Abstract

Fundo

polipeptídeos associados a Lamina 2 (LAP2) é uma proteína nuclear que conecta a lâmina nuclear com cromatina. Embora seus papéis críticos em doenças genéticas e doenças malignas hematopoiéticas têm sido descritos, a sua expressão e papéis em câncer do trato digestivo foram mal caracterizadas.

Métodos

Para examinar a expressão de LAP2 em tecidos de pacientes, foi realizada imuno-histoquímica e PCR em tempo real. Para examinar a motilidade das células cancerosas, foram empregados câmara de Boyden, ferida ensaios de cura e Matrigel invasão. Para revelar suas funções na metástase in vivo, foi utilizado um modelo de metástase xenotransplante fígado. Para investigar o mecanismo subjacente, um microarray de cDNA foi realizada.

Resultados

A imuno-histoquímica em tecidos de pacientes apresentaram expressão generalizada de LAP2 em diversos tipos de câncer do aparelho digestivo, incluindo estômago, pâncreas, fígado e cancros do ducto biliar . Real-time PCR confirmou que LAP2β é sobre-expresso em tecidos de cancro gástrico. Knockdown de LAP2β não afetou a proliferação da maioria das células de câncer do aparelho digestivo, exceto as células de câncer de pâncreas. No entanto, knockdown de LAP2β diminuição da motilidade de todas as células cancerígenas testadas. Além disso, a sobre-expressão de LAP2β aumento da motilidade das células de cancro gástrico e pancreático. No modelo de xenoenxerto de metástases no fígado, aumento da eficácia LAP2β metastático de células gástricas cancerosas e mortalidade em ratinhos testados. microarrays de cDNA mostrou a possibilidade de que miristoiladas C substrato rico em alanina quinase (MARCKS) e interleukin6 (IL6) podem mediar a motilidade LAP2β-regulada de células cancerosas.

Conclusões

A partir dos resultados acima, concluir que LAP2 é amplamente sobre-expressos em diversos tipos de câncer do aparelho digestivo e LAP2β regula a motilidade das células cancerosas e sugerem que LAP2β pode ter utilidade para o diagnóstico e terapêutica em câncer do trato digestivo

Citation:. Kim HJ, Hwang SH, Han ME , Baek S, HE Sim, Yoon S et al. (2012) LAP2 é amplamente sobre-expressos em câncer do trato digestivo diversificada e Regula Motilidade das células cancerosas. PLoS ONE 7 (6): e39482. doi: 10.1371 /journal.pone.0039482

editor: Terence Lee, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 08 de setembro de 2011; Aceito: 24 de maio de 2012; Publicação: 20 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de pesquisa médica Grant (2010-25), Hospital da Universidade Nacional de Pusan, o programa de centro de pesquisa médica do Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia /Coreia Ciência e Engenharia Foundation (2011-0006190) e do programa Nacional centro Núcleo de investigação de Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (No. R15-2006-022-01001-0). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A metástase das células cancerosas afeta muito o prognóstico de pacientes com câncer. A taxa de sobrevivência de pacientes que têm metástases distantes é significativamente mais baixo do que aqueles que têm localizada tumor na maioria dos tipos de cancro [1]. Um dos fatores críticos na metástase é a motilidade das células cancerosas [2]. Muitas moléculas críticos que regulam a motilidade das células cancerosas tenham sido identificados. Como a inibição de migração é eficaz no tratamento de metástases em muitos aspectos, muitos inibidores de migração estão sob desenvolvimento clínico [3]. Por exemplo, a cinase Rho é uma pequena GTPase que regula a actina e a rede microtubulin e protuberâncias celulares. Então, um inibidor da Rho cinase que tem como alvo está sob o desenvolvimento clínico [3].

polipéptidos associados Lamina-2 (LAP2) é uma das proteínas LEM-domínio que são proteínas de membrana nuclear interna que partilham um motivo comum de aproximadamente 40 aminoácidos, conhecida como o LEM-domínio [4], [5]. proteínas LEM-domínio se conectam a membrana nuclear interna ea lâmina nuclear com cromatina através do fator de barreira-to-autointegration (BAF). A família de proteínas de domínio inclui LEM-LAP2 [6], [7], [8], emerin [9], MAN1 [4], LEM2 [10] e LEM3 [11]. O nome deriva do LEM LAP2, emerin MAN1 e [4].

