre os principais tumores sólidos [1]. Nos últimos anos, tem havido avanços importantes na compreensão da biologia molecular do cancro do pâncreas, bem como no diagnóstico e estadiamento. No entanto, o progresso mínimo foi alcançado na prevenção, diagnóstico precoce, tratamento e resultados [2].
A ressecção cirúrgica é a única modalidade curativa para PDAC, mas apenas 15-20% dos pacientes têm doença ressecável no momento de diagnóstico. No entanto, o prognóstico dos pacientes após ressecção completa é pobre, com uma taxa de 3 anos de sobrevida livre de doença (DFS) a 27% (intervalo de confiança de 95% (CI): 23-32%) e sobrevida global (SG) mediana de 15 -19 meses [3].
Apenas um subconjunto de pacientes PDAC ressecados radicalmente beneficiar de quimioterapia e tratamentos adjuvantes podem ter efeitos tóxicos substanciais [4]. Portanto, novos biomarcadores de sensibilidade à terapia adjuvante são urgentemente garantido, a fim de individualizar a conduta clínica e melhorar os resultados terapêuticos [5].
Amplos estudos têm caracterizado as redes genéticas e transcriptômica complexas alterações subjacentes ao desenvolvimento e progressão da PDAC [6]. A recente descoberta de microRNAs (miRNAs) forneceu explicações adicionais potencialmente explicar a lacuna que existe entre o genótipo e fenótipo tumoral
Mirna são uma classe de pequenos codificação não-RNAs evolutivamente conservadas [19] -. [23 nucleotídeos] que foram encontrados em células animais e vegetais. A partir de hoje, 1921 únicas miRNAs humanos maduros estão listados no banco de dados miRBase (Release 18, novembro de 2011) [7]. microRNA genes são transcritos como transcrições não-codificantes, e são processados através de uma série de passos sequenciais envolvendo as enzimas de ARNase III Dicer, Drosha e. Os microARNs processados são finalmente incorporado no complexo de silenciamento (RISC) para dirigir este complexo para sub-regular a expressão de genes através de ligação à 3’UTR do ARNm-alvo induzido por ARN. Planta e alguns miRNAs de animais formam pares de bases perfeitas com seus mRNAs alvo, resultando em sua degradação. No entanto, a maioria dos miRNAs humanos se ligam a seus 3’UTRs alvo com complementaridades imperfeitos e, portanto, induzir a repressão translacional [8].
O papel regulador fundamental de cada miRNA no controle da expressão de múltiplos transcritos do gene oferece uma oportunidade única de identificar miRNAs críticos biomarcadores como informativos para a detecção, diagnóstico e prognóstico de tumores que resultam da desregulamentação dos genes múltiplos [9]. Este mecanismo biológico subjacente era provavelmente a razão pela qual os padrões de 217 miRNAs expressão foram encontrados para classificar os tipos de cancro com maior precisão do que a informação com base no perfil de ~16000 mRNAs [10] expressão.
O papel dos miRNAs no controlo de proliferação /diferenciação e apoptose, e a sua expressão aberrante em muitos tumores, indicou que eles podem funcionar como supressores de tumor e oncogenes, sugerindo a sua utilização para fins de diagnóstico e terapêuticos. Além disso, miRNAs selecionados podem influenciar o comportamento maligno do tumor e resposta à quimioterapia [11].
Os nossos estudos anteriores sobre miR-21 mostraram que ambos os pacientes caucasianos e asiáticos abrigar alta expressão desse miRNA em seus espécimes PDAC teve um significativamente menor sobrevivência [12], [13]. Este miARN tem sido referido como um “oncomir” (isto é, um miARN com propriedades oncogénicas), porque é quase omnipresente e sobre-expressa em tumores humanos. Recentes
in vivo
estudos em miR-21 modelo de camundongos com superexpressão estabelecida por tecnologias Cre /Tet-off, demonstrou o seu papel oncogênico, mostrando seu impacto significativo na iniciação do tumor, manutenção, sobrevivência e invasão [14].
