Abstract

mutações germinativas de

FH

, o gene que codifica para o TCA do ácido tricarboxílico (TCA) hidratase enzima ciclo de fumarato, estão associados a uma forma hereditária de câncer conhecido como hereditária leiomiomatose e renal Cancer Cell (HLRCC). Indivíduos com HLRCC estão predispostos para o desenvolvimento de carcinoma de células renais e altamente maligna letal (RCC). Os mecanismos de tumorigênese propostas foram amplamente focada nas conseqüências bioquímicas da perda de atividade enzimática FH. Embora a perda do gene supressor de tumor

von Hippel Lindau

(

BVS

) é pensado para ser um evento inicial para a maioria dos CCRs, um papel para

FH

em esporádica cancro renal não tem sido explorado. Aqui nós relatamos que o ARNm de FH e expressão da proteína são reduzidas em câncer renal de células claras, a variante histológica mais comum de câncer de rim. Além disso, demonstra-se que reduziu

FH

leva à acumulação de hipóxia indutível factor 2α (HIF-2α), um factor de transcrição conhecido como promovendo a carcinogénese renal. Finalmente, foi demonstrado que a sobre-expressão de FH em células de cancro renal inibe a migração celular e invasão. Estes dados fornecem novos insights sobre as funções supressoras de tumor de FH em câncer de rim esporádico

Citation:. Sudarshan S, Shanmugasundaram K, Naylor SL, Lin S, Livi CB, O’Neill CF, et al. (2011) a expressão reduzida de Fumarato hidratase em Clear Cancer Cell Renal Medeia HIF-2α Acumulação e promove a migração e invasão. PLoS ONE 6 (6): e21037. doi: 10.1371 /journal.pone.0021037

editor: Marcelo G. Bonini, da Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Janeiro, 2011; Aceito: 17 de maio de 2011; Publicação: 14 de junho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Sudarshan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela Terapia e Centro de Pesquisa do Câncer (CTRC) da Universidade do Texas Health Science Center (Institutos Nacionais de CA054174-17 P30 Saúde). SS é suportado pelo NIH K08 CA138774, Voelcker Young Investigator Award Fundo, AUA Foundation /Astellas Rising Star Award, e um presente especial do Sr. Charles bumbum e os funcionários do HEB. SLN é suportado pelo CA86402 CTRC e NIH U01. LZS é suportado pelo NIH R01 CA079683. KB é suportada pelo Veterans Administration Prémio Carreira de Desenvolvimento (CDA-2) e NIH R01 NCI CA131272. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Em 2010, mais de 57.000 homens e mulheres serão diagnosticadas com carcinoma de células renais (RCC) e 13.000 pessoas morrerão desta doença [1]. Embora a sobrevivência de doentes com doença localizada é alta, os pacientes com doença avançada enfrentam um mau prognóstico, apesar de agentes direcionados recentemente introduzidos. Embora a perda do

von Hippel Lindau

(

BVS) gene supressor de tumor é pensado para ser um evento inicial para a maioria dos CCRs [2], pouco se sabe sobre os eventos genéticos subsequentes e sua respectivo impacto na tumorigênese. Elucidação destas vias vai identificar novos alvos terapêuticos, bem como facilitar o desenvolvimento de biomarcadores que podem ter tanto significado diagnóstico e prognóstico.

mutações germinativas de

FH

estão associados com uma forma hereditária de câncer renal se refere como hereditária Leiomiomatose e câncer de células renais (HLRCC) [3], [4].

