Abstract

plasma a pressão atmosférica não-térmico (NTAPP) é um gás ionizado na sala temperatura e tem potencial como uma nova terapia contra o câncer de promoção da apoptose, que atua através da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). No entanto, é imperativo para determinar a sua selectividade e padronizar os componentes e composição de NTAPP. Aqui, um aparelho concebido NTAPP geradora combinado com um sistema de alimentação de gás e Ele demonstrou a sua elevada selectividade em relação às células cancerosas mutada de p53. Em primeiro lugar, determinou as condições adequadas para a exposição NTAPP para induzir selectivamente a apoptose em células cancerosas. O efeito apoptótica de NTAPP foi maior para as células cancerosas mutante p53; artificial expressão de p53 em células HT29 p53-negativa reduziu o efeito pró-apoptótico de NTAPP. Também examinamos os níveis extra e intracelulares ROS em células tratadas com NTAPP para deduzir o mecanismo de ação NTAPP. Enquanto aumenta NTAPP mediadas em óxido nítrico extracelular (NO) não afetou a viabilidade celular, intracelular ROS aumento sob exposição NTAPP e morte celular por apoptose induzida. Este efeito foi dose-dependente redução tratamento seguinte com captadores de ERO. NTAPP apoptose induzida mesmo em linhas de células de cancro resistente a doxorrubicina, o que demonstra a viabilidade de NTAPP como uma potente terapia do cancro. Colectivamente, estes resultados suportam fortemente o potencial de NTAPP como um tratamento anticancerígeno seletiva, especialmente para as células cancerosas mutante p53-

Citation:. Ma Y, Ha CS, Hwang SW, Lee HJ, Kim GC, Lee KW, et ai. (2014) não-térmica Pressão atmosférica Plasma Preferencialmente induz a apoptose em células p53 mutado Câncer ativando ROS vias de estresse-resposta. PLoS ONE 9 (4): e91947. doi: 10.1371 /journal.pone.0091947

Autor: Subrata Roy, da Universidade da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 25 Setembro, 2013; Aceito: 18 de fevereiro de 2014; Publicação: 23 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ma et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por uma bolsa da KRICT (SI-1304) e do Ministério da Economia do Conhecimento, Coreia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a apoptose é uma forma bem conhecida de morte celular programada que remove as células danificadas e não desejadas; serve como um mecanismo crucial para defender tecidos e órgãos a partir de vários tipos de tensões e dano celular [1]. indução selectiva de apoptose em células de cancro é considerado uma abordagem ideal para a terapia do cancro, e diversos agentes anti-cancro com este mecanismo tenha sido desenvolvido. No entanto, as abordagens atuais ainda enfrentam desafios significativos a superar, incluindo a resistência aos medicamentos, baixa eficiência terapêutica, e seletividade de células cancerígenas.

A proteína supressora de tumor p53 é essencial para a manutenção da estabilidade genômica em mamíferos. Quando as células são sujeitas a várias tensões genotóxicos e celulares, tais como o stress oxidativo, hipóxia, radiação, ou agentes quimioterapêuticos, a p53 é activada, e a sua degradação dependente de ubiquitina é bloqueada, o que leva a uma acumulação de factor activo p53 da transcrição [1]. p53 activada regula a paragem do ciclo celular, a activação de anti-oxidantes e de reparação do ADN, e a apoptose afectando a expressão dos seus genes-alvo, incluindo a cinase dependente de ciclina (CDK) inibidor

p21 /WAF1

e genes envolvidos em morte celular, como

BAX

,

PUMA

,

noxa

, e

Fas

[2], [3]. Quando as células são expostas a stress oxidativo, p53 também activa a transcrição de sestrin, glutationa peroxidase (GPX), e aldeído desidrogenase (ALDH), desempenhando assim um papel fundamental na manutenção do equilíbrio redox e estabilidade genómico sob o stress oxidativo [4], [5 ]. A mutação do gene p53 ou perturbação das vias que conduzem à activação de p53 tem sido frequentemente observado na maioria dos tipos de cancro humano [6].

A indução dependente de p53 de apoptose em resposta ao dano genotóxico é um aspecto importante de supressão do tumor. Assim, a perda de p53 em cancros humanos contribui para o comportamento agressivo do tumor e, muitas vezes promove a resistência das células cancerosas a radiação e agentes quimioterapêuticos. Por exemplo, o tratamento de p53 timócitos

+ /+ de rato com resultados de radiação em apoptose, enquanto que o p53

– /- timócitos são resistentes. De modo semelhante, o p53

+ /+ fibroblastos de rato embrionárias transformadas pela proteína E1A adenoviral e Ha-ras oncogene sofrer apoptose em resposta a irradiação y agentes ou quimioterapêuticos, mas p53

– /- fibroblastos são resistentes a ambos os tratamentos [7 ]. Além disso, algumas mutações da p53 em cancros suprimir a função de p73, que induz a apoptose através de um mecanismo independente de p53 [8]. Assim, a perda da função de p53 comum em células cancerosas apresenta uma grande limitação para terapias anti-cancro.

O plasma é descrita como uma mistura quase-neutras e as partículas de radicais carregados num gás parcialmente ionizados. Recentemente, muitos estudos têm tentado tirar proveito da baixa temperatura de plasmas não térmicos pressão atmosférica (NTAPPs) para aplicações biomédicas pela virtude da controlabilidade da química plasma e cinética [9] – [11]. