Abstract

A falta de imunogenicidade de células cancerosas tem sido considerada uma das principais razões para o seu fracasso na indução de um tumor de resposta específica das células T. Neste trabalho, nós apresentamos provas de que a decitabina (DAC), um inibidor de metilação de ADN que é actualmente utilizado para o tratamento de síndrome mielodisplásica (SMD), leucemia mielóide aguda (LMA) e de outros tumores malignos, é capaz de provocar um anti-tumoral de linfócitos T citotóxicos (CTL) resposta em modelo de tumor de ratinho EL4. C57BL /6 ratos com tumores EL4 estabelecidos foram tratados com DAC (1,0 mg /kg de peso corporal) uma vez por dia durante 5 dias. Nós descobrimos que o tratamento de DAC resultou na infiltração de IFN-γ produção de linfócitos T em tumores e rejeição de tumor causado. Depleção de CD8

+, mas não CD4

células T + retomou o crescimento do tumor. resposta de CTL induzida por DAC pareceu ser provocada pela indução da expressão de CD80 em células tumorais. epigenética evidência sugere que o DAC induz a expressão de CD80 em células EL4 através de desmetilação de locais de dinucleótido CpG no promotor do gene de CD80. Além disso, também mostraram que uma dose baixa de tratamento transiente, DAC pode induzir a expressão do gene de CD80 em uma variedade de células cancerosas humanas. Este estudo fornece a primeira evidência de que a modulação epigenética pode induzir a expressão de uma grande molécula de células T co-estimulador em células cancerosas, que pode ultrapassar a tolerância imune e induzir uma resposta de CTL eficaz anti-tumor. Os resultados têm implicações importantes na concepção de imunoterapia do cancro baseia-CAD

citação:. Wang L-X, Mei Z-Y, Zhou J-H, Yao Y-S, Li Y-H, Xu Y-H, et al. (2013) Dose Baixa decitabina tratamento induz a expressão de CD80 em células de cancro de tumores e estimula respostas específicas para linfócitos T citotóxicos. PLoS ONE 8 (5): e62924. doi: 10.1371 /journal.pone.0062924

editor: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Itália |

Recebido: 05 de dezembro de 2012; Aceito: 26 de março de 2013; Publicado em: 09 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Programa Nacional de Pesquisa básica da China (2005CB522400), National Natural Science Foundation da China (90919044, 30971297, 81000221 e 81170518), alta e Nova Tecnologia Programa de PLA (2010gxjs091), Capital Medical Development Fund Research Scientific (N ° 2007-2040). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Um grande desafio na imunoterapia do cancro é a evasão imune por células cancerosas [1]. Durante o desenvolvimento e progressão do tumor, os tumores construir-se uma rede de supressão imune, incluindo células mielóides associados a tumores e várias células T reguladoras [2], [3]. As células cancerosas em si são geneticamente instáveis; eles podem infra-regular moléculas de classe principal complexo de histocompatibilidade (MHC) I [4], [5] e perdem a expressão de antigénios tumorais [6], [7], [8]. Além disso, as células cancerosas normalmente não expressam moléculas-chave de co-estimuladoras, tais como CD80, mas sim expressar algumas moléculas de co-inibidor que tornam a tolerância da célula T específica de antigénio tumoral [9]. Todos estes factores prevenir a indução de uma resposta de células T eficaz para tumores. Assim, superando a evasão imune é de grande importância na imunoterapia do cancro.

epigenética evidência sugere que, em células cancerosas, algumas moléculas estimuladoras imunitárias importantes são regulados por metilação do DNA na sua região promotora. Alguns antigénios tumorais bem conhecidos, tais como antigénios do cancro do testículo (CTA) são quase exclusivamente regulada por metilação de ADN [10], [11], [12], [13], [14], [15]. De MHC de classe I e a sua maquinaria de apresentação de antigénio, também têm demonstrado ser regulada por metilação de ADN [16], [17], [18], [19]. Além de moléculas de CTA e MHC, também há evidências de que as moléculas de adesão [16], [20], tais como ICAM-1 e LFA-3, e as moléculas de co-estimulação [19], [20], tais como CD40 e CD86 pode ser regulada por metilação do DNA em células cancerosas. Assim, os agentes que podem regular a expressão de antigénios tumorais desmetilação, as moléculas de MHC de classe I, e a adesão /co-estimulador em células cancerosas devem ser úteis no aumento da imunogenicidade do tumor e a sua susceptibilidade à destruição imunitária. Na verdade, não é um corpo de evidência que sugere que o tratamento desmetilação pode aumentar drasticamente a sensibilidade das células do cancro da destruição por células T [11], [15], [17], [21]. No entanto, não há directo

in vivo

evidência de que o tratamento desmetilação de câncer leva a uma resposta específica de células T anti-tumor.

