Abstract

Purpose

Glycine N-metiltransferase (GNMT) afeta a estabilidade genética através da regulação da proporção de S-adenosilmetionina para S-adenosilhomocisteina, por ligação a folato, e interagindo com carcinogénios ambientais. Nos homens Taiwan, GNMT foi encontrado para ser um gene de susceptibilidade para cancro da próstata tumor. No entanto, a associação de GNMT com risco de cancro da próstata em outras etnias não foi estudado. Recentemente, foi relatado que a sarcosina, que é regulada por GNMT, aumentaram acentuadamente em câncer de próstata metastático. Vimos por este meio explorou a associação de polimorfismos GNMT com o risco de câncer de próstata em indivíduos de ascendência europeia do Health Professionals Follow-up Study (HPFS).

Métodos

Um total de casos de câncer de próstata 661 incidentes e 656 controlos foram identificados a partir de HPFS. O GNMT curta repetição em tandem polimorfismo 1 (STRP1), inserção de 4 bp /polimorfismos de deleção (INS /DEL) e os rs10948059 polimorfismo de nucleotídeo único foram genotipados para testar sua associação com o risco de câncer de próstata.

Resultados

o rs10948059 genótipo T /T foi associado com um aumento de 1,62-vezes no risco de cancro da próstata (intervalo de confiança de 95% (CI): 1,18, 2,22) quando comparado com o genótipo C /C. O genótipo STRP1 ≥16GAs /≥16GAs foi associado à diminuição do risco de câncer de próstata, quando comparados com o 16GAs / 16GAs genótipo (odds ratio (OR) = 0,68; 95% CI: 0.46, 1.01). INS /DEL não foi associado com o risco de câncer de próstata. Haplótipos contendo o alelo rs10948059 T foram significativamente associados com risco aumentado de câncer de próstata.

Conclusão

Nos homens de ascendência européia, a rs10948059 GNMT e STRP1 foram associados com o risco de câncer de próstata. Em comparação com o estudo realizado em homens de Taiwan, os alelos de susceptibilidade GNMT para câncer de próstata tinha uma relação inversa. Este estudo destaca as diferenças nas freqüências alélicas e suscetibilidade ao câncer de próstata em diferentes etnias

Citation:. Chen M, Huang Y-L, Huang Y-C, Shui IM, Giovannucci E, Chen Y-C, et al. (2014) polimorfismos genéticos da Glycine N-metiltransferase e cancro da próstata risco no Health Professionals Follow-Up Study. PLoS ONE 9 (5): e94683. doi: 10.1371 /journal.pone.0094683

editor: Qing-Yi Wei, Cancer Institute, Duke, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de janeiro de 2014; Aceito: 18 de março de 2014; Publicado em: 06 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas do Conselho Nacional de Ciência da República da China (Programa Nacional de Pesquisa para Biopharmaceuticals [NRPB], conceder NSC102-2325-B-037-009), Ministério da Educação da República da China (alvo para a Universidade Top Plan), Mackay Memorial Hospital (conceder MMH-10185) e Instituto Nacional de Saúde (P01CA055075). Irene Shui é suportado pelo NCI NRSA T32 CA09001 (PI: Stampfer) e uma bolsa de estudos do cancro da próstata Exército dos EUA pós-doutoramento. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Glicina N-metiltransferase (GNMT, EC2.1.1.20) é uma proteína com funções múltiplas. Ela afecta a estabilidade genética através da regulação da proporção de S-adenosilmetionina (SAM) de S-adenosil (HAS), por ligação a folato [1], [2], e através da interacção com agentes cancerígenos, tais como o benzo (a) pireno e aflatoxina B1 . Anteriormente mostrou que estas interacções alteradas a via de desintoxicação do fígado e a formação de aduto de DNA impedido e citotoxicidade subsequente [3] – [5]. Além disso, GNMT regula os genes relacionados com as vias de desintoxicação e anti-oxidante [6]. Nós já gerou um Gnmt – /- modelo do rato e mostrou que Gnmt – /- ratos desenvolveram doença de armazenamento de glicogênio hepatite e crônica no fígado [7]. O Gnmt – /- murganhos foram seguidos até 24 meses de idade e todos a fêmea e metade dos ratinhos macho desenvolveram carcinoma hepatocelular (HCC) espontaneamente [8]. Estes achados sugerem que GNMT deficiência resulta em diminuição da capacidade para erradicar radicais livres endógenos e compostos xenobióticos, tanto em nível celular e em um modelo animal; e, portanto, a homeostase da expressão GNMT é muito importante para a defesa contra o stress celular endógeno e exógeno.