no entanto, de alto rendimento inovações tecnológicas na detecção de centenas de microRNAs proporcionar novas formas eficazes para desvendar o papel de outros miRNAs-chave que regulam vários genes que podem explicar por que pacientes com características clinicopatológicas semelhantes podem ter variações consideráveis nos resultados clínicos. Portanto, no presente estudo avaliamos se a expressão miRNA abrangente de perfil, usando um chip miRNA detecção de mais de 1200 tipos de miRNA humana, podem distinguir entre os pacientes PDAC com muito curto OS comparação com sobreviventes a longo prazo.
particular, foram selecionados cuidadosamente 26 pacientes PDAC com características clinicopatológicas homogéneos submetidos à ressecção com intenção curativa e foram tratados com três ciclos de regime de gemcitabina adjuvante padrão. Metade desses pacientes teve um prognóstico sombrio, morrendo dentro de 1 ano do diagnóstico, enquanto que os outros 13 pacientes sobreviveram mais de 30 meses. A análise microarray miRNA foi realizada em 19 amostras que passaram o critério de qualidade RNA, incluindo 13 pacientes com sobrevida curta e 6 pacientes com sobrevivência a longo. Dado que o carácter expressão de miR-211 emergiu como o marcador mais preditiva para o resultado do tratamento desses pacientes, uma análise mais aprofundada de miR-211 de expressão foi realizada em um segundo coorte de 60 pacientes, todos tratados com a mesma terapia adjuvante. Este conjunto independente confirmou a associação significativa de miR-211 status de expressão tanto com OS e DFS.
Métodos
Os pacientes
Os pacientes que foram submetidos a ressecção cirúrgica radical com intenção curativa (pancreatico -duodenectomy, pancreatectomia total e pancreatectomia distal) do Departamento de Cirurgia Geral e Transplante do Hospital Universitário de Pisa (Pisa, Itália), entre 2000 e 2010 foram revisadas retrospectivamente usando registros médicos eletrônicos. Entre eles, para o de alta resolução miRNA perfil de expressão foram selecionados 26 pacientes com resultados semelhantes patológicas, características clínicas e tratamento, mas uma variação considerável nos resultados clínicos. Em particular, metade desses pacientes teve um extremamente mau prognóstico, morrendo dentro de 1 ano de diagnóstico e foram classificados como “short-OS”, enquanto que os outros 13 pacientes sobreviveram mais de 30 meses, e foram classificados como “long-OS”. As características destes 2 grupos estão apresentados na Tabela 1.
A coorte de validação era composta por outros 60 pacientes PDAC ressecados radicalmente diagnosticados e tratados durante o mesmo período, com as suas características, também descritas na Tabela 1 . Todos estes pacientes foram submetidos a tratamento adjuvante com gemcitabina, como descrito anteriormente [15].
Ética
Todos os pacientes deram o seu consentimento informado por escrito para a recolha e análise de amostras, bem como o estudo tem recebeu aprovação do comitê de Ética do Hospital Universitário de Pisa como um estudo de seguimento do protocolo de pesquisa intitulado “Farmacogenética de genes relacionados com a gemcitabina no cancro do pâncreas: correlação com a evolução clínica e tolerabilidade” [15]. Os investigadores responsáveis asseguram que este estudo foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinki, as directrizes europeias sobre boas práticas clínicas e os requisitos nacionais e regionais relevantes de autoridade.
Tecidos
formalina parafina fixo incorporado ( FFPE) seções foram cuidadosamente revistos para o diagnóstico e o conteúdo do tumor. Devido à longa experiência do nosso laboratório de patologia em grandes grupos de pacientes PDAC ressecados radicalmente, não houve dificuldade em selecionar áreas com células cancerosas morfológicas definido [16]. Os tumores foram classificados e avaliados para o estadiamento do tumor e classificação como proposto pela OMS, como relatado na Tabela 1.