FH

codifica o ciclo do ácido tricarboxílico hidratase enzima fumarato (também referido como fumarase) que catalisa a hidratação do fumarato de modo a formar o malato. Indivíduos com HLRCC estão predispostos para o desenvolvimento de leiomiomas do útero e pele, além de RCC altamente maligno e letal. Os mecanismos de tumorigênese propostas foram amplamente focada nas conseqüências bioquímicas da perda de atividade enzimática FH. Tem sido proposto que a perda de HF leva à acumulação de fumarato e promove um estado em que pseudohypoxic vias de resposta a hipoxia são aberrantemente activadas, apesar das condições de normóxia [5]. Fumarato tem sido mostrado para inibir a hidroxilação de prolina da hipoxia factores indutíveis HIF-1α e HIF-2α que são catalisados ​​por uma família de enzimas referidas como as hidroxilases HIF prolil (DPSs) [5]. Na sua forma unhydroxylated, HIFαs evitar o reconhecimento pelo ubiquitina ligase E3 BVS (que tem como alvo estas proteínas para degradação proteossomal) e são assim estabilizados [6], [7], [8], [9]. Sob estas condições ambos os HIF-1α ou HIF-2α são capazes de heterodimerizar com a proteína HIF-1β constitutivamente expresso, também referido como ARNT (recentemente revisto [10]). Este heterocomplexo é capaz de transcrição activar vários genes, incluindo

VEGF

e outros factores de crescimento que podem ser pró-tumorigénico quando desregulado. Pseudohypoxia também tem sido implicado na variante mais comum de RCC, carcinoma de células claras (ccRCC), em que a perda de

BVS

é um evento genética comum [11]. Como esperado, os níveis elevados de HIF-1α e /ou HIF-2α são observadas em cancros renais celulares claro [12], [13]. Curiosamente, várias linhas de evidência indicam que o HIF-2α em oposição a HIF-1α, é crítico para a formação e /ou a progressão [14] RCC, [15], [16].

Enquanto

BVS

perda é claramente crítica para a estabilização de HIF-2α, mecanismos alternativos, para além da prevenção da degradação, podem desempenhar um papel na manutenção de HIF-2α em cancro renal. Os trabalhos anteriores por bloco

et al.

estabelecido um papel para espécies reactivas de oxigénio (ROS) gerados por oxidases NADPH na manutenção da expressão da proteína HIF-2α através de um mecanismo de mRNA translacional dependente de AKT em células da BVS com deficiência [17] . Além disso, a mTOR sinalização complexo 2 (mTORC2), um activador conhecido de sinalização AKT, foi mostrado para promover a acumulação de HIF-2α

VHL

células de carcinoma renal nulos [18]. Mais recentemente, o tratamento de células RCC com um duplo inibidor de PI3K /mTOR suprimiu a expressão de HIF-2α [19]. Estes dados apoiam a noção de que a síntese de HIF-2α contínua é crítica para a manutenção deste factor de transcrição oncogénica em células de cancro renal.

FH

mutações têm sido principalmente ligada à papilar tipo II cancro renal , uma variante histológica que representa menos de 10% de todos os cânceres renais [20].

FH

mutações não foram identificados no câncer renal de células claras esporádica. No entanto, um relatório recente ligou

FH

para o desenvolvimento de câncer renal de células claras em um paciente com uma mutação germinativa de

FH

[21]. Até à data, a expressão ea função do

FH

em ccRCC não tenha examinado. Por isso, investigamos o papel da FH em câncer renal de células claras esporádica.

Resultados

redução da expressão de FH em células claras carcinoma renal

expressão FH em ccRCC ainda tem que ser explorado. Portanto, primeiro analisou a expressão da proteína de FH em um painel de tumores renais de células claras humanos e parênquima renal normal pareados por paciente. A análise de imunotransferência de lisados ​​de tecido demonstraram uma redução marcada dos níveis de proteína SF nos tumores, em comparação com o tecido normal adjacente (Figura 1A). Para confirmar os nossos resultados, foi realizada a coloração imuno-histoquímica para FH em pacientes combinado tumorais pares /normal. Estes resultados correlacionam com os resultados de imunotransferência em que a coloração era menos de FH nos tumores em relação ao controlo de tecido renal (Figura 1B). A seguir, examinou os níveis de proteína FH num painel de linhas celulares estabelecidas ccRCC (786-O, A498, RCC4, e ACHN). Todas as linhas de células cultivadas demonstrou níveis de proteína FH reduzida relativamente ao rim normal (Figura 1C). Em seguida, examinaram os níveis de expressão de mRNA