Para além dos seus papéis estruturais na membrana nuclear, proteínas LEM-domínio demonstraram desempenhar um papel crítico em diversos processos celulares tais como a replicação do ADN e regulação da expressão do gene. LAP2β regula a replicação do ADN através da interacção com HA95 durante a fase G1 do ciclo celular [12]. Esta interacção com HA95 leva os complexos prereplication para a origem de replicação e estabiliza-o. A interrupção desta interacção provoca a libertação de componentes complexos prereplication e desencadeia a proteólise de Cdc6

.

consequências patológicas foram descritos para proteínas LEM-domínio em doenças genéticas em seres humanos e são colectivamente denominadas laminopatias [5], [13 ]. Por exemplo, a deficiência emerin provoca Emery-Dreifuss Distrofia Muscular (EDMD) [9], [14], [15] e deficiência MAN1 leva a osteopoiquilose, síndrome de Buschke-Ollendorf e melorreostose [16]. Em adição a estes laminopatias, tem sido descrito o envolvimento de LAP2 na carcinogénese. Por exemplo, LAP2β demonstrou estar envolvida na proliferação de linfócitos malignos [12], [17], [18]. Além disso, a sobre-expressão de LAP2α foi relatado em tecidos da laringe, pulmão, estômago, mama e cancro do cólon [19]

A família LAP2 de proteínas de domínio LEM, é composto por pelo menos seis isoformas em mamíferos:. Α, β , γ, δ, ε, ζ, [6], [20], [21], [22]. Estas isoformas são geradas por splicing alternativo do mesmo transcrito. Todas as isoformas, exceto o LAP2α mamíferos e LAP2ζ são proteínas da membrana nuclear interna e compartilhar uma organização de domínio semelhante. O segmento N-terminal contém o LEM-domínio e LEM-like domínio. Ao contrário do LEM-domínio, LEM-like domínio pode interagir diretamente com cromatina sem ajuda de BAF. O segmento de terminal-C de proteínas LAP2 tem domínios de ligação de lamina. Nomeadamente, o segmento C-terminal da isoforma-α falta um domínio transmembranar putativo, de modo que a proteína é distribuída por todo o núcleo. Embora LAP2α, β, e γ são expressos ubiquamente na maior parte das células de mamíferos, a expressão diferencial das isoformas LAP2 foi descrito. tecidos diferenciados altamente expressam a isoforma LAP2γ, no entanto, os tecidos com células proliferativas expressam mais das isoformas LAP2α LAP2β e [23].

Embora seus papéis críticos em doenças genéticas e doenças malignas hematopoiéticas têm sido descritos, expressão e os papéis de LAP2 em outras células ou doenças são mal caracterizadas. No presente estudo, encontramos pela primeira vez um novo papel de LAP2β na regulação da motilidade das células cancerosas e superexpressão de LAP2 em diversos tipos de câncer do aparelho digestivo.

(A) coloração imuno-histoquímica mostrou superexpressão de LAP2 em diversos câncer do trato digestivo, incluindo pâncreas, fígado, estômago e cancros do ducto biliar. Nota sobre-expressão de LAP2 em células de cancro metastáticas. barra de escala, de 200 mm. (B) A sobre-expressão de LAP2β em tecidos de cancro gástrico foi analisada por PCR em tempo real utilizando iniciadores específicos para a isoforma-β. GAPDH foi utilizado para normalizar todos os dados.

Western blotting (A, B) e PCR em tempo real (C, D) foram utilizados para determinar a eficiência de knockdown (A, C) ou a sobre-expressão ( B, D) de LAP2β em SNU638 ou PANC1 células. Os dados são as médias ± DP de três experiências independentes (* P 0,01, teste t de Student). (E) Efeito do LAP2β knockdown sobre a proliferação de células cancerosas. ensaio de WST-1 foi usado para medir a proliferação de células cancerosas na presença de 10% de FBS. Cinco dias após a transfecção com 100 nM por LAP2β siRNA ou 100 nM mexidos (SCR) siRNA, foi realizado um ensaio de WST-proliferação. (F) Efeito de sobreexpressão LAP2β sobre a proliferação de células cancerosas. ensaio de WST-1 foi realizado em SNU638 ou PANC1 células com superexpressão de genes LAP2β ou vetor de controle. Os dados são os meios ± DP de três experiências independentes em quintuplicado (* P 0,01, teste t de Student).

Métodos

culturas de células e transfecção

Seguindo as células cancerosas do trato digestivo foram utilizados; células de câncer gástrico (SNU216, SNU638), células colangiocarcinoma (SNU1079, HuCCT1), células de câncer pancreático (PANC1, MIA-PACA2), células de hepatocarcinoma (Huh7, HepG2). células HuCCT1, HepG2, SNU216, SNU638, SNU1079 e Huh7 foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 100 ug /ml de penicilina /estreptomicina. células PANC1 e MIA-PACA2 foram cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DME) /alto teor de glucose suplementado com FBS a 10% e 100 ug /ml de penicilina /estreptomicina. A maioria das células foram cultivadas a 37 ° C, 5% incubadora de CO2. As células foram transfectadas com ARNsi utilizando DhamaFECT Reagente 3 (Dhamacon, Lafayette, CO, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As sequências de siRNA são os seguintes: LAP2β siRNA (Bioneer, Daejeon, Coreia do Sul), 5 ‘ACA AGA GGG UCA AGA AGA A (dTdT) -3’ e 5’UUC UUC UUG ACC CUC UUG U (dTdT) -3 ‘; mexidos (SCR) siRNA (Dhamacon, Lafayette, CO, EUA), 5’-GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 ‘e 5′-UUU CGC UCU UUU CGC GAU C (dTdT) -3’.

a superexpressão de LAP2β

a expressão construção de ADN pCMV-SPORT6-LAP2β (Thermo biosystem aberta científica, Huntsville, AL, EUA) foi utilizado para conduzir a sobre-expressão e G418 (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, EUA) foi utilizado para a selecção. As células foram co-transf ectadas com pCMV-SPORT6-LAP2β /pIRES-Neo a uma razão 5:02 utilizando FuGENE HD (Roche, Nutley, NJ), de acordo com as instruções do fabricante. células Mock foram estabelecidas simultaneamente, utilizando o vector de controlo vazio.

Western Blot

Depois de eletroforese em gel e transferência para uma membrana de PVDF, a membrana foi bloqueada durante uma hora. Após a adição de anticorpos primários (de ratinho anti-humano LAP2β (BD Biosciences, San Jose, CA, USA, 1:1000) e de ratinho anti-α-tubulina (BioGenex, 1:10000)) em solução de bloqueio a membrana foi incubada na primária anticorpo, a 4 ° C durante a noite num agitador. Aplicou-se o anticorpo secundário apropriado (1:2000, peroxidase de rábano conjugado com anti-ratinho) e incubou-se à temperatura ambiente durante 2 h num agitador. Por fim, as proteínas foram detectadas utilizando LAS3000.

ensaio Boyden câmara (A-G) e cicatrização de feridas ensaio (H, SNU638 células) foram usadas para medir a migração de células cancerosas. LAP2β siARN inibiu significativamente FBS- ou migração induzida por EGF em comparação com SCR siARN em SNU638 (A, C), PANC1 (A, D) ou outras células de cancro do tracto digestivo (G). A sobre-expressão de LAP2β em SNU638 (B, E) ou PANC1 (B, F) células significativamente o aumento da migração em comparação com o vector de controlo (B, E, F). EGF (100 ng /ml) ou 10% de FBS foi utilizado para induzir a quimiotaxia. Mitomicina C (0,01 ug /ml) foi adicionado para remover os efeitos de proliferação. Dois dias após a transfecção com 100 nM LAP2β siRNA ou 100 nM mexidos (SCR) siRNA, ambos os ensaios de migração foram efectuados. Quatro ou seis horas mais tarde, após a adição de EGF ou de FBS em ensaio de câmara de Boyden, as células foram fixadas. Após um zero no ensaio de cicatrização de feridas, as células migradas foram fixadas nos tempos indicados. coloração representativas de células que migraram foi apresentada (A, B). células migradas foram contadas e os dados são apresentados como gráficos (C-G). Os dados são as médias ± SD de três experiências independentes em triplicado (C-L, * P 0,01, teste t de Student).