extração de RNA a partir de FFPE desliza
Os cortes histológicos (10 �) foram preparados a partir de cada espécime FFPE. A parafina foi removida por tratamento com xileno e os tecidos foram lavados com etanol duas vezes para remover o xileno. Os tecidos foram então tratadas com proteinase K a 37 ° C durante a noite. A seguir à centrifugação, o sobrenadante foi processado com uma coluna de centrifugação à base de sílica (New Frontiers Research Laboratories, Toray Industries Inc., Kanagawa, Japan), a fim de se obter o ARN total purificado. Os graus de RNA cross-linking e degradação de ARN foram analisadas por electroforese utilizando um Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). As amostras que apresentaram a maior parte dos ARNs a 4000 nucleótidos, devido a reticulação, ou a maioria dos ARNs a 1.000 nucleótidos devido à degradação dos padrões de electroforese eram inadequados para a análise de miARN e assim não utilizada. Das 26 amostras estudadas, 19 amostras passaram por este critério e foram usados na criação de perfis de miRNA.
Para as 60 amostras utilizadas como um conjunto de validação independente, uma média de 5000 células neoplásicas foram então dissecados utilizando o instrumento Leica LMD6500 (Leica, Wetzlar, Alemanha), como descrito anteriormente [17]. A precisão da focagem estreita do feixe de laser resultou na captura de células individuais com elevado grau de precisão (Figura S1). O ARN foi isolado com sucesso utilizando o kit de isolamento de RECOVERALL total Ácido Nucleico (Ambion, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. rendimentos e pureza de RNA foram verificados em 260 e 280 nm com NanoDrop®-1000 Detector (NanoDrop-Technologies, Wilmington, EUA).
Mirna perfis
Nós utilizamos da Toray 3D-Gene ™ (Toray Industries, Japão) chips de microRNA humana para miRNA perfil de expressão. A reprodutibilidade e a comparabilidade Taqman RT-PCR, e os procedimentos experimentais de microarray da Toray, foram descritos anteriormente [18], [19]. Resumidamente, 500 ng de ARN total extraído da secção de FFPE foi analisado para perfis de miARN utilizando microarrays, 3D-Gene® miARN chip de oligo V.16 (Toray Industries), de acordo com o protocolo do fabricante vE1.10. O número de miARNs montados nesta micromatriz é 1.212 no total. Microarray foi digitalizada e as imagens obtidas foram numeradas usando 3D-Gene® scanner de 3000 (Toray Industries). O nível de cada miRNA expressão foi globalmente normalizados utilizando a intensidade do sinal subtraído-fundo de todo o miRNAs em cada microarray (Descrição S1).
Todos os dados de microarranjos deste estudo estão de acordo com a informação mínima sobre um experimento Microarray (Miame) e publicamente disponíveis através da Expressão gênica do NCBI Omnibus (GEO) do banco de dados (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/), sob o registro série GSE38781.
agrupamento geral
Para explorar as diferenças nos padrões de expressão entre os dois grupos de amostras, foram selecionados miRNAs que mostraram uma diferença significativa na expressão. O t-teste foi realizado sobre a grupos de curto OS longo OS e para todos os miRNAs e os que não parecem ser significativamente diferentes (p 0,05) foram filtrados. análise de agrupamento sem supervisão hierárquica foi realizada nos restantes 170 miARNs. Bicaudal correlação de Spearman classificados foi utilizado para gerar uma matriz de distâncias. Posteriormente, a matriz de distância foi usado para gerar clusters para ambos os miRNAs e amostras usando um algoritmo de agrupamento hierárquico, com base na ligação média [20] – [21].
Análise de alívio e alívio iterativa
Um algoritmo de seleção de recurso, ALÍVIO [22] – [24], foi empregado nas conjunto completo de dados, a fim de descobrir os miRNAs mais exigentes. Socorro é um algoritmo iterativo que atribui pesos aos recursos (isto é, valores de expressão de miRNA) de acordo com as distâncias entre os recursos dentro e entre os grupos. Fora dos miRs 1212, foram seleccionados 703 miRs que têm um máximo de um valor em falta ao longo de todas as amostras. O algoritmo de Socorro foi aplicada a fim de selecionar os 10 melhores miRNAs mais alto de pesagem. Em uma análise seguinte geramos 100 conjuntos aleatórios de 6 de 13 amostras classificadas como curto. Em cada conjunto aleatório de amostras, combinada com as 6 amostras classificadas como longo o algoritmo de Socorro foi aplicada para selecionar os 10 melhores miRs maior pesagem. Para todos os miRNAs que aparecem no top 10 uma pontuação foi mantido e foram selecionados os 10 melhores miRNAs mais aparecendo.