FH

no tecido tumoral quando comparado ao tecido renal normal pareados por paciente em espécimes da Rede Human Tissue Cooperative (NCI). Quantitativa em tempo real de RT-PCR demonstraram uma redução

FH

os níveis de mRNA no tecido do tumor, em comparação com tecido normal (Figura 2). A análise dos níveis de ARNm revela que mais de 70% das amostras de tumor demonstraram uma redução

FH

níveis de ARNm em relação ao parênquima renal combinado normal. Além disso, 15/32 amostras de doentes (47%) demonstrou uma maior do que duas vezes na redução

FH

níveis de ARNm em amostras tumorais em relação ao controlo normal. No geral, a redução média da

FH

níveis de mRNA foi de 2,9 vezes. Esta diferença foi determinada como sendo estatisticamente significativa. Estes resultados demonstram reduzida expressão de

FH

nos níveis de mRNA e proteína em ccRCC.

A) A proteína foi isolada a partir de amostras claras de célula (CC) tumor (T) Além renal normal combinado parênquima (N). As proteínas foram imunotransferidas para os níveis de proteína FH. imunotransferência GAPDH é incluída como um controlo de carga. B) coloração imuno-histoquímica para FH foi realizada em tumores pares pareados por paciente /normal. As imagens foram obtidas com uma lente objetiva de 40 ×. C) os níveis de proteína FH em linhas RCC em relação ao rim normal. A actina é incluída como um controlo de carga.

os níveis de ARNm de

FH

foram determinados num conjunto separado de amostras de tumor em relação ao paciente parênquima renal normal combinado com o tempo real de RT-PCR ( p = 0,004). Os níveis de expressão foram normalizados para 18 s rRNA níveis antes da análise comparativa.

FH modula os níveis de HIF-2α

Altos níveis de fumarato no CCR-FH deficiente desempenhar um papel na estabilização de HIF a expressão da proteína -2α através da inibição da actividade de hidroxilase de prolina evitando assim o reconhecimento de VHL. Com base nestes dados, temos a hipótese de que a perda de FH deve ter nenhum impacto sobre os níveis de proteína HIF no

BVS

linhas celulares nulos. No entanto, descobrimos que o knockdown de siRNA-mediada de FH resultou num aumento dos níveis de proteína HIF-2α em duas linhas que são ccRCC

BVS

nula (786-O e A498) (Figura 3A). Em apoio a estas conclusões, a sobre-expressão transitória de FH marcado com FLAG (FH-FLAG) reduziu os níveis de HIF-2α em células 786-O (Figura 3B). Juntos, isso sugere que FH modula a expressão da proteína HIF-2α na ausência de VHL.

A)

BVS

células 786-O e A498 nulos foram seccionado com siRNA de FH e controle corrida ( sINC). Quarenta e oito horas após a transfecção, os lisados ​​de proteína foram analisados ​​por imunotransf erência para as proteínas indicadas. B) As células 786-O foram transitoriamente transfectadas com vector de controlo (CV) e vector contendo FLAG marcado FH. Quarenta e oito horas após a transfecção, os lisados ​​de proteína foram analisados ​​por imunotransf erência para as proteínas indicadas. imunotransferência bandeira indica expressão bem sucedida do transgene. ) () células 786-O Esquerda C foram estavelmente transfectadas com CV e FH-FLAG. Após selecção em puromicina, os clones de células individuais foram colhidos e rastreados quanto à expressão FLAG. níveis de HIF-2a foram medidos em FH-FLAG expressar clones relativamente a células CV transfectadas. A densitometria das bandas é quantitativamente exibida no lado direito. Os valores médios relativos +/- desvio padrão foram obtidos com o software ImageJ a partir de experimentos independentes.

