Abstract

Fundo

proteína

LIM e SH3 1 (LASP-1) é uma proteína de adesão focal específica que é conhecida por estar envolvida em numerosos processos biológicos e patológicos. LASP-1 superexpressão tem sido descrita em vários tipos de cancros, mas a sua expressão e papel no câncer de células renais de células claras (ccRCC) permanece desconhecida.

Métodos

Usando imunohistoquímica, analisamos LASP- expressão 1 proteína em 216 casos ccRCC clinicopathologically caracterizados. Também examinamos LASP-1 expressão em 20 tecidos ccRCC emparelhados e em 2 linhas celulares por PCR em tempo real e Western blot. Usando a interferência de RNA, que investigou os efeitos da LASP-1 esgotamento sobre o comportamento das células tumorais

in vitro

. As análises estatísticas foram utilizadas para determinar as associações entre LASP-1 níveis, características do tumor e os resultados dos pacientes.

Resultados

LASP-1 superexpressão foi observada em tecidos ccRCC (

P

0,0001) em comparação com adjuvantes tecidos não tumorais, e os seus níveis de expressão foram estreitamente relacionado com a sobrevida global ea sobrevida livre de recorrência (

P

= 0,044 e 0,006, respectivamente) em pacientes com ccRCC. silenciamento do gene LASP-1 RNA de interferência mediada por células 786-0 ccRCC migração celular significativamente inibido.

Conclusões

Os resultados do presente estudo indicam que LASP-1 pode servir como um biomarcador de prognóstico para pacientes ccRCC e pode ser um alvo promissor para o tratamento de ccRCC

Citation:. Yang F, Zhou X, Du S, Zhao Y, Ren W, Deng Q, et al. (2014) LIM e SH3 domínio da proteína 1 (LASP-1) superexpressão foi associada com o fenótipo agressivo e mau prognóstico em Limpar Cancer Cell células renais. PLoS ONE 9 (6): e100557. doi: 10.1371 /journal.pone.0100557

editor: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 21 de março, 2014; Aceito: 23 de maio de 2014; Publicação: 23 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os arquivos cel estão disponíveis a partir GEO

Financiamento:.. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células renais Limpar celular (ccRCC) é um tumor maligno urológico comum em todo o mundo [1]. Embora imensa melhoria foi feito no tratamento de ccRCC durante os últimos anos, a taxa de mortalidade de ccRCC permanece alto, porque 40% dos pacientes submetidos a nefrectomia ccRCC irá desenvolver recorrência local ou metástases [2]. Portanto, os biomarcadores prognósticos fiáveis ​​são urgentemente necessários para prever o resultado e identificar alvos terapêuticos para o tratamento de pacientes ccRCC.

LIM e SH3 da proteína 1 (LASP-1) tem sido demonstrado desempenhar um papel importante no desenvolvimento do cancro e progressão [3], [4]. LASP-1 foi inicialmente identificados a partir de uma biblioteca de ADNc de metástases de cancro da mama, e o gene foi mapeado no cromossoma humano 17q21 [5], [6]. A proteína LASP-1 humana contém 261 aminoácidos com um domínio LIM do terminal N, seguido por dois domínios de ligação à actina no núcleo da proteína LASP-1 que medeiam a interacção entre LASP-1 e o citoesqueleto de actina no sítio da extensões da membrana celular, mas não ao longo das fibras de stress de actina [7] – [10]. O domínio SH3 na extremidade C-terminal está envolvido em interacções proteína-proteína de ligação a prolina-rico sequências, especificamente zyxin, pallidin, prefere-lipoma parceiro (LPP) e fosfoproteína estimulada por vasodilatador (VASP) [6], [11] . LASP-1 está localizada a vários sites de montagem de actina dinâmica, como contatos focais, adesões focais, babados membrana lamellipodia e pseudópodes [12], [13], mas as funções exatas de LASP-1 ainda não são bem compreendidos.