genes alvo Top miRNAs
A pesquisa foi realizada nas metas previstas para os mais exigentes miRNAs identificados em nosso estudo, usando o
TargetScan
v.6.1 interface web (https://www.targetscan.org/) e miRDB versão 4.0 (https://mirdb.org/miRDB/index.html) . Após a comparação de todos os conjuntos de dados, um subconjunto de genes que foram alvo de mais do que um miARN foi gerado.
A transcrição reversa (RT) e análise de miR-211-PCR quantitativa e miR-4321
a fim de validar os resultados da análise de microarray, avaliamos a expressão do miRNA mais exigentes, miR-211, bem como do raramente investigadas miR-4321, em uma coorte independente de pacientes PDAC. ARN (10-100 ng) foi transcrito reversamente e o cDNA resultante foi amplificado usando as mercadorias específica TaqMan® microRNA-ensaios (Applied Biosystems) para miR-211 e miR-4321. Foi realizada uma análise preliminar de 3 controles endógenos (RNU1, RNU6 e RNU43) em uma série de 10 células PDAC. Uma vez que os valores de RNU6 foram os mais próximos dos valores da média geométrica destes genes, utilizou-se este para a normalização de limpeza de toda a seguinte análise. As reacções de PCR foram realizadas no sistema de detecção de sequências 7500HT (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fabricante. Os espécimes foram amplificados em duplicado com controles não-modelo adequadas. dados de amplificação foram normalizados para RNU6 expressão. Quantificação da expressão relativa (reportado como unidades arbitrárias [u.a.]) foi realizada utilizando o método de ΔCt. dados-PCR quantitativo, mostrou um coeficiente de variabilidade Ct sempre menor do que 2% dos valores médios.
Correlação de miR-211 e miR-4321 com resultados
a comparação dos dados clínicos e os níveis de expressão de miARN foram feitas usando Pearson χ
2 e teste de Wilcoxon. A relação entre a expressão de miARN e o resultado foi avaliado por estratificação dos pacientes em relação ao valor médio de expressão (elevada versus baixa expressão). As análises das amostras foram realizadas de um modo cego em relação ao resultado clínico.
SO foi calculada a partir da data da cirurgia para a data da morte, o DFS foi definido como o tempo desde a data da cirurgia para a data da primeira recidiva ou morte. As curvas de sobrevida foram construídas pelo método de Kaplan-Meier e as diferenças foram analisadas pelo teste log-rank. As variáveis prognósticos significativos de OS e DFS na análise univariada foram incluídas na análise multivariada, utilizando o modelo de riscos proporcionais de Cox.
A relação entre miR-211 expressão e resultado também foi avaliado por meio do algoritmo de agrupamento não supervisionado k- significa. Estes dados partições algoritmo pontos em k grupos, de maneira interativa, dado um número predefinido de k clusters (k = 2, iterações máximo = 1000).