Para melhor elucidar o mecanismo pelo qual FH regular a expressão da proteína HIF-2α, criamos linhas celulares estáveis ​​com superexpressão FH-FLAG em células 786-S-VHL deficiente. Foram identificados 3 clones que expressavam estavelmente o construto FH-FLAG. Todos os 3 clones demonstraram níveis de HIF-2α reduzidos em comparação com as células transfectadas de controle de vetores (Figura 3C). Inicialmente examinou se os efeitos sobre HIF-2α foram transcrição mediada, no entanto, não detectou reduções nos níveis de mRNA HIF-2α com FH superexpressão (dados não mostrados).

perda de FH activa a sinalização AKT

relatórios recentes têm implicado de sinalização PI3K /AKT na manutenção da expressão da proteína HIF-2α em

BVS

células nulas por meio de um mecanismo de translação [17], [18], [19], [22] _ENREF_17. Com base nestes relatórios, foram examinados sinalização AKT com modulação de FH. Descobrimos que knockdown mediada por siARN da

FH

em ambas as células 786-S e A498 resulta no aumento da fosforilação de AKT na serina 473 de AKT (Figura 4A). Correspondentemente, a sobre-expressão de FH reduzido fosfo-AKT níveis em células 786-S (Figura 4B), indicando que os níveis de FH correlacionam-se inversamente com a sinalização de AKT. A seguir, examinou os efeitos de inibição de PI3K na expressão da proteína HIF-2α FH-dependente. Consistentes com os nossos achados anteriores, FH sinalização AKT knockdown ativada e aumento dos níveis de HIF-2α comparação com embaralhar células transfectadas (SINC) (Figura 4C). Contudo, co-tratamento das células transfectadas com o inibidor de PI3K LY-294002 bloqueou o aumento em HIF-2α associada com FH knockdown (Figura 4C). Juntos, isso sugere que a FH mantém a expressão da proteína HIF-2α através de mecanismos dependentes de PI3K e sinalização AKT.

A)

BVS

células 786-O e A498 nulos foram transfectadas com siRNA de FH e controle de corrida (sINC). Quarenta e oito horas após a transfecção, os lisados ​​de proteína foram analisados ​​por imunotransferência por AKT total e fosfo-AKT Ser473. B) As células 786-O foram transitoriamente transfectadas com vector de controlo (CV) e vector contendo FLAG marcado FH. Quarenta e oito horas após a transfecção, os lisados ​​de proteína foram analisados ​​por imunotransf erência para as proteínas indicadas. C) As células 786-S foram transfectadas com o ARNsi indicados. Vinte e quatro horas após a transfecção, o meio das células foi substituído com meio contendo inibidor de PI3K LY-294002 (6,25 uM). As células foram então recolhidas 24 horas mais tarde e os lisados ​​de proteína foram sujeitos a análise de immunoblot para as proteínas indicadas.

expressão FH medeia a migração celular e invasão

As consequências biológicas da FH sobreexpressão em RCC As células foram em seguida examinados.

FH

tumores nulos são altamente invasivo e tumores metastáticos, muitas vezes [20], e HIF-2α já havia sido implicada neste processo celular [23]. Por isso, investigamos o papel de FH na migração celular e invasão em ccRCC. Descobrimos que knockdown de HIF-2α com ARNsi em células RCC 786-S diminuiu a motilidade celular, tal como determinado pelo ensaio de cicatrização da ferida em comparação com células transfectadas embaralhar (Figuras 5A e 5B). A quantificação destes resultados são fornecidos na Figura 5C. Embora quase 80% da diferença da ferida foi fechada em células de controlo transfectadas por 12 horas, 50% da diferença da ferida permanecia em células knockdown HIF-2α. Tendo em conta estes dados, examinamos a cicatrização de feridas em FH superexpressão subclones 786-O, em comparação com as células transfectadas de controle de vetores. Ambos os clones com superexpressão FH tinham reduzido significativamente o fechamento da ferida, em comparação com as células transfectadas de controle de vetores, o que sugere que a perda de FH contribui para a migração em RCC (Figura 6A). Em células transfectadas com vector de controlo, a diferença de largura da ferida foi quase completamente fechado por 10 horas. Em contraste, as células com superexpressão FH fechado a abertura da ferida por apenas metade por 10 horas indicando reduzida migração celular foi resultado de FH superexpressão. Estes resultados são apresentados graficamente (Figura 6B). Para corroborar ainda mais esses dados, examinámos a migração celular utilizando um ensaio de câmara de com soro bovino fetal a 10% como o chemotractant. células de controle de vetores 786-S foram significativamente mais migratória de clones com superexpressão FH (Figura 6c). Finalmente, a sobre-expressão de FH em células RCC reduzida sua capacidade invasiva, conforme determinado pelo ensaio de matrigel invasão (Figura 6D). Tomados em conjunto, estes dados demonstram que a perda de expressão FH aumenta a capacidade migratória e invasiva de células RCC.