A decitabina (DAC), um agente de DNA demetilante [22], recentemente, surgiu como uma terapêutica potente para o tratamento de pré-leucémicas doença hematológica-MDS [23], [24], leucemia estabelecida [25], [26], [27] e do cancro do pulmão avançado [28]. Baixa dose de DAC pode causar efeitos anti-tumorais sustentados, mesmo após a descontinuação do tratamento [24], [29], [30], o que sugere que uma resposta imunitária activa pode ser induzida nos doentes tratados. Para determinar se o tratamento de DAC podem induzir respostas imunes anti-tumorais

In vivo

, estudou-se o efeito de uma dose baixa de tratamento DAC em ratinhos com tumores EL4 linfoma de células T estabelecidas. Nós descobrimos que o tratamento de DAC transiente e dose baixa resultou na indução de uma resposta (CTL) que a regressão do tumor mediada por linfócitos T citotóxicos anti-tumoral. resposta de CTL induzida por DAC parece ser induzida pela indução da expressão de CD80 em células EL4. Além disso, também descobrimos que uma baixa dose de tratamento transiente, DAC pode induzir a expressão do gene de CD80 em uma variedade de células cancerosas humanas. Este estudo fornece a primeira evidência de que a modulação epigenética pode induzir a expressão de uma grande molécula de células T co-estimulador em células cancerosas, que pode ultrapassar a tolerância imune e induzir uma resposta de CTL eficaz anti-tumor.

Métodos

Mice

C57BL /6 e CBF1 ratos foram adquiridos a partir de Pequim Vital-River Lab animal Technology Co. Ltd. camundongos C57BL /6 estirpe cong�icas B6.SJL-Ptprc

a PEPC

b /Boy-M (CD45.1

+) foram fornecidos pelo Dr. Chunfeng Qu (Estado Key Laboratório de Oncologia Molecular, Cancer Institute /Hospital, Academia chinesa de Ciências Médicas, Beijing, China). Todos os ratos foram mantidos a Chinese PLA General Hospital (CPGH) em condições específicas livres de patógenos. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e institucionais para cuidados com os animais e foram aprovados pelo uso e tratamento dos animais comissão, CPGH.

cultura de células e EL4 Subclone estabelecimento

Todas as linhas celulares foram originalmente obtidas da American Type Culture Collection (ATCC). células EL4 (células T linfoma /linha celular de leucemia do rato) foram cultivadas e mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro de equino inactivado pelo calor (Hyclone), 100 ug /ml de penicilina /estreptomicina e L-glutamina. As células foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2. subclones EL4 foram estabelecidos utilizando diluição limitante em placas de 96 poços de cultura de tecidos de fundo redondo com base na expressão de CD80. Dois subclones EL4, isto é EL4 C45 com elevada expressão de CD80, e EL4 C3 com nenhuma expressão de CD80, foram usados ​​para este estudo. A K562 (linha de células derivada de um doente com leucemia mielóide crónica em crise explosão) linhas celulares de leucemia humana, U937 (leucemia mielóide aguda, M5), THP-1 (leucemia mielóide aguda, M5), NB4 (leucemia mielóide aguda, M3) , Kasumi-1 (leucemia mielóide aguda, M2), Molt-4 (T-células de leucemia linfoblástica aguda), Hut 78 (linfoma de células T) e Raji (linfoma de Burkitt) foram cultivadas e mantidas em meio RPMI-1640 (Hyclone) médio suplementado com 10% de soro fetal de bovino.

in vitro e in vivo Tratamento com decitabina

Decitabina (DAC, Xian-Janssen pharmaceuticals Ltd, China) foi dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4) para se obter 100 uM existências e armazenado a -20 ° C. Para

in vitro

estudos, DAC foi adicionado ao meio de cultura celular a uma concentração final de 0,25 | iM durante 72 horas. A mesma concentração de citidina (Sigma) em PBS ou apenas PBS foi adicionado às células como o tratamento de controle. 24 horas após o tratamento as células foram recolhidas para um estudo mais aprofundado. Para