GNMT é expressa no fígado, pâncreas, próstata, rim e [9]. Em estudos realizados em homens de Taiwan, GNMT foi encontrado para ser um gene de susceptibilidade do tumor de carcinoma hepatocelular [9], [10] e o cancro da próstata [11]. No entanto, a associação de GNMT com câncer de próstata em outras raças ou etnias permanece obscuro. Um estudo recente da Sreekumar et al. relataram que sarcosina (N-metilglicina) – um metabolito diferencial regulada por GNMT – aumentou acentuadamente no tecido e no soro de cancro da próstata metastático e foi encontrado na urina após exame rectal digital no doença confinado ao órgão [12]. Eles mostraram uma elevação gradual de concentração de tecido sarcosina durante a progressão do cancro da próstata a partir da próstata benigna para o cancro da próstata clinicamente localizado a doença metastática. GNMT é a enzima responsável pela conversão de glicina de sarcosina, e eles mostraram que knockdown de GNMT atenuada invasão do cancro da próstata. No entanto, estudos posteriores sobre o papel da sarcosina como um potencial biomarcador para a detecção precoce do câncer de próstata não conseguiu ver qualquer associação entre a concentração de sarcosina na urina e ou grau do tumor ou o estágio do tumor [13], [14], e estudos sobre a associação de níveis de sarcosina soro e cancro da próstata relataram resultados conflitantes [15] – [17]

o gene GNMT humano está localizado no cromossomo 6p12 e nós relatado anteriormente que ele tem 3 locais polimórficos na região do promotor que pode afetar transcrição. atividade: curta em tandem repeat 1 (STRP1), a (GA) n dinucleótido polimorfismo repetido, INS /DEL com inserção ou deleção de um tetranucleotídeo GAGT e rs10948059 [9], [11], [18]. Um estudo recente na italianos por Ianni et al. mostrou que o alelo T GNMT rs9462856, que também está localizado na região promotora a montante de rs10948059, foi associada com o aumento de risco do cancro da próstata [19]. Usando a disposição do público HapMap versão 3, release do banco de dados R2, forte desequilíbrio de ligação foi encontrada entre rs9462856 e rs10948059 de Ianni et al. (D ‘= 1,000 e R

2 = 0,760 em residentes de Utah com Norte e ascendência europeia ocidental de a coleção CEPH e D ‘= 0,946 e R

2 = 0,737 na chineses han em Pequim, China). Neste estudo, procurou-se determinar a associação dos polimorfismos GNMT STRP1, INS /DEL e rs10948059 e próstata risco de câncer em americanos de ascendência europeia.

Métodos

População do estudo

neste estudo caso-controle, os casos de câncer de próstata incidente foram identificadas a partir dos profissionais em curso Saúde Follow-up Study (HPFS) nos Estados Unidos. Em 1986, 51,529 homens em profissões de saúde (por exemplo, dentistas, farmacêuticos, optometristas, médicos osteopata, podólogos e veterinários) foram recrutados para HPFS. No início do estudo, os participantes completaram um questionário sobre dados demográficos, doenças e tópicos relacionados com a saúde. Estes questionários foram repetidas a cada dois anos. As informações sobre óbitos foram obtidas de familiares, follow-up questionários, ou uma pesquisa do Índice Nacional de Morte e foi realizada através de Março de 2011 [20].

Entre 1993 e 1995, amostras de sangue foram obtidas a partir de 18,018 participantes , coletadas em tubos de EDTA, enviado por correio urgente, e centrifugado. Alíquotas de plasma, incluindo, eritrócitos, e buffy coat, foram armazenados em azoto líquido, e o DNA foi extraído usando um kit de extracção de sangue QIAamp (Qiagen, Inc., Valencia, CA).