LASP-1 tem sido relatada a ser sobre-expressos em vários tipos de cancros e linhas celulares de cancro metastáticas, tais como cancro da mama [14], do cancro do ovário [4] e do cancro colo-rectal [15]. Além disso, LASP-1 silenciamento em linhas celulares de cancro metastático resultou numa forte inibição da proliferação celular e migração, e levou a uma redução no zyxin os contactos focais [4]. Curiosamente,

in vitro

silenciamento da proliferação celular LASP-1 gene reduzida e migração e muito afectado localização zyxin [3]. Além disso, a transfecção de genes mediada por LASP-1 sobre-expressão em células SW480 CRC resultaram em células de cancro agressivo e promoveu o crescimento e metástase [15] do cancro. No entanto, não foram descritos os papéis de LASP-1 em ccRCC.

No presente estudo, foi investigada a expressão de LASP-1 em ccRCC usando amostras de tecido ccRCC humana e linhas celulares, e avaliou a associação entre LASP-1 expressão e resultado ccRCC após a ressecção. Além disso, foi realizada a interferência de RNA (RNAi) silenciamento gênico mediado da LASP-1 em células ccRCC para investigar o papel da LASP-1 em ccRCC invasão

in vitro

.

Materiais e Métodos

pacientes e amostras de tecido

duzentos e dezesseis amostras de tumores renais e seus tecidos não tumorais adjacentes foram obtidas de pacientes com ccRCC que foram submetidos a nefrectomia radical ou parcial no Departamento de Cirurgia Urologia, Xijing Hospital, Quarta Universidade médica militar de agosto de 2005 a setembro de 2010. o diagnóstico foi confirmado pela análise patológica pós-operatório. Os pacientes com história de doença maligna e aqueles que tinham recebido anteriormente terapia neoadjuvante foram excluídos do estudo. Nenhum paciente apresentou metástases distantes detectáveis ​​no momento da cirurgia. A população do estudo consistiu de 82 mulheres e 134 homens (idade, 63 anos significa, faixa etária, 18-82 anos). No presente estudo, as características clínicas e patológicas foram registrados. Usando o sistema de estadiamento 2010 TNM ea classificação grau de Fuhrman, os tumores foram classificados nos seguintes grupos para as análises estatísticas: fase inicial (TNM1 e TNM2), fase tardia (TNM3 e TNM4), de baixo grau (grau 1 e 2) e alto grau (grau 3 e 4). As características clinicopatológicas dos pacientes foram recuperados a partir dos registros médicos resumidos na tabela 1. Os dados de acompanhamento foram obtidos por telefone, carta ou o banco de dados clínico ambulatorial. Todos os pacientes foram acompanhados a partir da data da cirurgia inicial até a morte ou a data de encerramento deste estudo (30 de novembro de 2013). Recorrência foi detectada em 127 pacientes (58,7%) no último exame de acompanhamento, e 46 pacientes (31,0%) morreram devido a doenças relacionadas com o ccRCC. O tempo médio de acompanhamento foi de 49,3 meses (variação, 1-67 meses).

Para PCR em tempo real e análises de Western blot, um total de 20 tecidos tumorais emparelhados e combinados tecidos não tumorais adjacentes foram coletadas de pacientes submetidos a tratamento ccRCC cirurgia no Departamento de cirurgia Urologia, Xijing Hospital, Quarta Universidade médica Militar entre Março e Junho de 2013. Os 20 pacientes incluídos 12 homens e 8 mulheres, com uma idade mediana de 61 anos (variação, 21-79 anos). Após a ressecção, os tecidos frescos foram congelados imediatamente em nitrogénio líquido e armazenados a -80 ° C. Tanto o tumor e tecidos nontumourous foram verificadas por exame histopatológico.

O estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Quarta Universidade Médica Militar de Ética e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes antes da cirurgia. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a Declaração de Helsinki.