In vivo

estudos usando CAD, os ratinhos com tumores estabelecidos EL4 foram injectados com DAC (1,0 mg /kg de peso corporal em 200 ul de PBS) ou PBS i.p. uma vez por dia durante 5 dias consecutivos. Os ratinhos foram sacrificados 7-10 dias após a conclusão do tratamento com fármaco e os tumores excisados ​​foram processadas para análise de linfócitos infiltrados no tumor (TIL).

transcrição reversa-PCR (RT-PCR)

O ARN total extraiu-se a partir do DAC-tratadas ou células EL4 tratados com veículo e outras células de leucemia e linfoma humano, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. RT foi realizada utilizando Transcrição Reversa Sistema (Promega) em 1 ug de ARN total, e amplificações de PCR foram, em seguida, realizada utilizando os iniciadores apresentados na Tabela 1.Simultaneous amplificação de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase gene (GAPDH), utilizando os iniciadores para rato (para a frente 5 ‘-GATGCCCCCATGTTTGT-3′; reversa 5’- CCGTTCAGCTCTGGGATGA -3 ‘) e humanos (forward 5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′; reversa 5’- TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 ‘) foi usado como um controlo interno para a quantidade e integridade do ARN analisado. Todos os produtos de PCR foram resolvidos em gel de agarose e visualizado usando brometo de etídio.

PCR em tempo real

Real-time PCR foi realizada utilizando um sistema de seqüência 7900-HT ABI (PEApplied Biosystems , Carlsbad, CA, EUA) utilizando as condições anteriormente determinadas [31]. kit SYBR Premix Ex Taq PCR (Takara Bio, Inc.) e os mesmos iniciadores utilizados para RT-PCR foram utilizados para amplificar P1A rato, Mela, Magea4, CD80, CD79b, CD74, CD48, CD300a, CD3eap, CD274, CD247, CD180 e os genes de GAPDH. Cada amostra foi ensaiada em triplicado e as experiências foram repetidas duas vezes. A quantidade relativa de ARNm foi calculada representando graficamente o Ct (número de ciclos), e a expressão relativa média para cada grupo foi determinada usando o método comparativo (2

– △△ Ct).

Tumorigênese

ratinhos C57BL6 foram injectados com várias doses (na maioria das vezes usando 1 × 10

4 células /rato, SC) de células EL4 DAC-tratados ou controle. Os volumes dos tumores foram medidos como AB

2/2 (a = comprimento; b = largura) a cada dois ou três dias. Para induzir a leucemia do rato, os ratos foram injectados com 2 × 10

4 células EL4 /ratinho IV

in vivo de CD8 + e de CD4 + T celular Depleção

ratinhos C57BL /6 foram injectados com 400 ug de anti-CD4 (clone GK 1.5; BioXcell, NH, EUA) ou anti-CD8 (clone 53-6,72; BioXcell, NH, EUA) anticorpos monoclonais ip a cada 4 dias imediatamente após o tratamento com DAC. Os ratinhos de controlo foram tratados com IgG2b de rato purificado ou IgG2a, respectivamente (BioXcell, NH, EUA). Os efeitos de depleção foi avaliada no ponto final da experiência por coloração de células do baço e do tumor para CD4 e CD8 utilizando mAb anti-CD8 (5H10-1) (eBioscience) anti-CD4 (RM4.4) e, seguido de análise de citometria de fluxo .

Os anticorpos e análise citométrica de fluxo

Todos os anticorpos utilizados foram adquiridos a BD Biosciences (San Diego, CA) ou eBioscience (San Diego, CA). Para a coloração de marcadores de superfície celular, as células (células de cancro, os esplenócitos e as suspensões de células únicas de tumores) foram coradas com anticorpos (FITC, PE, ou APC- Percp- marcado a CD80, CD4, CD8a, CD3, NK1.1, IFN -γ, e anticorpos de controlo de isotipo) em tampão de coloração (PBS com 1% de FCS) em gelo durante 30 min. As células foram fixadas em paraformaldeído a 1% em PBS. Para a detecção de citocinas intracelulares, as células foram estimuladas

In vitro

com PMA (100 ng /ml) e ionomicina (1000 ng /ml) durante 5 h. Golgi

Stop (BD Pharmingen, EUA) foi adicionado (1/1500) durante o último 2 h de incubação. As células foram primeiramente coradas para os marcadores da superfície celular, tais como CD4 ou CD8, seguido de um procedimento de coloração de citocinas intracelulares padrão para o IFN-γ. As células foram recolhidas utilizando um FACSCalibur® citometria de fluxo e os dados foram analisados ​​utilizando o software FlowJo (Árvore Star, Inc., OR).