Um total de 661 da próstata incidente casos de câncer e 656 controles foram identificados a partir do HPFS para o nosso estudo, entre 1993 (tempo de retorno do sangue) e 31 de janeiro de 2000. Matching foi um-para-um. Cada caso foi combinado com um controle que estava vivo, não tinha sido diagnosticado com cancro da data do diagnóstico do caso, e tinha um teste específico antígeno prostático (PSA) realizada. Restringimos a análise aos indivíduos de ascendência europeia para reduzir o potencial para a estratificação da população.

Os dados demográficos gravadas de todos os indivíduos incluídos idade, índice de massa corporal (IMC), e história familiar de câncer de próstata. Em casos de câncer de próstata, os dados clínico-patológicos, incluindo o nível de PSA, Gleason e estágio da doença foram registrados. Os pacientes foram classificados como tendo câncer de próstata agressivo se tivessem PSA 20 ng /ml, estágio do tumor ≥III ou N1 ou M1, ou escore de Gleason ≥8. casos letais de câncer de próstata foram aqueles que tiveram metástases ao diagnóstico ou que evoluíram para metástases ou morte específica por câncer de próstata. Este estudo foi aprovado pela Comissão de Seres Humanos na Escola Harvard de Saúde Pública e os Seres Humanos Comitê no Hospital Brigham and Women. consentimento por escrito foi dado pelos pacientes para a sua informação a ser armazenada no banco de dados do hospital e usado para a pesquisa

A genotipagem dos polimorfismos genéticos GNMT

Três polimorfismos de GNMT foram analisados ​​neste estudo.: STRP1, INS /DEL e rs10948059. Um ensaio de nuclease de 5 ‘TaqMan foi usada para a genotipagem de rs10948059, e análise de fragmentos automatizado (GeneScan) foi usada para a genotipagem de STRP1 e INS /DEL. Os detalhes dos métodos e iniciadores utilizados foram previamente descritos [18].

A análise estatística

As freqüências genotípicas foram testadas para Hardy-Weinberg entre os controles através do teste do qui-quadrado. odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (IC) foram calculados para as associações entre cada genótipo com câncer de próstata por modelos de regressão logística ajustados para idade ao sorteio de sangue. As análises restritas a subtipos de câncer de próstata (por exemplo agressivos e letais) utilizados todos os controles. Foi utilizada a regressão logística politômica para avaliar se as associações eram diferentes com cânceres agressivos e não agressivos. O software GENECOUNTING (versão 2.0), que implementa um algoritmo de estimativa-maximização, foi utilizada para estimar as frequências dos haplótipos e para calcular desequilíbrio de ligação entre os marcadores de [21], [22]. As análises estatísticas foram realizadas utilizando SAS v9.2 software de estatística (SAS Institute, Cary NC), e valor de p 0,05 foi considerado significativo

Resultados

características do estudo. participantes foram descritos em um estudo anterior [23] e características selecionadas são apresentados na Tabela 1. em resumo, a idade média de coleta de sangue em casos e controles foi de cerca de 66 anos ea média de idade no momento do diagnóstico em casos foi de cerca de 69 anos. . Catorze por cento dos casos de câncer de próstata e 11 por cento dos controles tinham um histórico familiar de câncer de próstata

Em casos de câncer de próstata, o PSA nível mediano foi de 7,0 (intervalo interquartil: 5.2, 10.8), com o maioria dos pacientes (n = 445, 67,3%) tendo um nível inicial de PSA de 10 ng /ml ou menos. Apenas 67 (10,1%) casos tiveram uma pontuação de Gleason entre 8 e 10 e a maioria (n = 546, 82,6%) dos casos teve T1 ou T2 doença. Vinte e quatro por cento (161) dos casos foram classificados como agressivos e 11,8% (78) tiveram metástases à distância no momento do diagnóstico ou evoluíram para morte ou metástases.