Para o χ
2 de teste Pearson, Wilcoxon-teste , as curvas de Kaplan-Meier, teste log-rank e análise multivariada, os dados foram analisados utilizando
SPSS v.17
software estatístico (SPSS, Inc, Chicago, IL), enquanto todas as outras análises computacionais foram realizados em
R
(
R v.2.10.1
, pacotes: estatísticas, dprep). Mais detalhes sobre os métodos e estatísticas são fornecidas nos dados suplementares
In vitro
estudos
As linhas celulares PDAC humanos ASPC-1, Capan-1, CFPAC-1. , HPAC, HPAF-II, MIA PaCa-2, PANC-1, PL45, e Su86.86 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), enquanto cinco culturas de células primárias (LPc006, LPc028, LPc033, LPc067, e LPc111) foram isolados a partir de pacientes no Hospital Universitário de Pisa (Pisa, Itália), como descrito anteriormente (17). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640, suplementado com FBS a 10%, e 1% de penicilina (50 UI /ml) e estreptomicina (50 ug /mL) (Gibco, Gaithersburg, MD). As células foram mantidas a 37 ° C sob uma atmosfera de 5% de CO
2 em 75 cm
2 frascos de cultura de tecidos (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha) e colhidas com tripsina-EDTA na sua fase de crescimento exponencial . O ARN foi extraído utilizando um protocolo de Trizol-clorofórmio (Sigma, St. Louis, MO). rendimentos e pureza de ARN foram verificadas por medição da densidade óptica a 260/280 nm com um espectrofotómetro Nanodrop®. A expressão basal de miR-211 foi avaliada por qRT-PCR, como descrito acima para os tecidos PDAC. dados de amplificação foram normalizadas para expressão RNU6, e quantificação da expressão relativa foi realizada utilizando o método de ΔCt.
O efeito de miR-211 em quimiossensibilidade foi avaliada na MIA PaCa-2 e células LPc028, por transfecção dessas células com os precursores e os oligonucleótidos anti-sentido (pré-miR-211 e miR-anti-211) adquirido a Applied Biosystems Ambion-(ensaio ID MC10168, e MH10168, respectivamente) a 30 nM de concentração final. As células foram plaqueadas a 5000 células /poço em 200 ul de meio RPMI com 10% de FBS e 1% de antibióticos. Após 24 horas as células foram expostas a 0,9 oligofectamine ul (Invitrogen, Paisley, UK) em meio isento de soro, misturou-se durante 10 minutos à temperatura ambiente, seguido pela adição de 0,3 ul de 6,25 uM de miR-211 percursor ou inibidor. As células foram também incubadas com controlos negativos miARN (Ambion). Após exposição durante a noite, o meio foi removido dos poços e substituído com meio RPMI com 10% de FBS, sem antibióticos. Em seguida, as células foram deixadas crescer durante 48 horas adicionais em meio isento de fármaco ou tratadas com 1 uM de gemcitabina, como descrito acima. poços de controlo adicionais foram utilizados para extração de RNA, para avaliar a eficiência de transfecção.
Finalmente, em análises funcionais preliminares sobre potenciais alvos de miR-211 previstos pela
TargetScan
, selecionamos a ribonucleótido-redutase subunidade 2 (RRM2), que é um alvo celular importante de gemcitabina [25]. Portanto, foi realizada uma análise de RT-PCR da expressão de RRM2 nas células transfectadas com pré-miR-211 e miR-anti-211, como descrito acima. Estas reacções de PCR foram realizadas com os iniciadores e sonda o produto de expressão do gene da Applied Biosystems Ensaio-on-Demand Hs0035724, usando um método validado anteriormente [15]. As amplificações foram normalizadas para GAPDH, e a quantificação da expressão de genes foi realizada utilizando o cálculo ΔΔCT, onde TC é o ciclo de limiar; a quantidade de gene alvo, normalizadas para GAPDH e em relação às células de controlo não tratadas () de calibrador, é dada como 2
-ΔΔCT. Os espécimes foram amplificados em triplicado com controles não-modelo adequadas, e do coeficiente de variação foi de 1% de todas as repetições
Resultados
Características dos pacientes
Tabela. 1 resume as características clinicopatológicas de todos os pacientes PDAC avaliados no presente estudo. A maioria dos pacientes tinha estágio-T3 grau 2 tumores, com linfonodos positivos, e invasão perineural.
A análise microarray miRNA foi realizada em 19 amostras que passaram o critério de qualidade RNA. Estes pacientes incluídos 13 pacientes com OS inferior a 1 ano (OS mediana, 8,0, 95% CI, 5.4-10.6) e 6 pacientes que sobreviveram mais de 30 meses (OS mediana, 31,0, IC 95%, 30.6-31.4). Os gráficos de Kaplan-Meier de estes grupos são apresentados na Figura S2.