Gene Expression Microarray Análise

O RNA total foi extraído de DAC- tratadas e células EL4, tratados com veículo, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. ADNc marcada com um corante fluorescente (Cy5 e Cy3-dCTP) foi gerado utilizando ARNc CapitalBio amplificação e kit de marcação (CapitalBio, Pequim, China). SmartArray (CapitalBio, Beijing, China) chips contendo cerca de 25 mil genes de rato foram hibridizadas com sondas de cDNA marcadas em um sistema GeneChip. Arrays foram digitalizadas com um scanner LuxScan ™ confocal e as imagens obtidas foram então analisados ​​usando o software LuxScan ™ 3.0 (ambos de CapitalBio, Beijing, China). Análise de significância de Microarrays (SAM) foi realizada para determinar os genes diferencialmente expressos

Bissulfito Sequencing

O estado de metilação dos dinucleótidos CpG dentro de duas regiões (oligo 1:. Nucleotídeos -792 a -335, oligo2: nucleótidos -151 a +258), em relação à extremidade 5 ‘do gene de CD80, foi analisado. O DNA genômico foi preparado a partir de EL4 subclones EL4 C3 (CD80

-) e EL4 C45 (CD80

+), veículo ou células EL4 tratados com DAC usando o Assistente de Genomic DNA Purification Kit (Promega Inc, EUA). Para subclonagem e sequenciação dos alelos individuais, ADN genómico bissulfito-tratado foi amplificado utilizando o kit bisulfit Epitect (Qiagen, Alemanha), utilizando os seguintes pares de iniciadores: um fragmento (directo 5′-GGGTATTTTTTTAAAAGAAGAGA-3 ‘; reverso 5’-3-AATCCTACAAAAACATCAATCAAC ‘), o fragmento 2 (para a frente GGTTGGGTGGGAATTATTTTATT 5′-3′; 5’-ACTTAAACACCTCCTAAACTCACA inverter-3 ‘)

os produtos de PCR foram purificados em gel e clonado no vector pGEM-T (Promega Inc, EUA. ). Os fragmentos de PCR inseridos de clones individuais foram sequenciados utilizando um sequenciador ABI PRISMDNA (Applied Biosystems, EUA).

reacção linfocitária mista e CD80 Blockade

células T colhidas a partir de baço e linfonodos de EL4- ratinhos BALB /c imunizados foram utilizados como células de resposta. DAC ou células EL4 irradiadas tratadas com o veículo com raios X (14 Gy) foram utilizadas como células estimuladoras. As células respondedoras e estimuladoras células foram incubadas em placas de 96 poços, numa proporção de 08:01, 04:01, 02:01 e 01:01, e cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2 durante 6 dias. proliferação de células T foi avaliada com Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumomoto, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, após incubação durante 6 dias a 37 ° C, 10 mL de água de sal de tetrazólio solúvel (WST) -8 foi adicionada a cada poço, e as células foram incubadas durante mais 4 a 6 horas a 37 ° C. A absorvância da amostra a 450 nm foi medida. Para o bloqueio de CD80, anti-CD80 (16-10A1, eBioscience, San Diego, CA) ou um isotipo de controlo IgG de correspondência, (eBioscience, San Diego, CA) foram adicionados a poços de co-cultura, a uma concentração final de 5 ug /ml .

IL-2 e IFN-γ ELISA

Os sobrenadantes de culturas mistas foram colhidas 72 h após a co-cultura e foram analisados ​​para IL-2 e IFN-y usando estojos ELISA (eBiosciences, San Diego, CA).

Estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., EUA). teste t de Student foi utilizado para comparar as diferenças de volume tumoral entre dois grupos. Para efeito de comparação da sobrevivência rato, foi utilizado o teste de análise de sobrevivência e log-rank Kaplan-Meier. A

P

valor menor que 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

DAC Tratamento Inibe EL4 celular Tumorigênese e leva a regressão de tumores estabelecidos em camundongos C57BL /6

para testar se o tratamento de DAC afecta a tumorigenicidade de células de cancro em ratinhos, células EL4 foram tratados quer com DAC (0,25 uM) ou citidina (0,25 mM) ou veículo (PBS) durante 72 horas. Foram incluídos citidina como um agente de controlo desde DAC é o análogo de citidina. Além disso, um estudo anterior revelou que os nucleótidos tratamento (timidina) é tóxico para as células EL4 [32]. As células viáveis ​​EL4 dos tratamentos acima mencionados foram então injectados ratinhos C57BL /6 subcutaneamente (s.c.) a um número de 1 × 10