Imunohistoquímica

As amostras de tecido foram fixados em formol a 10% e processados ​​rotineiramente para inclusão em parafina. As secções de tecido (5 mm de espessura) foram coradas com hematoxilina-eosina e analisados ​​por dois patologistas para definir os tecidos cancerosos e notumorous correspondentes. A imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada em secções de tumor embebidas em parafina usando anticorpo contra LASP-1 (1:200, Abcam, Cambridge, Reino Unido) após recuperação de antigénios. Um controlo negativo sem o anticorpo primário foi preparado para todas as amostras. A taxa de expressão média LASP-1 foi avaliada por inspeção de pelo menos 5 campos microscópicos em 400 × ampliação. LASP-1 expressão foi considerado negativo quando 10% das células cancerosas nos campos microscópicos demonstrou imunomarcação, e as lâminas foram revisadas uma segunda vez para reduzir o erro de leitura

As linhas celulares

.

a linha de células 786-0 ccRCC humana foi obtida a partir do Banco celular da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China) e cultivadas em meio RPMI 1640 que tinha sido suplementado com 10% de FBS. A linha celular humana ccRCC A498 foi obtido a partir de Tiancheng Technology Co., Ltd. (Xangai, China) e cultivadas em meio DMEM suplementado com FBS a 10%. As células foram colhidas na fase logarítmica de crescimento para utilização nas experiências descritas abaixo.

-PCR em tempo real

O ARN total a partir de tecidos tumorais e nontoumorous dos 20 pacientes ccRCC foi extraído utilizando TRIzol reagente (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) de acordo com a recomendação do fabricante. A transcrição reversa foi realizada num sistema de reacção de 20 ul com 2 ug de ARN total, que tinham sido tratados com M-MLV de transcriptase reversa (Promega, Madison, Wisconsin, EUA) para sintetizar ADNc de primeira cadeia de acordo com as recomendações do fabricante, seguindo-se amplificação de cDNA como previamente descrito. As sequências dos iniciadores que foram utilizados para a PCR em tempo real para LASP-1 foram: (F) 5′-ATGAACCCCAACTGCGCC-3 ‘e (R) 5′-TCAGATGGCCTCCACGTAGTT-3’

Western Blot

.

a proteína total foi isolado a partir de tecidos tumorais e nontoumorous de seis pacientes ccRCC utilizando o total Kit extração de proteínas (KeyGen, Nanjing, China). 30 ug de proteína por faixa foram separados utilizando 12% em gel de poliacrilamida dodecil de sódio e transferida para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. A membrana foi bloqueada em leite desnatado a 5% durante 2 h e, em seguida, incubadas com anticorpo contra LASP-1 (1:1000, Abcam, Cambridge, Reino Unido) ou β-actina (1:5000, Abcam, Cambridge, Reino Unido) a 4 ° C durante a noite. Após lavagem quatro vezes em solução salina tamponada com Tris com Tween-20, a membrana foi sondada com uma peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário (1:2000, Proteintech Group, Chicago, Illinois, EUA).

pequeno RNA de interferência (siRNA) mediada por LASP-1 gene silenciamento

a expressão de LASP-1 humano foi derrubado usando ARNic em cadeia dupla como a seguinte sequência: 5′-AAGGTGAACTGTCTGGATAAG-3 ‘, 5’-CUUAUCCAGACAGUUCACCdTdT-3 ‘. siRNAs de controlo negativo (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘e 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’), destinados a sequências de ARNm desconhecidas foram utilizados como controlos. Todos os ARNic foram sintetizados por GenePharma (Xangai, China). Uma pesquisa BLAST do genoma humano verificou-se que as sequências seleccionadas foram específicos para os genes alvo. As células na fase de crescimento exponencial foram plaqueadas em placas de seis poços a uma densidade de 0,5 x 10

5 células /ml, cultivadas durante 24 horas e transfectadas com 1? G de siRNA, depois de atingida confluência de 30-50% de acordo com a o protocolo recomendado pelo fabricante. Fluoresceína (FAM) marcado com siRNA controle negativo foi usado para visualizar a eficiência de transfecção.