ensaio de invasão de Matrigel foi usada para medir a invasão das células cancerosas. Knockdown de LAP2β inibiu significativamente FBS- e invasão induzida por EGF em comparação com SCR siARN em SNU638 (A, C) ou células PANC1 (A, D). A sobre-expressão de LAP2β em SNU638 (B, E) ou PANC1 (B, F) células aumentou significativamente a invasão comparado com o vector de controlo. EGF (100 ng /ml) ou 10% de FBS foi utilizado para induzir a invasão. Mitomicina C (0,01 ug /ml) foi adicionado para remover os efeitos de proliferação. Dois dias após a transfecção com 100 nM LAP2β siRNA ou 100 nM mexidos (SCR) ARNsi, os ensaios foram realizados de invasão. coloração representativas de células invadidas foi apresentada (A, B). células invadidas foram contadas e os dados são apresentados como gráficos (C-F). Os dados são os meios ± DP de três experiências independentes em triplicado (CF, * P 0,01, teste t de Student)

em tempo real foram obtidos PCR

tecidos de câncer gástrico. com consentimento informado por escrito dos pacientes submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital da Universidade de Pusan ​​Nacional e Pusan ​​Hospital Nacional Yangsan University, eo estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional dos hospitais (Permit número 2009-13). O ARN total a partir de tecidos ou células foram extraídos utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, Calsbad, CA, EUA) ou RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Sintetizou-se ADNc com transcriptase reversa de MMLV (Promega, Madison, WI, EUA), dNTP e iniciadores oligo-dT. As sequências dos iniciadores foram os seguintes: LAP2β, 5′-AGG GCA GAG CAA AGA CTC CAG TAA CAA -3 ‘e 5′-TTA TTC CAG CTT GAG AAT AGC TCT GAT TGT GC -3′; MARCKS, 5’-GTG CCC AGT TCT CCA AGA CCG CA -3 ‘e 5′-GGC CAT TCT CCT GTC CGT TCG CT -3′, IL6; 5’-TAG CCG CCC CAC ACA GAC AGC C-3 ‘e 5′-TTC TGC CAG TGC CTC TTT GCT GCT-3′; STAT3, 5’-AAC ATG GCT GGC AAG GGC TTC TCC T-3 ‘e 5′-AGT GCT CAA GAT GGC CCG CTC CC -3′; GAPDH, 5’- GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT -3 ‘e 5′-TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G – 3’. Em tempo real de RT-PCR foi realizada utilizando a energia SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) numa 7500 detector de sequências ABI Prism (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) de acordo com o fabricante do protocolo. GAPDH foi usada para normalizar os níveis de entrada de ADNc.

A imuno-histoquímica

Depois de desparafinagem e re-hidratação, as lâminas foram submetidas a peróxido de hidrogénio a 0,3% durante 30 minutos para extinguir a actividade da peroxidase endógena. O bloqueio foi feito com 10% de soro de burro normal (NDS) e 1% de BSA em PBS 1 X. Em seguida, as lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C em tampão contendo anticorpo primário seguinte bloqueio; LAP2 anti-humano (1:200, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA), anti-STAT3 (1:100, Cell Signaling, Beverly, MA, EUA), anti-IL6 (1:100, Abcam, Cambridge, Reino Unido) ou anti-MARCKS (1:50, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) de anticorpo. O anticorpo secundário (conjugado de peroxidase de rábano-) A ligação foi feita a uma diluição 1:200 em tampão de bloqueio durante 2 horas à RT. A detecção foi realizada com HRP (Vector Laboratories) utilizando o kit de substrato DAB (Vector Laboratories). Contracoloração foi feito durante 1 min com tampão de coloração hematoxilina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Proliferação Celular Ensaio

Dois, três ou cinco dias após a transfecção com siRNA, nós adicionamos 10 ul de sal de tetrazólio-1 (WST-1, Roche, Indianapolis, IN, EUA) reagente de proliferação celular solúvel em água pré-misturados em cada cavidade. Estas células foram incubadas durante duas horas na incubadora. A viabilidade celular foi medida por absorvância a 450 nm utilizando um leitor de ELISA (TECAN, Mannedorf, Suíça).

Boyden Câmara de Ensaio

A migração de células de cancro foi medido numa câmara de Boyden. Aproximadamente 5 x 10

4 células em 0,05 ml de meio RPMI 1640 isento de soro, foram semeadas à membrana bem-revestidos com colagénio do tipo I. Para remover os efeitos de proliferação, adicionou-se mitomicina C (0,01 ug /ml, Sigma, EUA). As células foram deixadas migrar durante quatro ou seis horas. As membranas foram fixadas e coradas com Diff-Quik solução (Sysmex, Kobe, Japão) durante um minuto e lavou-se com água destilada. O número de células em 10 campos seleccionados aleatoriamente, foi determinada usando um microscópio de luz. As experiências foram realizadas em triplicado e repetidas três vezes.