4 células /ratinho. Neste número, citidina e células EL4 tratados com veículo formado tumores em todos os ratos injectados e cresceu progressivamente; Em contraste, tumores não foram formados em ratinhos que receberam células EL4-tratados DAC (Figura 1A). tumores EL4 foram estabelecidos em ratinhos C57BL /6 foram utilizados apenas quando um número muito elevado de células EL4-tratados DAC (8-16 doses vezes mais elevadas) (Figura 1B). A injecção intravenosa de células EL4 tratados com veículo (1 × 10

4 células /rato), levou ao desenvolvimento de leucemia induzida por EL4 em murganhos CBF1 e morte causados ​​da maioria dos ratinhos; Em contraste, não há ratinhos que receberam este número de células EL4-CAD tratados morreram de leucemia (Figura 1C). Para testar se

em

injecção in vivo

de DAC poderia inibir o crescimento de tumores estabelecidos, células EL4 foram injectadas em ratinhos C57BL /6 s.c. Quando os tumores cresceram até um tamanho de cerca de 5 × 6 mm, estes ratinhos foram tratados com PBS i.p. ou DAC diariamente durante 5 dias consecutivos. Em contraste com o crescimento tumoral progressivo em ratinhos tratados com veículo, o tratamento de DAC causou a regressão do tumor contínuo, mesmo após o tratamento de DAC foi interrompido (Figura 1D). células EL4 Assim, DAC-tratados demonstram a capacidade reduzida em tumorigénese, e tratamento transiente DAC de ratinhos com tumores estabelecidos leva à regressão do tumor contínuo.

células EL4 (A) foram tratados com DAC (0,25 uM em meio de cultura) ou citidina ou PBS durante 72 h. As células foram então injectado em cada rato s.c. a uma dose de 1 × 10

4 células /ratinho. O tamanho do tumor foi medido em duas direcções a cada dois ou três dias. O volume do tumor foi calculado utilizando uma fórmula: volume = (L x W

2) /2, onde L = comprimento; W = largura. *

P

0,05 quando DAC-tratamento é comparado com PBS ou tratamento citidina. Cinco a seis ratos foram usados ​​em cada grupo e os dados foram reunidos a partir de duas experiências. (B) As células EL4 tratados com DAC foram injectadas em ratinhos C57BL /6 ratos s.c. a uma dose de 1 × 10

4 células /rato (G1), 8 × 10

4 células /rato (G2) ou 16 × 10

4 células /rato (G3). PBS-tratados células EL4 (1 × 10

4 células /ratinho) serviu como controle. dados de sobrevivência do ratinho é mostrada. Cinco ratinhos foram incluídos em cada grupo e os dados apresentados são representativos de três experiências independentes. (C) ou PBS-tratados células EL4 tratados com DAC foram injectadas em cada rato i.v. a uma dose de 1 × 10

4 células /ratinho. sobrevivência do ratinho foi monitorizada até 100 dias após a injecção das células tumorais. Foram utilizados dez ratinhos por grupo, e os dados apresentados são representativos de três experiências independentes. (D) Os ratinhos com tumores EL4 estabelecidos foram tratados com PBS i.p. ou DAC durante 5 dias consecutivos, começando no dia 10. Os dados apresentados são representativos de três experiências. Os asteriscos indicam significância estatística de

P

. 0,05

Respostas de CTL DAC Tratamento Induz Anti-tumorais

O fato de que o tratamento DAC transitória resultou em tumor persistente regressão sugere que o tratamento de DAC pode ter induzido respostas imunes antitumorais. Para testar esta possibilidade, ratinhos C57BL /6 com tumores EL4 estabelecidos foram tratados com DAC, como descrito acima (Figura 1D). Sete a dez dias mais tarde, os ratinhos foram sacrificados, e as células mononucleares a partir de tumores foram coradas para CD4, CD8 e NK1.1 /CD3, seguido por análise de citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 2A, os tumores de ratos tratados com DAC tinham aumentos significativos nos números de células T CD8