frequências rs10948059 genotípicas nos controles estavam em Hardy-Weinberg ( p = 0,55). Houve um aumento no risco de cancro de próstata total para aqueles com o genótipo T /T, em comparação com o genótipo C /C (OR = 1,62; IC de 95%: 1,18, 2,22) (Tabela 2). A relação foi sugestivamente mais forte em casos não agressivos (OR = 1,81; IC 95%: 1,30, 2,53), quando comparado com casos agressivos (OR = 1,21; IC 95%: 0,76, 1,92), embora o p-heterogeneidade (0,09) foi não foi estatisticamente significativa (Tabela 3)

alelos STRP1 foram classificados em dois grupos:. 16GAs e ≥16GAs. freqüências genotípicas nos controles foram: 32,8% 16GAs / 16GAs, 56,3% 16GAs /≥16GAs, e 11,0% ≥16GAs /≥16GAs. Indivíduos com ≥16GAs /≥16GAs havia diminuição do risco de cancro da próstata em comparação com aqueles com 16GAs / 16GAs (OR = 0,68; IC de 95%: 0,46, 1,01) (Tabela 2). Esta associação protetora de ≥16GAs foi consistentemente observada em não agressivos, agressivos e letais cânceres de próstata (Tabela 3)

INS /DEL não estava em Hardy-Weinberg nos controles (p 0,0001).. Uma associação entre INS /DEL e câncer de próstata não foi visto (Tabela 2).

O desequilíbrio de ligação não era forte entre os 3 marcadores. D ‘era 0,837 para STRP1-INS /DEL, 0,634 para INS /DEL-rs10948059, e 0.560 para STRP1-rs10948059. análise de haplótipos de STRP1-rs10948059 mostrou que, quando comparado com os outros haplótipos, haplótipos com o alelo rs10948059 T foram significativamente associados com risco aumentado de câncer de próstata (OR = 1,19, 95% CI: 1.00, 1.42 para 10GAs-T; OR = 1,46 , 95% CI: 1.02, 2.10 para 16GAs-T), enquanto que aqueles com a rs10948059 C alelo tendeu para um efeito protetor contra o câncer de próstata (OR = 0,76 IC 95%: 0,63, 0,92 para 16GAs-C). (Tabela 4)

Discussão

Em nosso estudo dos homens de ascendência européia, GNMT STRP1 e rs10948059 foram realmente associado com o risco de câncer de próstata. Aqueles com um aumento do número de repetições em tandem (≥16GAs /≥16GAs) teve um 32% menor risco de câncer de próstata em comparação com aqueles com menos repetições ( 16GAs / 16GAs). Além disso, aqueles com o genótipo rs10948059 T /T teve um 62% o aumento do risco de cancro da próstata em comparação com aqueles com o genótipo C /C Esta associação pareceu ser mais forte na não-agressivo em comparação com cancros agressivos. Esses achados estão de acordo com os de um estudo recente da Koutros et al., Que mostrou uma forte associação entre a sarcosina soro e câncer de próstata não agressivo, mas nenhuma associação com câncer de próstata agressivo [17]. Por isso, é possível que GNMT pode ser um biomarcador para o câncer de próstata não agressivo precoce.

Os resultados do estudo também são suportados por um estudo sobre a associação genotípica e fenotípica de GNMT, que demonstrou que os promotores contendo ou STRP1 10 GAs ( 16 AGs) ou alelo rs10948059 T teve aumento significativo da actividade de transcrição de promotores contendo STRP1 16 de gás (≥16 GAs) ou rs10948059 C alelo [18]

Embora GNMT atua como um supressor tumoral e foi. encontrado para ser regulada para baixo no HCC, o seu papel na patogênese do câncer de próstata permanece desconhecida. Gnmt – /- ratos desenvolveram HCC mas não o cancro da próstata, o que sugere que outros factores de risco contribuindo para a tumorigénese de cancro da próstata além de deficiência ou perturbação do nível de expressão GNMT. Anteriormente, foi utilizada uma levedura sistema de dois híbridos para pesquisar proteínas que interagem com GNMT e descobriram que DEPTOR [24] e NPC2 [25] ligado directamente com GNMT. Postulamos que talvez GNMT exerce sua função através da interação com outros efetores incluindo DEPTOR e NPC2. DEPTOR é um inibidor de mTOR relatada a ter um papel importante e mais direto na carcinogênese da próstata [24]. Portanto, são necessários mais estudos sobre a associação de DEPTOR e NPC2 com câncer de próstata.