Um outro grupo de 60 pacientes foi usado como uma coorte de validação, com OS mediana e DFS de 20,9 e 11,9 meses, respectivamente (ver Figura S3 para os gráficos de Kaplan-Meier). A taxa de eventos foi de 66,7%, ea mediana de seguimento para os pacientes sobreviventes foi de 21,4 meses. Nesta coorte SO foi significativamente maior (p = 0,009) em doentes que albergam os tumores de grau 1/2 (OS mediana, 25,2 CI, 95%, 14,7-35,7) do que os pacientes com grau 3 PDACs (OS mediana, 14,8 CI, 95%, 11,3-18,3) dados sobre os resultados de acordo com as características dos pacientes são apresentados na Tabela S1
análise de microarray miRNA:. agrupamento geral
Após os procedimentos analíticos para a normalização dos dados brutos do microarray análise (referido na Descrição S1) foi realizada uma análise de teste-t, o qual resultou em uma lista de 170 miARNs que mostram diferenças significativas na expressão entre os dois grupos (p 0,05) (Tabela S2). A fim de realizar a análise de agrupamento hierárquico que posteriormente construiu uma matriz de distância usando o teste de correlação de Spearman de duas caudas, devido à distribuição não-normal de expressão dentro de amostras. Esta análise de agrupamento mostrou uma boa separação entre os dois grupos de amostras (short-OS vs. longa-OS), com base nos significativamente diferentes miRNAs (Figura 1).
A fim de realizar a análise de agrupamento hierárquico construímos uma matriz de distância usando o teste de correlação de Spearman de duas caudas, devido à distribuição não-normal de expressão dentro de amostras. A análise de agrupamento mostra uma boa separação entre os dois grupos de amostras, com base nos significativamente diferentes miARNs. Os dados de expressão de microRNA foram centradas por 2 sentidos (isto é, por miARN e doentes). Vermelho e amarelo representam baixa e alta expressão de miRNA, respectivamente
Mirna análise de microarray:. Alívio e iterativa ALÍVIO
O algoritmo de Socorro foi empregada no conjunto de dados completo, como descrito na métodos. Este algoritmo a pontuação para cada miRNA atribuídos de acordo com o quão bem ele discriminados os dois grupos de amostras (por exemplo, amostras de curto OS
contra
amostras de pacientes-OS longos). Isto resultou em um top 10 da maioria dos miRNAs exigentes. Figura S3 mostra a análise de cluster com base nessas 10 miRNAs, enquanto Tabela 2 mostra este grupo dos 10 melhores miRNAs e suas pontuações atribuídas.
Depois de observar como os escores foram distribuídos (Figura S4), foram selecionados o primeiro uma análise de cluster de quatro (miR-211, miR-4321, miR-1207-3p e miR-326), entre este top 10 e executada.
Como mostrado na Figura 2, este top 4 miRNAs claramente separou os dois grupos de pacientes. Com a excepção de um caso (S2), que mostrou valores de expressão muito elevados para todos os miARNs estudados, os dois principais aglomerados no eixo dos x correspondem aos dois grupos (curto /longo OS). Em particular, uma vez que as cores no mapa de calor mostrou a expressão relativa da miARN em todas as amostras, foram observados dois tipos de perfis de expressão, em que a expressão foi mais baixa nos pacientes com um curto-SO (para miR-211, miR -1207-3p, miR-326) e uma em que o padrão era oposto (para miR-4321). Por outro lado, pacientes com longo OS tinha valores de expressão mais elevados para os mais baixos valores de expressão de miR-4321 miR-211, miR-1207-3p, miR-326, e.