Cicatrização de Feridas Ensaio

A monocamada de células foi riscada com uma ponta de pipeta amarela e migração das células para a área ferida foi observado sob um microscópio invertido. Para remover os efeitos de proliferação, adicionou-se mitomicina C (0,01 ug /ml, Sigma, EUA). As imagens foram tiradas nos tempos indicados. As medições foram tomadas a partir de cinco campos microscópicos individuais em cada experiência, e os dados representativos de três experiências são apresentados.

Matrigel Invasão Ensaio

A capacidade das células de cancro para invadir foi determinada utilizando 24 poços inserções câmara BioCoatTM MatrigelTM (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). O inserto interior das câmaras de invasão foram revestidas com 0,5 mg /ml de factor de crescimento reduzida Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) e o inserto exterior de 0,5 mg /mL de fibronectina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). As células foram semeadas em pastilhas a uma densidade de 5 x 10

4 por inserção em meio isento de soro e depois transferidas para poços cheios com o meio de cultura contendo FBS a 10% ou 100 ng /mL de EGF como um quimioatractor. Para remover os efeitos de proliferação, adicionou-se mitomicina C (0,01 ug /ml, Sigma, EUA). Depois de 24 (10% de FBS) ou 52 horas (100 ng /ml de EGF) de incubação, as células não-invasor no topo da membrana foram removidas por raspagem. células invadidas na parte inferior da membrana foram fixadas, seguido por coloração com uma solução Diff-Quik. As experiências foram realizadas em triplicado, e pelo menos 10 campos foram contadas em cada experiência.

A metástase do fígado Modelo de Xenoenxerto

A capacidade dos transfectantes para metastizar para o fígado foi avaliada pelas células lentamente injectada ( 5 × 10

6 /0,05 ml) no baço de ratinhos nus através de uma agulha de calibre 27 (grupo NK4, grupo simulada; n = 5 /grupo). Para estudos patológicos, todos os ratos foram mortos às 5 semanas e os fígados foram isoladas, fixadas em 10% neutra – formalina tamponada, e embebido em parafina. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O Comité de Pusan ​​Nacional de Atenção Universidade Institucional Animal e Uso (PNUIACUC) aprovou os procedimentos experimentais (Permit Number: PNU-2010-00083).

cDNA Microarray

O RNA total foi extraído de SNU638-LAP2 e SNU638 células simulados utilizando RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Quantificada RNA foi então utilizado para a análise microarray em Humano HT-12_v4_Bead fritas (Illumina Inc., San Diego, CA, EUA). Amostras de RNA total foram marcadas utilizando o kit de amplificação de ARN Ilumina TotalPrep (Ambion, Applied Biosystem, CA, EUA) para a síntese de cDNA e na transcrição in vitro. Single-stranded RNA (ARNc) foi gerada e marcada pela incorporação de biotina-NTP (Ambion). Um total de 0,5 ^ g de ARNc marcado com biotina foram hibridadas a 58 ° C durante 16 h para Ilumina de Humano HT-12_v4_BeadChip (Ilumina). O ARNc biotinilada hibridada foi detectada com estreptavidina-Cy3 e quantificado usando um leitor scanner BeadArray (Ilumina) de acordo com as instruções do fabricante. dados de matriz foram processados ​​e analisados ​​pelo software versão 3.0 Illumina BeadStudio (Illumina). Os dados digitalizados foram normalizados pelo método de normalização quantil-quantil e log-transformados (por base dois). Todos os dados são Miame complacente e os dados brutos foram submetidos ao repositório público. (NCBI do GEO Número de acesso: GSE31450)

células cancerosas gástricas com superexpressão LAP2β gene ou controle de vetores foram injetados baço e metástases para o fígado foi examinado 5 semanas depois. regiões tumorais metastáticas foram indicados por círculos pontilhados. imunomarcações representativas com anti-LAP2, anti-IL6, anti-STAT3, e anticorpos anti-MARCKS e H E colorações em uma metástase do fígado são apresentados. O asterisco indica lesões tumorais. Barra de escala, 50 mm.