Os resultados deste estudo estão em contraste com os de nosso estudo em homens de Taiwan, que mostrou que o alelo rs10948059 T não foi significativamente associada com câncer não-agressivo da próstata (OR = 0,68 IC 95%: 0,36, 1,27) e tinha uma associação protetora contra o câncer de próstata agressivo (OR = 0,67 IC 95%: 0,47, 0,96) [11]. As distribuições de alélicas e genotípicas frequências também foram significativamente diferentes entre etnias (p 0,0001 para todas as comparações). (Tabela 5) Nos homens de Taiwan, o alelo ≥16 gás era mais comum (63,8%), enquanto nos homens de ascendência européia, a 16 alelo gás era mais comum (61,0%). A alelo 16 de gás não foi associado com o risco de câncer de próstata em homens de Taiwan, enquanto ele foi associado com um aumento de 23 por cento no risco de câncer de próstata em homens de ascendência européia. Nos homens de Taiwan, a 16GAs / 16GAs genótipo estava presente em 12% dos casos de câncer de próstata e 13% dos controles, enquanto que no HPFS, que estava presente em 39% dos casos de câncer de próstata e 33% dos controles. Estes resultados ilustram claramente diferentes alélicas e distribuições genotípicas em homens de Taiwan e europeus americanos.

Nos homens de Taiwan, a rs10948059 C alelo foi significativamente mais comum do que o alelo T (85% vs. 15%), enquanto que em homens de descida Europeia, o alelo C foi ligeiramente mais comum do que o alelo T (54% vs 46%). Nos homens de Taiwan, o alelo rs10948059 T tinha uma associação protetora contra o câncer de próstata (OR = 0,72). Em contraste, em homens de descida Europeia, o alelo T estava associada com risco aumentado de cancro da próstata (OR = 1,27). Portanto, o alelo rs10948059 T tem associações opostas em diferentes grupos étnicos. Esta diferença sugere ainda que é necessário para validar em uma etnia específica quaisquer associações visto em outras etnias. variações étnicas e raciais no risco de câncer podem refletir diferenças na exposição ambiental ou diferenças na suscetibilidade e resposta biológica [26]. polimórfica expressão de genes podem afectar, quer pela activação ou desintoxicação, o metabolismo de carcinogéneos, tais como os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, aminas aromáticas, aminas heterocíclicas, e outros factores. Por sua vez, a exposição a diferentes fatores ambientais podem afetar os genes e selecione contra polimorfismos genéticos específicos. Ao longo do tempo, essas interações gene-ambiente pode resultar em efeitos variáveis ​​observadas em diferentes raças e etnias. É possível que os genes envolvidos em vias de desintoxicação pode ser mais susceptíveis a tais influências. Kato et ai. relatados associações opostas de polimorfismos citocromo P450IIE1 com risco de câncer de pulmão em americanos europeus e africanos [27]. Além disso, nosso estudo mostrou que os polimorfismos de GNMT, que também participa de desintoxicação, têm associações de variáveis ​​em homens de descendência e asiáticos Europeia.

Todos os casos de câncer de próstata e os controlos neste estudo eram de ascendência europeia. Por isso, é incerto se esses polimorfismos genéticos GNMT estão associados com o risco de câncer de próstata em outras etnias, como os afro-americanos. Um estudo que compreende de 50% Mexican American, 18% americana Europeia, 18% Africano-americanos, 12% asiáticos e 1% das mulheres árabes relataram uma T freqüência do alelo rs10948059 de 36,4% [28], o que é inferior ao de 45,8% reportada neste estude. Estudos realizados em outros grupos étnicos, o que poderia todos têm diferentes freqüências alélicas, são, portanto, necessário esclarecer essas associações.

Em nosso estudo anterior em homens taiwaneses que compreendem de 326 casos de câncer de próstata e 327 controles [11], o alélicas frequências eram comparáveis ​​às de outro estudo pelo nosso grupo [29]. A freqüência do alelo T permaneceu constante em cerca de 15% nos controles após reunindo temas de ambos os estudos ( 600 controles), sugerindo que as freqüências alélicas não foram afetados pelo tamanho da amostra