+ e CD4

+ células T, em comparação com os tumores de ratos tratados com veículo; NK1.1

+ CD3

– células NK foram dificilmente detectável em tumores de ratos tratados com DAC e PBS-tratados (figura 2A, B). Os tumores de ratos tratados com DAC continham números mais elevados de IFN-γ produtoras de células T CD8 + em comparação com os tumores de ratos tratados com veículo (Figura 2C, D). Para determinar se o aumento das respostas de células T foram responsáveis ​​pela regressão tumoral induzida por DAC, ratinhos C57BL /6 com tumores EL4 estabelecidos tratados com DAC também foram tratados com anticorpos anti-CD4 seus anticorpos de controlo relativos anti-CD8 ou ou i.p. tratamento com anti-CD4 ou anti-CD8 resultou em depleção completa de células T CD8

+ ou CD4

+ células de baço e tumores (Figura 3A, C). Depleção de CD8

+ células T (Figura 3B), mas não células CD4 +

T (Figura 3D), resultou no crescimento do tumor mais agressivo em ratos de outra forma protegidas. Assim, o tratamento de DAC de ratinhos com tumores estabelecidos induzida CD8

imunidade anti-tumoral mediada por células T +.

(A-B) ratinhos C57BL /6 com tumores EL4 estabelecidos foram tratados com DAC (1 mg /kg de peso corporal) ou PBS uma vez por dia durante 5 dias consecutivos. 7-10 dias após o tratamento, os ratinhos foram sacrificados, os tumores foram colhidos, dissociados e as células tumorais foram coradas para a expressão de diferentes marcadores da superfície celular, seguido por citometria de fluxo para quantificação CD8

+, CD4

+ e NK1. 1

+ CD3

– células. A análise por citometria de (C) de fluxo e quantificação da produção de IFN-γ intracelular por tumores infiltrantes CD8

+ células T. Barras representam a média + SD; N = 3-7 ratinhos por grupo. (D) citometria de fluxo e produção de IFN-γ intracelular por tumor infiltrando CD4

células + T. Barras representam a média + SD; N = 3-7 ratinhos por grupo. O teste t de Student foi utilizado para a análise estatística. Os números nas figuras indicam citometria de fluxo de células positivas% correspondente a cada porta.

Quatro doses de anti-CD8 ou anti-CD4 (400 ug /por ratinho, ip) foram injectados a intervalos de 4 dias começando no dia 1 após o tratamento DAC. Três ratos por grupo foram utilizados para a experiência mostrada. (A) células CD8

+ T em baços e os tumores foram analisadas por citometria de fluxo depois de anticorpo anti-CD8 ou um tratamento de anticorpo de controlo de isotipo igualado. (B) O crescimento do tumor em ratinhos tratados com um mAb de controlo de isotipo igualado a seguir à administração do DAC ou anti-CD8. Os dados são representativos de duas experiências independentes, com resultados semelhantes. Os asteriscos indicam significância estatística de

P Art 0,05. células (C) CD4

+ T em baços e os tumores foram analisadas por citometria de fluxo depois de anticorpo anti-CD4 ou um tratamento de anticorpo de controlo de isotipo igualado. (D) O crescimento do tumor de ratos tratados com um mAb de controlo de isotipo igualado a seguir à administração DAC anti-CD4 ou. Os dados são representativos de duas experiências independentes, com resultados semelhantes. Os números em números de citometria de fluxo indicam células positivas% correspondente a cada portão.

DAC tratamento induz a CD80 Expressão em Células Tumorais

Desde DAC tratamento induziu respostas CTL em tumores EL4, a hipótese de que tratamento de DAC pode sobre-regular moléculas imunoestimulantes presentes em células EL4, que podem estimular respostas de CTL em ratinhos imunocompetentes. Estudos anteriores relataram a sobre-regulação de moléculas MHC classe e antígenos tumorais por agentes Desmetilantes [11], [17]. No entanto, não conseguimos detectar a sobre-regulação de MHC de classe I e moléculas de classe II em células EL4-tratados DAC (dados não mostrados). Para explorar melhor os mecanismos de imunidade tumoral induzida por DAC, comparou-se a expressão diferencial de genes em células EL4 tratados com DAC e controlos, utilizando análises de cDNA microarray (GEO adesão # GSE38473) e verificaram que o tratamento de DAC alterou significativamente a expressão do gene de perfil em EL4 células em comparação com o tratamento com veículo (Figura S1A). Um total de 847 genes regulados positivamente foram identificados em células EL4 tratados com CAD, usando a análise de SAM (Figura S1B). Entre os genes regulados positivamente em células EL4-CAD tratados, 3 de cancro antigénios testículo e 9 aglomerado de moléculas de diferenciação (CD), incluindo CD80 (B7-1), uma molécula essencial co-estimuladora de células T, foram identificados (Figura 4A). RT-PCR e qRT-PCR também verificada a sua sobre-regulação (Figura 4B e 4C).