In vitro

migração análise

As células em meio isento de soro (1 × 10

5 células /200 mL) foram adicionados ao topo câmaras de câmaras tamanho dos poros Transwell 8 mícrons (Corning Star, Cambridge, Massachusetts, EUA). As câmaras inferiores foram preparadas utilizando 10% de FBS como um quimioatractor. As células foram deixadas migrar através das membranas porosas durante 20 h a 37 ° C. As células que migraram através da membrana e coladas à superfície inferior da membrana foram tratados com uma solução de f ixação /coloração (0,1% de violeta cristal, 1% de formalina e 20% de etanol) para visualização. Para quantificação, as células foram contadas sob um microscópio em cinco campos seleccionados aleatoriamente sob microscopia de um Nikon ECLIPS 80i com a ampliação de 400 x. Foram analisados ​​Um mínimo de cinco câmaras a partir de três experimentos independentes.

A análise estatística

A 19,0 software IBM SPSS Statistics foi utilizado para realizar todas as análises estatísticas. As diferenças entre as variáveis ​​categóricas foram analisadas para significância estatística usando o teste do qui-quadrado, enquanto que as variáveis ​​quantitativas foram analisadas utilizando o teste de Wilcoxon pareado ou não pareado

t

-teste. Uni e multivariada de riscos proporcionais de Cox análises foram utilizados para avaliar os efeitos de vários fatores sobre o prognóstico. A análise de Kaplan-Meier foi utilizado para avaliar a sobrevivência e log-rank testes foram utilizados para comparar a sobrevida do paciente entre os subgrupos. Todos

P valores

foram em frente e verso, e

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

LASP-1 superexpressão em tecidos RCC detectadas usando IHC

Para esclarecer o papel fundamental da LASP-1 na progressão RCC, examinamos primeiro o nível de expressão da proteína de LASP-1 utilizando IHC em 216 tecidos tumorais e não tumorais, combinados tecidos adjacentes. Descobrimos que LASP-1 expressão foi significativamente regulada positivamente nos tecidos tumorais em comparação com os tecidos não tumorais adjacentes correspondentes (

P

0,0001; Figuras 1A, B e C).

LASP-1 a expressão da proteína em tecidos embebidos em parafina ccRCC (a) e tecidos não tumorais adjacentes (B) utilizando imuno-histoquímica (ampliação, 100 ×), na qual positiva LASP-1 imunomarcação mostraram cor marrom. análise de Wilcoxon demonstrou que tecidos tumorais mostraram significativamente maior expressão LASP-1 do que os tecidos não tumorais (C, n = 216). Western blot (D) e PCR em tempo real (E, n = 20) As análises confirmaram as conclusões na análise de imuno-histoquímica. A análise de transferência de Western, também mostrou diferencial LASP-1 em células humanas de rim embrynal (HEK-293) e as linhas celulares ccRCC (F). T refere-se a tecidos tumorais, enquanto P refere-se a peritumoral tecidos (não tumorais) no painel D.

Verificação de diferencial LASP-1 expressão utilizando Western blot e análises em tempo real PCR em tecidos e linhas celulares

Para verificar os resultados obtidos por IHC, detectamos LASP-1 expressão em 6 tecidos ccRCC e seus tecidos não tumorais adjacentes combinados (Figura 1D). Os resultados também revelaram aumento LASP-1 expressão em tecidos tumorais em comparação com tecidos não tumorais. PCR em tempo real foi em seguida aplicado em 20 tecidos ccRCC emparelhado e não tumorais, tecidos, e os níveis de ARNm LASP-1 também foram encontrados para ser regulada positivamente em tecidos de tumor (Figura 1E). Além disso, determinou-se que LASP-1 foi expressa em linhas de células de 2 ccRCC e células de rim embrionário humano (HEK-293) utilizando análise de Western blot. Consistente com os resultados obtidos nas amostras de tecido, maior níveis LASP-1 foram detectados na linha celular mais agressivo (786-0) do que na linha de baixo-agressiva de células (A498) ou células HEK-293 (Figura 1F).