As cores são normalizados e só podem ser comparados esquerda para a direita.
a fim de confirmar os miRNAs mais discriminativos Foi realizada uma análise adicional utilizando ALÍVIO iterativo. Como pode ser observado a partir da Tabela S3, os 10 principais miRs foram as mesmas, excepto para miR-1200 e miR-766 que substituiu o miR-197 e miR-1296. No entanto, o ranking das pontuações ALÍVIO iterativos mostrou uma separação mais clara entre a parte superior 4 e a parte inferior 6 miRNAs mais discriminativos (Figura S6). Desta forma, demonstramos que o top 4 miRNAs não estavam inclinados para qualquer amostra específica. Como relatado na Tabela 2, os miARNs que apareceram na parte superior 4, utilizando a abordagem RELEVO também apareceu no topo 4 na análise RELEVO iterativo, o que sugere que o perfil dos 4 miARNs expressão pode ser utilizada para distinguir com segurança entre os pacientes com short-oS e os pacientes com longo oS.
previsão alvo para os candidatos top miRNA
A identidade, localização cromossômica e número de genes alvo dos candidatos miRNA identificados em nosso estudo são resumidos na Tabela 3. para obter mais insights sobre os caminhos biológicos potencialmente regulados por miRNAs, o próximo realizada uma comparação global entre os genes-alvo previstos para os nossos top 4 candidatos miRNA de acordo com a
TargetScan
e
miRDB
. É importante notar, no
TargetScan
predição cerca de 10% destes genes foram previstos para ser alvo de 2 miARNs, com 13 genes alvo por três miARN e um gene alvo por todas as quatro miARNs diferentes (Tabela S4).
foi utilizada análise do papel prognóstico do miR-211 e miR-4321 em uma coorte independente de pacientes PDAC
análise de RT-PCR de miR-211 expressão em 60 amostras PDAC independentes para validar o significado prognóstico desta miRNA. Este grupo de validação não diferiram significativamente em termos de características clinicopatológicas comparação com a coorte inicial de pacientes (Tabela 1).
A expressão de miR-211 foi detectável em todas as amostras, e os pacientes foram inicialmente classificados de acordo com o valor médio de expressão de miR-211 (12,8 AU), de acordo com a distribuição gaussiana dos valores de expressão, tal como descrito na Figura S7.
Notavelmente, o miR-211 expressão diferiu significativamente entre o grau 1/2 ( N = 30) e de grau 3 (n = 30) tumores (p = 0,006 no-rank-sum de Wilcoxon-teste). Em contraste, nenhuma diferença foi detectada em miR-21 níveis de expressão de acordo com outros parâmetros clínico (Tabela S5).
A forte correlação de miR-211 status de expressão e evolução clínica foi demonstrada. O grupo de alto expressão de miR-211 tiveram um prognóstico melhor do que o grupo de baixa expressão. Pacientes com expressão de miR-211 abaixo mediana (baixo miR-211) tinha um sistema operacional significativamente menor média (14,8 meses, 95% CI, 13.1-16.5 meses) em comparação com pacientes com miR-211 de expressão mais elevado do que mediana (OS mediana, 25,7 meses , 95% CI, 16.2-35.6 meses, HR = 3,0, IC 95%, 2,1-8,9, P 0,001). Resultados semelhantes foram obtidos com as curvas DFS de pacientes com miR-211 expressão acima mediana, com um DFS mediana de 16,7, comparada com 9,3 meses em pacientes com a menor expressão de miR-211 (P = 0,004). As curvas de OS e DFS de Kaplan-Meier são mostrados nas Figuras 3A-B.
Por outro lado, a expressão de miR-4231 não foi correlacionada com resultados no mesmo grupo de pacientes (Figura S8). Pacientes com expressão de miR-4231 abaixo médio tinha apenas uma tendência para um sistema operacional mais tempo mediano significativo em comparação com pacientes com expressão de miR-4231 acima média (25,8 meses, 95% CI, 18.2-32.3 meses, contra 16,7 meses, 95% CI, 13.7-19.7 meses, p = 0,194). Da mesma forma, não foram observadas diferenças significativas para DFS mediana (13,0 meses, 95% CI, 8.4-17.6 meses, contra 10,0 meses, 95% CI, 2.0-17.9 meses, p = 0,581).
No entanto, dado o facto de que não havia uma boa correlação entre a expressão de miR-211 e oS, como mostrado na Figura S8 (r = 0,724) foram analisados ainda mais os dados de expressão de miR-211 utilizando K-means (k = 2). bares, SE.