786-O RCC células foram transfectadas com ARNsi de controlo precipitação (SINC) ou siRNA para HIF-2α. resultados de transferência Western de extractos de células inteiras são demonstrados no painel A. B) ensaio de cicatrização de feridas foi realizada em células transfectadas. As imagens foram serialmente tomada no ponto de tempo indicado após a indução “ferida”. Os resultados são apresentados graficamente no painel C. Os asteriscos (*) indicam significância estatística com p 0,05 em relação ao embaralhar as células transfectadas de controlo

A) a cicatrização de feridas imagens de ensaio nos pontos de tempo indicados.. B) Wound distância largura nos pontos de tempo indicados. ensaio de migração celular C) Câmara dos clones indicados. As células foram semeadas em meio livre de soro com SBF a 10% utilizada como o chemotractant. Migrado contagem de células de clones, 48 ​​horas após a semeadura inicial. Os asteriscos (*) indicam significância estatística com p 0,05 em relação às células de controlo transfectadas vector. D) ensaio de invasão Matrigel com 10% de meio FBS como o chemotractant. Asteriscos (*) indicam significância estatística com p . 0,05 em relação ao controlar células transfectadas vetor

Discussão

Neste relatório, nós demonstramos pela primeira vez a expressão reduzida FH no mRNA e níveis de proteína em carcinoma renal de células claras, a variante histológica mais comum que representa a maioria dos casos de câncer de rim. Estes resultados são significativos como os estudos anteriores não identificou

FH

mutações em linhas RCC, bem como amostras de RCC primários [24]. Os mecanismos pelos quais os níveis de mRNA de

FH

são reduzidos estão sob investigação atual. A hipermetilação pode ser um mecanismo pelo qual

FH

expressão é suprimida. Dulaimi

et al.

Não identificou hipermetilação em uma ilha CpG do

FH

promotor em um painel de CCRs papilares [25]. No entanto, nenhum estudo até à data têm analisado

FH

estado de metilação em ccRCC. Enquanto hipermetilação é um meio de silenciamento do gene supressor de tumor, mecanismos alternativos também podem explicar a redução da expressão de

FH

nós identificamos. O recente interesse tem incidido sobre o papel de microRNA (miRNA) na regulação dos genes onde os relatórios sugerem que os genes envolvidos na fosforilação oxidativa pode ser objecto de regulamentação por miRNAs [26]. Claramente, estas possibilidades justificar uma investigação mais aprofundada, dada a importância biológica das nossas descobertas.

Temos demonstrado anteriormente que a reintrodução do tipo selvagem

FH

em um

FH

linha de células de tumor deficiente resulta numa redução acentuada nos níveis de HIF-1α nucleares [27]. Além disso, siRNA knockdown mediada de FH foi mostrado para aumentar os níveis de HIF-1α em células de carcinoma do pulmão A549 que expressam BVS [5]. Os resultados obtidos nestes estudos, bem como outros estudos bioquímicos, sugerem que o principal mecanismo pelo qual isto ocorre é a estabilização de proteínas por meio de HIF através da inibição da actividade de prolil-hidroxilase, como resultado da perda de FH. Estes resultados, por conseguinte, presumir que o efeito de FH em HIF só seria evidente na presença de VHL. No entanto, nossas descobertas são bastante romance em que eles indicam que FH pode modular HIF-2α independentemente da BVS. vias independentes de VHL que medeiam a degradação de HIF têm sido relatados. Em particular, a Hsp90 e RACK1 ter sido previamente demonstrado para modular HIF-1α degradação [28]. Portanto, é possível que um mecanismo semelhante medeia a degradação de HIF-2α bem. Apesar de estabilização através da inibição da degradação de proteínas, há evidências crescentes de que vias alternativas desempenhar um papel na manutenção dos níveis de proteína HIF-2α na ausência de VHL. Bloco

et al.