o aumento da LASP-1 expressão foi correlacionada com a progressão tumoral e mau prognóstico em pacientes ccRCC

as correlações entre LASP-1 expressão e características clínico-patológicos foram analisados ​​utilizando o teste do qui-quadrado. Conforme resumido na Tabela 1, foram encontradas correlações significativas entre LASP-1 expressão e quatro parâmetros clínicos, incluindo o tamanho do tumor (

P

= 0,002), estadiamento TNM (

P

= 0,005), a recorrência status (

P

= 0,006) e da morte status (

P

= 0,026). A relação entre Fuhrman grau e LASP-1 expressão mostrou significância limítrofe (

P

= 0,081). No entanto, não houve associações estatísticas entre LASP-1 expressão e os restantes parâmetros, tais como idade e sexo.

Em seguida, usamos regressão de Cox univariada e multivariada para avaliar a associação entre LASP-1 expressão e resultado em pacientes ccRCC. Na análise univariada (Tabela 2), o tamanho do tumor, grau de Fuhrman, estágio TNM e LASP-1 upregulation foram significativamente correlacionada com a sobrevivência pobre em geral (

P

= 0,034, 0,0001, 0,0001 e = 0,003 , sobrevivência, respectivamente) e livre de recorrência (

P

= 0,005, 0,0001, 0,0001 e 0,0001, respectivamente) em pacientes ccRCC. Em seguida, os quatro fatores que foram significativamente associados com o desfecho (

P Art 0,05) na análise univariada foram submetidos a uma análise multivariada. A análise multivariada revelou que Fuhrman grau, estágio TNM, e LASP-1 upregulation foram fatores prognósticos independentes para a sobrevida global (

P

= 0,001, 0,0001 e 0,044, respectivamente) e sobrevida livre de recidiva (

P

= 0,002, 0,010 e 0,006, respectivamente) em pacientes ccRCC (Tabela 3). Além disso, a análise da curva de Kaplan-Meier também indicou que LASP-1 regulação positiva foi significativamente associada com pior prognóstico em pacientes ccRCC (Figura 2A e B).

LASP-1 silenciamento migração inibido celular ccRCC

in vitro

siRNA transfecção foi empregado para knockdown LASP-1 expressão em 786-0 células, que apresentou alta endógena LASP-1 expressão. Os efeitos do siARN transfecção na expressão LASP-1 foram confirmadas utilizando análise de Western blot. A quantidade de LASP-1 de proteína foi claramente reduzido em comparação com os que em células de controlo negativo (Figura 3A). Além disso, o ensaio de invasão Transwell revelou que o silenciamento LASP-1 expressão diminuiu dramaticamente a mobilidade celular em comparação com a das células de controlo (Figura 3C). Um desemparelhado

t

-test foi utilizado para avaliar a diferença entre 786-0 e células si786-0 no número de células invadidas por campo (Fig. 3B), que revelou que o número de células invadidas por campo diminuiu significativamente após o knockdown de LASP-1 expressão (

P Art 0,0001).

Western blot foi utilizada para verificar a knock-down de LASP-1 expressão em células 786-0 por siRNA transfecção (A). Um teste t desemparelhado foi utilizado para avaliar as diferenças no número de células invadidas por campo entre as linhas de células 786-0 e si786-0 (B). resultados Transwell para as linhas de células 786-0 e si786-0 são mostrados (C).

Discussão

No presente estudo, investigamos LASP-1 expressão em uma série de 216 tecidos ccRCC e comparou estes dados com os obtidos em ccRCC clinicamente estabelecida pela primeira vez. Os resultados revelaram que os níveis de expressão LASP-1 de proteína foram mais elevados em tecidos ccRCC do que nos tecidos não tumorais, emparelhado, como indicado por IHC e validado utilizando Western blot e PCR em tempo real. As análises Association revelou que LASP-1 regulação positiva foi significativamente associada com o tamanho do tumor maior e pior estágio TNM. Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que LASP-1 pode desempenhar um papel importante na progressão ccRCC. Outras análises de prognóstico indicou que LASP-1 sobre-expressão pode ser um fator prognóstico independente em ccRCC. No entanto, mais estudos com grandes amostras são necessários para confirmar estas descobertas e estabelecer o papel da LASP-1 em predizer o prognóstico de pacientes com ccRCC.