Análise de Dados

Todos os dados são apresentados como médias ± DP. A diferença entre os valores médios dos dois grupos foi avaliada utilizando o teste t de Student (não emparelhado). Para comparação de mais de 3 grupos, utilizou-se uma análise unidireccional de variância (ANOVA), seguida de comparações múltiplas de Tukey. * Indica um valor de P . 0,05, o que foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

LAP2 é amplamente sobre-expressos em câncer do trato digestivo Diversos

Para examinar os padrões de expressão LAP2 em cancros aparelho digestivo, incluindo estômago, pâncreas, fígado e câncer do ducto biliar, foi realizada imuno-histoquímica usando tecidos de pacientes (n = 15 por cada tipo de câncer). proteína LAP2 foi amplamente sobre-expresso na área cancerosa de tecidos em comparação com áreas não-cancerosos (Fig. 1A, 47% no câncer de estômago, 27% no câncer de pâncreas, 30% no câncer de fígado, 40% no câncer do ducto biliar). Notavelmente, foi observada a expressão de LAP2 em células metastáticas de cancro dos tecidos dos pacientes. Porque LAP2 tem inúmeras isoformas, nós nos concentramos em LAP2β. Para confirmar os resultados de immunohistochemistsry, foi realizada a PCR em tempo real utilizando iniciadores específicos do LAP2β em tecidos de cancro gástrico. Apesar de todos os tecidos testados não superexpressam LAP2β, foi sobre-expresso em 13 casos (total de 24 casos, Fig. 1B).

Papéis de LAP2β em proliferação, migração e invasão das células cancerosas

Para examinar os papéis de LAP2β na carcinogênese, nós knocked-down ou overexpressed LAP2β usando siRNA ou cDNA, respectivamente. Nós verificamos a eficiência da modulação do gene LAP2β por Western blotting ou PCR em tempo real (Fig. 2A-D). LAP2β ARNsi (100 nM) diminuiu o nível de ARNm de LAP2β em SNU638 ou células PANC1 SCR em comparação com ARNsi por 42% ou 61%. Superexpressão de LAP2β por transfecção cDNA aumentou o nível de mRNA de LAP2β em SNU638 ou PANC1 células (clone # 6) em comparação com o vector de controlo de 1,7 ou 19,6 vezes, respectivamente.

Em seguida, examinamos o papel da LAP2β na proliferação de células cancerosas. Cinco dias após a transfecção com o SCR ou LAP2β siRNA, WST-1 ensaio de proliferação foi efectuado. Knockdown de LAP2β não afectou a proliferação de células de cancro mais testados excepto as células de cancro do pâncreas (Fig. 2E). LAP2β siARN inibiu a proliferação de células de cancro pancreático PANC1 MIA-PaCa2 e comparados com SCR ARNsi por 74% e 46%, respectivamente (Fig. 2E). Observam-se resultados semelhantes quando foi realizado ensaio de proliferação de WST-1 dois ou três dias após a transfecção. Superexpressão de LAP2β em SNU638 ou PANC1 células afetadas ligeiramente proliferação (Fig. 2F).

Para determinar o papel de LAP2β na migração de células cancerosas, realizamos estudos utilizando um ensaio de câmara de Boyden. Em todas as células cancerígenas testadas, knockdown de LAP2β inibiu a migração de células de cancro (Fig. 3). Por exemplo, LAP2β siARN inibida FBS- ou induzida por EGF de migração de células em comparação com SNU638 SCR siRNA de 47% e 70%, respectivamente (Figura 3A, . 3C). Em contraste, a superexpressão de LAP2β aumento da migração induzida por EGF FBS- e de SNU638 células em comparação com células simuladas por 145% e 387%, respectivamente (Fig 3B . 3E). Resultados semelhantes foram obtidos em células que sobre-expressam LAP2β- PANC1 (Fig 3B . 3F). Este efeito sobre a migração de células de cancro foi ainda confirmada por um ensaio de cicatrização de feridas em SNU638 células (Fig. 3H). Estes resultados levaram-nos a examinar o papel do LAP2β na invasão das células cancerosas. Num ensaio de invasão de Matrigel, LAP2β siARN inibida FBS- e invasão induzida por EGF de células em comparação com SNU638 SCR ARNsi por 93% e 47%, respectivamente (Fig. 4A 4C). Resultados semelhantes foram obtidos em PANC1 (Figura 4A . 4D) ou SNU216 (dados não apresentados), as células. Em contraste, a superexpressão de LAP2β aumentou FBS- e invasão induzida por EGF de células SNU638 relação ao controle do vetor por 725% e 1.223%, respectivamente (Fig 4B . 4E). Resultados semelhantes foram obtidos em PANC1 (Fig 4B . 4F). células