INS /DEL foi excluída. a partir de análise de haplótipos, porque não estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg (p 0,0001). análise de haplótipos de STRP1-rs10948059 mostrou que o haplótipo mais comum foi 10GAs-T, representando 40% dos controles e 44% dos casos, seguido por 16GAs-C, e 10GAs-C. (Tabela 4) rs10948059 Haplotipos com o alelo T teve RUP maior do que 1, o que sugere que a presença do alelo T rs10948059 por si só aumentou a susceptibilidade para o cancro da próstata. Nos homens de Taiwan, o desequilíbrio de ligação entre os 3 marcadores foi mais forte (D ‘era 0,988 para STRP1-INS /DEL, 0,948 para INS /DEL-rs10948059, e 0,945 para STRP1-rs10948059). O haplótipo 10GAs-INS-T foi associado à diminuição do risco de câncer de próstata em homens de Taiwan (OR = 0,68, 95% CI = 0,48-0,95).

A força deste estudo foi que fomos capazes de ver a associações variáveis ​​de GNMT com câncer de próstata em diferentes etnias. Uma limitação do estudo foi a falta de dados sobre os níveis de expressão GNMT, portanto, uma correlação com genótipos não poderia ser feita. Estudos imuno-histoquímicos pode ser realizada para melhor elucidar a associação de GNMT com cancro da próstata em homens de descida destes Europeia. coloração imuno-histoquímica utilizando o anticorpo monoclonal 14-1 GNMT na diluição 1:25 foi previamente realizada em tecidos prostáticos de homens obtidos de Taiwan e uma matriz de tecido de homens asiáticos [11]. expressão GNMT tendeu a ser maior em não-cancerosas do que em câncer de próstata e tecidos tumorais adjacentes; e nos tecidos de câncer, a coloração foi maior em baixo estágio de cancros alto estágio. Estas descobertas estão em contraste com aqueles do estudo de Song et al., Em 148 homens japoneses, que mostrou que a alta expressão GNMT citoplasmática foi correlacionada com a maior pontuação de Gleason, maior estágio patológico, e menor sobrevida livre de doença [30]. Embora ambos os estudos foram realizados em homens asiáticos, Song et al. utilizado um anticorpo policlonal para coloração imuno-histoquímica, então poderia haver problemas de especificidade, e os resultados de ambos os estudos não podem ser directamente comparados. estudos de acompanhamento longitudinal pode ajudar a esclarecer a relação entre a expressão GNMT e progressão da doença e agressividade.

Finalmente, é importante notar que uma maior proporção de indivíduos neste estudo tinham localizada (estágio I ou II) doença ( 85%), quando comparado ao nosso estudo anterior de Taiwan (32%) [11]. O estudo em homens de Taiwan foi baseada no hospital, enquanto o HPFS é composta por profissionais de saúde. Os profissionais de saúde são mais saúde consciente e são mais propensos a ter exames físicos regulares do que a população em geral

. O uso do teste de PSA foi elevada na HPFS.

Conclusões

Nos homens de ascendência européia, a rs10948059 GNMT e STRP1 foram associados com o risco de câncer de próstata. Em comparação com o estudo realizado em homens de Taiwan, os alelos de susceptibilidade GNMT para câncer de próstata tinha uma relação inversa. Este estudo demonstrou a importância de validar associações em diferentes etnias, como os alélicas e genotípicas frequências eram diferentes, e as associações resultantes entre marcadores e câncer de próstata também diferiram. Os resultados deste estudo sugerem que GNMT desempenha um papel na carcinogênese prostática, mas tendo em conta os resultados contraditórios de estudos recentes sobre a sarcosina, mais estudos são necessários para elucidar o papel do GNMT na agressividade do câncer de próstata.

Agradecimentos

gostaríamos de reconhecer Channing Divisão de Medicina de Rede, Departamento de Medicina, Hospital Brigham and Women e Harvard Medical School. Nós gostaríamos de agradecer aos participantes e funcionários do HPFS por suas valiosas contribuições, bem como os seguintes registros de câncer do estado para sua ajuda: AL, AZ, AR, CA, CO, CT, DE, FL, GA, ID, IL, IN, IA, KY, LA, ME, MD, MA, MI, NE, NH, NJ, NY, NC, ND, OH, OK, OR, PA, RI, SC, TN, TX, VA, WA, WY. Também gostaríamos de agradecer a Miss Yu-Tien Liu por sua ajuda na genotipagem.