Demonstrou que as espécies de oxigénio elevados celulares reativas, mediadas por p22-phox oxidases Nox base, manter os níveis de proteína HIF-2α em células RCC através de um mecanismo de translação AKT /4E BP1-mRNA dependentes [17] , [22]. Correspondentemente, a fosforilação de AKT e 4E-BP1 são reforçadas em tecido humano RCC em relação ao tecido normal do parênquima [22]. Mais recentemente, Toschi

et ai., Achou que a activação AKT, por meio de sinalização através do complexo mTOR sinalização 2 (mTORC2), foi necessário para manter o HIF-2α em células nulas VHL [18]. activação AKT é um nó de sinalização comum no cancro e mecanismos alternativos podem levar à activação AKT em RCC incluindo perda de FH.

O mecanismo pelo qual a sinalização AKT é activado pela perda FH está sob investigação corrente. Temos anteriormente demonstrado que a perda de FH em células epiteliais renais resulta em estresse oxidativo celular elevada [27]. Assim, ROS pode ser um contribuinte para os níveis de HIF-2a elevados sobre FH knockdown. Alternativamente, os efeitos da perda de HF pode estar relacionado com o seu papel no ciclo do TCA. Está bem estabelecido que FH também existe numa forma extramitocondrial, citosólica. Neste momento, muito pouco se sabe sobre a função desta forma de FH. No entanto, provas recentes fornecida por O’Flaherty

et ai.

Indica que a perda de FH extramitocondrial podem contribuir para a estabilização de HIF [29]. Além disso, citosólica FH tem sido implicado na resposta a danos no ADN [30]. Após a danos no ADN, citosólica FH foi mostrado para translocar para o núcleo. O mecanismo pelo qual FH participa na resposta a danos no ADN permanece obscura. No entanto, não há, certamente, a possibilidade de que os metabolitos de FH e interage com podem regular a função de outras proteínas, potencialmente dentro do núcleo. Curiosamente, AKT, também tem sido demonstrado para funcionar no núcleo [31]. Dado os nossos dados, bem como estes relatórios recentes, a segmentação de AKT mediada vias de sinalização, quer ao nível da AKT ou a montante, pode vir a ser de benefício terapêutico para o cancro renal. Isto está em concordância com os dados recentes demonstrando a

in vitro

e

in vivo

eficácia de um inibidor duplo PI3K /mTOR em RCC [19].

Curiosamente, há precedente para alterações da enzima ciclo TCA em câncer. Vários outros genes que codificam enzimas da ciclo tricarboxílico (TCA) são considerados os genes supressores de tumores, incluindo

SDHB

,

SDHC

, e

SDHD

(Succinato Desidrogenase subunidades B, C, D), [33], [34] [32].

SDH

mutações de subunidades têm sido associados a feocromocitoma e paraganglioma e mais recentemente para tumor do estroma gastrointestinal (GIST) [35]. Além de mutações, alterações da expressão destes genes foram ligados a malignidade. Dahia

et al.

Expressão reduzida demonstrou de succinato desidrogenase subunidade B (SDHB) em um subconjunto de pheochromocytomas [36]. Mais recentemente, a redução da expressão de SDHB foi identificado em grande proporção de GIST sem mutações no

SDHB

ou outros genes comumente mutado em GIST incluindo

KIT Comprar e

PDGFRA

[35] . Com base nestes dados, um potencial tema unificador pode ser que os defeitos da fosforilação oxidativa, seja através de mutação ou expressão mudanças, têm um papel na oncogênese. Recentemente, Chen

et al.

Propôs que o consumo de oxigênio através do metabolismo mitocondrial pode regular o crescimento do tumor, limitando a disponibilidade de oxigênio para actividades não mitocondriais que são positivo para o crescimento do tumor [37].

de interesse significativo é a nossa constatação de que FH superexpressão resulta em redução da migração e invasão de células RCC. Nossos dados estão em concordância com um relatório recente da Costa

et al.