LAP2β Melhora metastático Eficácia das células cancerosas gástricas em um xenoenxerto Modelo metástase hepática

Regulamento da motilidade das células cancerosas por LAP2β sugeriu a possibilidade de que regula LAP2β metástases de células cancerosas in vivo. Para examinar esta possibilidade, que as células cancerosas injectadas gástricas em baço de ratinhos nus e em seguida observou metástase no fígado. Curiosamente, a sobre-expressão de LAP2β aumentou a eficiência e o tamanho das metástases do fígado (Fig. 5) e a mortalidade dos ratinhos testados. 67% dos ratinhos injectados com células de cancro que sobre-expressam gástricas LAP2β morreu 8 semanas mais tarde, após a injecção, enquanto que todos os ratinhos de controlo injectados com células de cancro gástrico expressando o vector de controlo sobreviveram. No exame histológico de tecidos de xenotransplante, confirmamos superexpressão de LAP2β no xenoenxerto derivado de ratos injectados com células LAP2β-superexpressam (Fig. 5).

Alterações induzidas LAP2β-na expressão de mRNA

para revelar o mecanismo subjacente da motilidade LAP2β-regulada, foi realizado um cDNA microarray (do NCBI GEO Número de acesso: GSE31450). Embora o nível de ARNm de LAP2β foi sobre-expressa na linha celular estável de cerca de 1,7 vezes, aqueles de muitos genes foram alteradas pela sobre-expressão (Figura 2 . Tabela 1). Entre os genes significativamente alterada pela LAP2β, que incidiu sobre substrato miristoilada rica em alanina quinase C (MARCKS), transdutor de sinal e activador de transcription3 (STAT3) e interleukin6 (IL6), porque estes genes foram relatados para regular a motilidade das células. PCR em tempo real para cada gene confirmada alterações significativas nos níveis de ARNm de cada gene (Fig. 6). A sobre-expressão de LAP2β aumentou os níveis de mRNA da MARCKS e de IL6 em comparação com o controle de vetores de 193% e 79%, respectivamente (Fig. 6). Além disso, o aumento da expressão de MARCKS, IL6 e STAT3 foram observados no xenoenxerto derivada de ratinhos injectados com as células que sobre-expressam LAP2β-(Fig. 5).

A expressão de genes entre células de cancro gástrico overepxressing vectores de genes ou de controlo foram comparados LAP2β por micromatriz de ADNc. PCR em tempo real foi utilizada para confirmar a alteração induzida LAP2β na expressão do gene da

MARCKS, STAT3 e IL-6

em SNU638 células. Os dados são traçados como alterações de dobragem em comparação com células falsamente. Os dados são os meios ± DP de três experiências independentes em quintuplicado (* P 0,01, teste t de Student).

Discussão

LAP2, uma das proteínas de domínio LEM, tem sido principalmente descrito para desempenhar um papel estrutural na membrana nuclear e para ser envolvida em diversos distúrbios genéticos. No entanto, aqui nós apresentamos pela primeira vez a sua expressão e papéis em diversos tipos de câncer do aparelho digestivo. Em particular, descobrimos que LAP2β pode controlar a motilidade das células cancerosas, bem como contribuir para a metástase das células cancerosas.

A metástase das células cancerosas afeta muito o prognóstico de pacientes com câncer. Vários resultados do presente estudo corroboram que LAP2β regula a motilidade e metástase das células cancerosas. Em experimentos in vitro na câmara de Boyden, ferida ensaios de cura e Matrigel invasão, mostrou que knockdown diminuiu, enquanto a superexpressão de LAP2β aumentou a migração e invasão das células cancerosas (Fig 3 4.). Além disso, no modelo de xenoenxerto, LAP2β reforçada metástase de células de cancro (Fig. 5). Embora as células transf ectadas com o vector de controlo causada metástases no modelo de xenoenxerto, o efeito era bastante ineficiente e lento. Em contraste, as células LAP2β-sobre-expressos mostrou um comportamento mais agressivo no xenotransplante. Além disso, verificou-se a sobre-expressão de LAP2 em células de cancro metastáticas de tecidos de pacientes (Fig. 1).