O rato fichas SmartArray foram hibridadas com RNA derivado do DAC ou tratados com PBS as células EL4. (A) Heatmap de alguns genes regulados positivamente por tratamento DAC. As colunas representam dados de microarranjos obtidos a partir de 3 repetições biológicas independentes. (B) RT-PCR foi utilizado para validar os genes regulados. (C) qRT-PCR foi utilizada para quantificar os genes regulados positivamente no DAC e tratados com PBS as células EL4.

Para determinar a persistência e a estabilidade da expressão de CD80 induzida DAC-, células EL4 foram cultivadas em meio de contendo DAC (0,25 uM) ou PBS por 72 horas. expressão de CD80 induzida por DAC em células EL4 foi verificada em ambos os ARNm (Figura 5A) e o nível de proteína (Figura 5B). A análise cinética revelou que a expressão de CD80 atingiu um pico de 3-5 dias após o tratamento de DAC, e foi mantida a níveis significativos durante cerca de 3 semanas e depois diminuiu para o nível de base (Figura 5C). Para testar se o tratamento DAC pode induzir a expressão de CD80

in vivo,

células EL4 (CD45.2

+) foram injectados s.c. em ratinhos C57BL /6 ou i.v. em ratinhos congénicos CD45.1. Duas semanas mais tarde, os ratinhos foram tratados com DAC (1 mg /kg de peso corporal, i.p.) durante 5 dias consecutivos. Sete a 10 dias mais tarde as células tumorais a partir de DAC- e ratos tratados com veículo foram examinados para a expressão de CD80. tratamento DAC significativamente up-regulada a expressão de CD80 em células EL4 de s.c. tumores (Figura 5D, painel da esquerda), bem como em células EL4 de medula óssea (Figura 5D, painel da direita). Para determinar se a supra-regulação induzida pelo DAC de CD80 é um fenómeno geral, 6 linhas de células de leucemia humana e 2 linhas de células de linfoma humano foram tratados com DAC (1 uM durante 72 horas), seguido por análise de RT-PCR. Quatro de 5 linhas de células CD80-negativas (U937, THP-1, NB4 e Molt-4) mostrou a expressão de CD80 induzida por DAC, enquanto que em três linhas de células com expressão pré-existente do gene CD80 (K562, HUT-78 e Raji) , o efeito de indução não foi evidente (Figura 5E).

células EL4 (a) foram tratados com DAC (0,25 uM) ou PBS durante 72 h. RT-PCR foi utilizado para detectar a expressão do gene de CD80 em CAD e tratados com PBS as células EL4. O gene GAPDH foi amplificado simultaneamente como um controlo de carga. (B) análise de citometria de fluxo de expressão de CD80 em CAD-tratados e tratados PBS células EL4. células (C) EL4 foram tratados com DAC e PBS durante 3 dias consecutivos e foram mantidas em cultura. As células foram recolhidas de dois em dois dias e coradas com anti-CD80 seguido por análise de citometria de fluxo. células (D) EL4 (CD45.2), foram injectados s.c. em ratinhos C57BL /6 ou i.v. em CD45.1 congénica ratinhos C57BL /6. DAC foi administrado i.p. 2 semanas mais tarde, durante 5 dias consecutivos. células EL4 de tumores dissociados (painel esquerdo) e medula óssea (BM) (painel da direita) foram analisados ​​para a expressão de CD80 por citometria de fluxo. (E) A indução da expressão de CD80 em linhas celulares de cancro humano. As células cancerígenas foram tratados com DAC (0,25 uM) ou PBS durante 72 h. RT-PCR foi utilizada para determinar a expressão do gene de CD80. Os números em números de citometria de fluxo indicam células positivas% correspondente a cada portão.