Que demonstrou que

fh

knockdown no rato imortalizada fibroblastos embrionárias (iMEFS) resultou em aumento da motilidade em comparação com iMEFS não transduzidas [38 ]. Além disso, o aumento da motilidade foi dependente HIF-1α. O papel de HIF-2α nos seus estudos não pôde ser determinado à medida que foram incapazes de detectar expressão de HIF-2α em fh iMEFS deficiente. Nossos estudos focados em HIF-2a dada estudos prévios que implicam o seu papel na carcinogênese renal. Dado que o HIF-2α knockdown em células RCC inibe a migração, os nossos dados indicam que os efeitos da sobre-expressão FH sobre migração e invasão são, em parte, mediada por efeitos sobre o HIF-2α. HIF-2α tenha sido previamente implicado no comportamento invasivo das células RCC. Além disso, as propriedades que promovem invasivos de HIF-2α foram estudadas em células 786-S, as mesmas células utilizadas neste estudo. Hughes

et ai. Demonstraram que

knockdown HIF-2α em células 786-S reduzida a expressão de várias integrinas que podem mediar a motilidade celular e invasão [39]. Petrella

et al.

Examinou o papel da perda de VHL na invasão celular [40]. Eles descobriram que a reintrodução do tipo selvagem

BVS

em células 786-O BVS deficiente reduzidos níveis de HIF-2α e invasão celular. Por outro lado, re-expressão de HIF-2α em

BVS

reconstituído células 786-O restaurado potencial invasivo. Estes dados indicam um papel para HIF-2α na migração RCC e invasão. Além disso, a sobre-expressão de HIF-2α foi encontrada para melhorar o crescimento de xenoenxertos de RCC ao passo que a sobre-expressão de HIF-1α foi encontrado para inibir o crescimento de xenoenxertos [41]. Correspondentemente, os estudos indicam que separadas HIF-2α, mas não HIF-1α, contribui para o crescimento de

BVS

xenoenxertos tumorais nulos [16], [42]. Assim, nossos dados adicionar ao crescente corpo de evidências demonstrando os efeitos de promoção de tumor de expressão HIF-2α na RCC.

Apesar da recente aprovação de múltiplos agentes para câncer renal avançado, a maioria dos pacientes com câncer renal avançado irá eventualmente, sucumbir à sua doença. Assim, a identificação de novas vias de sinalização será crítico para o desenvolvimento de terapias eficazes. Atualmente, há evidências crescentes de que o câncer renal é um dos tumores que são representativos do paradigma emergente na biologia do câncer de ligações metabólicas para malignidade. Nossas descobertas com FH sugerir uma reprogramação metabólica em câncer renal de células claras que promove a expressão de fatores tumorigênicos incluindo HIF-2α através de vários mecanismos. Desvendar os mecanismos pelos quais o metabolismo do tumor é alterada e as consequências celulares a jusante devem fornecer uma visão profunda na biologia do câncer renal, bem como novas estratégias terapêuticas.

Materiais e Métodos

Células

A498, 786-o, e células ACHN foram obtidos a partir da American Type Culture Collection e mantidas em DMEM suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10%, a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. células RCC4 foram gentilmente cedidas por P. Ratcliffe (Oxford).

Chemicals

LY294002 foi adquirido a Sigma.

Construções

O FH-FLAG construção foi anteriormente descrito [27].

imunotransferência

Todas as análises de imunotransferência foram realizadas como anteriormente descrito [27] no conjunto de células lisados ​​preparados com a utilização de tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (Tris 50 mM de HCl, 150 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 1% desoxicolato de sódio, e 0,1% de sulfato de dodecilo de sódio), suplementado com um cocktail inibidor de protease (Roche). Os anticorpos foram obtidos a partir das seguintes fontes comerciais: GeneTex (FH-immunoblotting), Santa Cruz Biotechnology (FH-imuno-histoquímica), Novus (GAPDH, HIF-2α), Sigma (Tubulin, β-actina), Cell Signaling (AKT total e Ser473 fosfo AKT).