Como LAP2β pode contribuir para a motilidade e a metástase de células de cancro? Encontrámos vários genes que foram induzidas por LAP2β na análise de cDNA microarray (Tabela 1), o qual foi ainda confirmada por PCR em tempo real (Fig. 6) e imuno-histoquímica em xenoenxerto (Fig. 5). Uma delas, a MARCKS, é responsável pela ligação e ligação cruzada dos filamentos de actina directamente à membrana [24]. A sobre-expressão de MARCKS foi encontrado em vários cancros, incluindo o carcinoma hepatocelular [25], o cancro pancreático [26], glioblastoma [27] e colangiocarcinoma [28]. Além disso, a MARCKS desempenha um papel crítico na invasão induzida por EGFR das células de glioblastoma [29]. Muitos outros estudos têm demonstrado o envolvimento da MARCKS na motilidade celular [30].

Outro gene candidato que medeia a motilidade induzida LAP2β é a IL-6, que é produzido principalmente durante a inflamação aguda e crónica. As células cancerosas que estão expostas a IL-6 ou secretam a citocina como um show fator autócrino aumentou invasão [31], [32], [33]. Além disso, a inactivação da gp130, de um transdutor de IL-6 de sinalização, a agressividade reduzida de células de cancro da mama in vivo [34]. Vários genes relacionados com a via de sinalização de IL-6, incluindo a STAT3 também estão associadas com a migração e a invasão de células cancerosas [35], [36], [37]. IL-6 é amplamente expresso em muitos cancros sólidos, incluindo próstata [38], de mama [39], pulmão [40] câncer, e glioblastoma [41].

Como pode LAP2β regular a expressão gênica? proteínas LEM-domínio foram mostrados para ser capaz de regular a expressão do gene sequestrando reguladores transcricionais para a lâmina nuclear. MAN1 se liga a regulados pelo receptor de I-Smads e antagoniza a sinalização por factor de crescimento transformante β (TGF-p), activina e proteína morfogénica do osso (BMP) [42]. deficiência MAN1 leva a defeitos de remodelação vasculares embrionárias em ratos e desenvolvimento ósseo em humanos [16], [43]. Outro exemplo é emerin ligação a p-catenina, um alvo a jusante da via de sinalização Wnt, que promove a sua saída do núcleo [44]. emerin deficiência leva à acumulação nuclear de β-catenina. LAP2β foi mostrado para interagir com HDAC3 e regulam a actividade de E2F, p53 e factores de transcrição NF-kB [5], [45]. Em estudos futuros, como LAP2β pode regular MARCKS ou IL-6 expressão merece uma investigação mais aprofundada.

O envolvimento de LAP2β na replicação foi sugerido por um estudo no qual truncado LAP2β eficiência da replicação de DNA alterada [18]. A regulação da replicação de ADN por LAP2β tem sido sugerido para ser mediada por duas vias possíveis. LAP2β pode reduzir a atividade do complexo E2F sozinho ou com células germinativas menos (GCL) [46]. A outra via é através da interacção com HA95 durante a fase G1 do ciclo celular [12]. Esta interacção com HA95 contribui para a estabilidade dos complexos prereplication. No presente estudo, knockdown de LAP2β não afectou a proliferação de células de cancro do tracto maioria dos digestivos excepto as células de cancro do pâncreas (Fig. 2). Além disso, a sobre-expressão de LAP2β não causou alteração significativa na proliferação (Fig. 2), sugerindo a regulação da proliferação por LAP2β em células de câncer do trato digestivo não é tão crítica.

superexpressão generalizado de LAP2 em vários tipos de câncer do aparelho digestivo é descrito pela primeira vez no presente estudo (Fig. 1). Expressão de LAP2β foi descrito em vários tecidos normais, incluindo a pele, timo, pulmão, testículo e ovário. No entanto, a sua expressão no trato gastrointestinal normal foi raramente detectada [47]. A sobre-expressão de LAP2β foi relatada em várias células malignas hematológicas e células de neuroblastoma [17], [48].