Os dados recentes têm demonstrado que a alta expressão LASP-1 em cancros é essencial para a proliferação de células de cancro, a progressão e metástase [16]. As células com elevada expressão LASP-1 apresentado mais forte e a vitalidade foram mais susceptíveis à formação de lesões metastáticas, devido à sua maior capacidade para formar clones [17]. Estudos anteriores relataram que o silenciamento LASP-1 na expressão da mama, linhas celulares de cancro do ovário e colorrectais leva à proliferação celular reduzida e migração [4], [14], [15]. Consistente com os resultados desses estudos, os resultados do presente

In vitro

experiências em linhas celulares ccRCC indicam que LASP-1 expressão é necessária para a migração celular.

O mecanismo pelo qual LASP- 1 afecta a proliferação de células de cancro e migração permanece obscura. A migração celular ea montagem controlada e desmontagem de adesões focais são altamente integradas com os processos de várias etapas e características centrais na patologia molecular dos cancros [18]. Até à data, mais de 50 diferentes proteínas de adesão que regulam a taxa de polimerização e a organização da actina e rotatividade de adesão focal em saliências foram identificados [19], [20]. LASP-1 tem sido mostrado para interagir com parceiro preferido lipoma (LPP) e zyxin, ambas as quais podem influenciar a dinâmica de filamentos de actina [21]. A ligação ocorre entre o domínio C-terminal de SH3 LASP-1 e os domínios ricos-prolina N-terminal da zyxin LPP e [4]. Zhao

et al

. foi relatado que o gene transfecção mediada LASP-1 sobre-expressão em células SW480 CRC resultou em fenótipos agressivos em células cancerosas e promoveu o crescimento e metástase [15] do cancro. Esta observação realça a importância de LASP-1 no cancro.

Estudos recentes têm mostrado que LASP-1 é transcricionalmente regulados positivamente em resposta ao morfogénio Hedgehog Sonic [22]. Perturbação da cascata de sinalização de hedgehog conduz a um número de distúrbios do desenvolvimento e desempenha um papel fundamental na formação de uma variedade de cancros humanos. Neste contexto, é interessante notar que zyxin também foi identificado como um gene diferencialmente transcrito em vários tipos de cancros que utilizam a tecnologia de microarray [15]. Grunewald

et al

. informou que LASP-1 superexpressão medeia a migração humana ovário células cancerosas e proliferação e influências zyxin localização [4]. Zyxin está localizada principalmente em placas de adesão focais e desempenha um papel central na polimerização em filamentos de actina em células de mamífero. Zyxin silenciamento em células HeLa em resultados significativamente redução na formação de fibras de stress de actina, ao passo que sob alongamento cíclico, zyxin única dissocia contactos focais e acumula-se no núcleo, sem afectar vinculina ou filamentos de actina [6]. A motilidade celular diminuiu após LASP-1 silenciamento pode ser explicado pela perda funcional de zyxin como uma proteína de andaimes que facilita a formação de complexos moleculares, promovendo assim a actina site-specific [8]. No presente estudo, nós derrubado LASP-1 expressão na linha de células 786-0 e observou capacidade de migração pobres in vitro, que foi consistente com os resultados de estudos anteriores.

Conclusões

em resumo, observou-se pela primeira vez que LASP-1 foi regulada positivamente em ccRCC, o que implica que o seu importante papel no desenvolvimento de ccRCC. LASP-1 superexpressão foi associada com tumores maiores e fenótipos agressivos em ccRCC e silenciamento de LASP-1 expressão inibiu a migração de células cancerosas

in vitro

. Portanto, LASP-1 pode ser um novo biomarcador prognóstico e um alvo terapêutico promissor para ccRCC.