amostra de tecido quantitativa PCR em tempo real

Biospecimens para análise de RNA foram obtidas a partir do tecido Rede Cooperativa Humano do NCI /NIH. O ARN total foi transcrito de forma inversa utilizando o kit High-Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems). O ADNc foi então utilizado como molde com Assays-on-demand mistura 20 × ensaio de iniciadores e sondas TaqMan da Applied Biosystems. Quarenta ciclos de amplificação foram realizadas em sequência o detector Applied Biosystems 7900 Prism. Dobre alterar valores entre tumor e amostras normais foram calculados utilizando o Δ

C

método de t com normalização para níveis 18S rRNA. Como um teste estatística foi utilizado o teste de Mann-Whitney emparelhado teste não-paramétrico para comparar expressão FH no tumor contra o tecido adjacente normal (implementado em GeneSpring, Agilent).

Immunoblotting e imuno-histoquímica de amostras de tumores humanos

amostras tumorais eo tecido correspondente normal a partir de pacientes com RCC foram obtidos do Departamento de Urologia da Universidade do Texas Health Science Center em San Antonio. Os tumores para este estudo foram histologicamente classificados como carcinoma renal de células claras por um patologista geniturinário. A recolha e tratamento de amostras humanas foi realizada de acordo com um protocolo aprovado pelo Institutional Review Board da Universidade do Texas Health Science Center em San Antonio. Com base no protocolo, as amostras foram obtidas de uma maneira de-identificados a partir de pacientes submetidos a ressecção cirúrgica para cancro renal. Como as amostras foram obtidas e analisadas de forma anónima, o consentimento do paciente não era necessária.

cicatrização de feridas ensaio

As células foram deixadas crescer até confluência perto em 60 pratos mm. Um zero uniforme foi então feita para baixo do centro da placa utilizando uma ponta de micropipeta de 200 microlitros, seguido por lavagem duas vezes com PBS. O mesmo campo marcado da ferida zero foi fotografada utilizando um microscópio óptico Olympus (4 × objectivo) nos pontos de tempo indicados. A largura da ferida zero foi medida em três diferentes áreas com software de captura de pró-Q. dados quantificados representam a média +/- D.P. a partir de pelo menos duas experiências independentes.

Migração ensaio

subclones células 786-O (1 × 10

4) foram semeadas em um 8 uM de tamanho de poro fino-cert para placas de 24 poços (Greiner Bio-One) em meio isento de soro. Setecentos e cinquenta microlitros de meio com FBS a 10% foi adicionado à câmara inferior, como chemotractant. Após 48 horas, as células no topo da membrana foram removidas com um cotonete. As células migradas no lado inferior foram lavadas com PBS, fixadas com etanol a 70% e coradas utilizando 0,1% de violeta de cristal para visualizar as células que migraram. células que migraram ligados ao lado inferior da membrana foram enumeradas usando um microscópio de luz em 10 x de ampliação. As contagens representam o número médio de células de dez campos microscópicos.

ensaio de invasão

invasão celular foi determinada pelo ensaio de invasão (membrana revestida com uma camada de proteínas da matriz extracelular Matrigel) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram semeadas em meio isento de soro para a câmara superior e invadido para a câmara inferior contendo um meio com FBS a 10%, como o chemotractant. As membranas foram processadas de um modo semelhante como o ensaio de migração.

ARN interferência

Para FH e knockdown HIF-2α, as células foram transfectadas com ARNsi reagente reunidas (Thermo Fisher) com o sistema de Amaxa Nucleofector de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram colhidas às 48-72 horas após a transfecção. A não-alvo piscina disputa siRNA foi usado como um controle negativo (Thermo Fisher).

Reconhecimentos

Agradecemos Cynthia Galindo e Dawn Garcia para assistência técnica. Agradecemos a Iniciativa de Biologia Computacional (UTHSCSA /UTSA) para fornecer acesso e treinamento para o software de análise utilizado.