CAD Induz Desmetila�o da região promotora em CD80 Gene

Para determinar o mecanismo subjacente pelo qual DAC induz a expressão de CD80 em células EL4, analisou-se a sequência da região promotora de CD80 murino. Não houve ilhas CpG típicos na região do promotor de CD80. No entanto, 14 dinucleótidos CpG foram encontrados em Exon1 e sua região a montante de 800 pb (Figura 6A). Dois pares de iniciadores foram concebidos para a análise de sequenciação de bissulfito de dois fragmentos que abrangem nucleótidos -792 a -335 (F1), e de nucleótidos -151 a +258 (F2). Em primeiro lugar, em relação ao estado de metilação dos dinucleótidos CpG nas dois fragmentos a partir de dois subclones de EL4 com ou sem expressão natural de CD80 (Figura 6B). Na F1, 96% dos dinucleótidos CpG foram metilados em CD80

– células contra 67% em CD80

+ células. Em F2, 92% dos dinucleótidos CpG foram metilados em CD80

– células em comparação com 6% no CD80

+ células (Figura 6c). tratamento de DAC de células EL4, causou um aumento significativo nos locais de desmetilação em ambos F1 e F2 regiões (Figura 6D). Entre as células EL4 tratados com DAC, CD80

+ células exibiram mais sites desmetilação comparação com CD80 tratadas DAC

– células (Figura 6E). Assim, a expressão do gene de CD80 em células EL4 está intimamente associado com o estado de desmetilação sua região promotora e tratamento de DAC aumenta significativamente a desmetilação do promotor de CD80.

(A) A distribuição dos dinucleótidos CpG numa região 1 kb a montante de exão 1 do gene CD80. Os números referem-se à posição relativa da extremidade 5 ‘de CD80. Foram selecionados dois CpG enriquecidos regiões (F1 e F2) para análise de seqüenciamento bissulfito. (B) Fluxo de análise de citometria de expressão CD80 em duas variantes EL4 (EL4C3 e EL4C45). Os números nas figuras indicam citometria de fluxo de células positivas% correspondentes a cada porta. (C) Bissulfito sequenciação da região promotora de CD80 em EL4C45 (painel superior) e EL4C3 (painel inferior). Os círculos abertos e a cheio representam desmetilado e locais CpG metilados, respectivamente. A frequência de metilação de CpG em locais de cada linha de célula é indicada. (D) A análise de sequenciação da região promotora Bissulfito de CD80 em células EL4 DAC- e tratados com PBS. células (E) EL4 foram primeiro tratados com DAC ou PBS, CD80

+ e CD80

– células EL4 foram então classificadas segundo fluxo de triagem baseada em citometria. seqüenciamento bissulfito foi realizada em DAC-tratada, CD80

+ e CD80

-. células EL4

induzida pelo DAC Expressão CD80 em células EL4 Aciona Anti-tumor resposta CTL

para determinar se a expressão de CD80 induzida por DAC em células EL4 desencadeia respostas de CTL anti-tumorais, células EL4 foram co-cultivadas com DAC durante 72 h. CD80

+ e CD80

– células EL4 foram então separadas usando fluxo baseado em citometria de alta velocidade triagem para obter CD80 altamente purificada

+ e CD80

– células EL4 (Figura 7A). Estas células foram subsequentemente injectados em ratinhos C57BL /6 (2 × 10

4 células /rato s.c.). Todos os ratinhos que receberam a CD80

– células EL4 cresceram tumores, enquanto a maioria (60-80%) dos ratinhos que receberam a CD80-tratada DAC

+ células EL4 não conseguiu crescer tumor. Em alguns casos, CD80

+ tumores EL4 cresceu de forma transiente ou cresceram mais tarde (Figura 7B). CD80

tumores + EL4 continha números muito mais altos de CD8

+ e CD4

+ células T (Figura 7C-E) em comparação com CD80

– tumores EL4. NK1.1

+ CD3

– células NK foram detectados apenas em alguns casos de CD80

+ tumores EL4 mas não em CD80

– tumores EL4 (Figura 7C, F). expressão CD80 Assim, induzida pelo DAC desencadeia imunidade anti-tumor

in vivo

.

células EL4 (A) foram tratados com DAC. CD80

+ e CD80

– células EL4 foram separados por fluxo de triagem baseada em citometria. Análise citométrica de fluxo de expressão de CD80 em células EL4 antes e após separação é mostrado. cinética (B) de crescimento tumoral de CD80-tratados DAC

+ e CD80

– células EL4. 2 × 10

4 CD80

+ ou CD80

– s.c. células EL4 tratados com DAC foram injetados em cada rato. O crescimento do tumor em ratinho individual é mostrado. (C) citometria de fluxo de células T e infiltração de células NK em CD80

+ e CD80

– tumores. As suspensões de células individuais de tumores foram coradas para CD4, CD8, CD3, NK1.1 seguido por análise de citometria de fluxo.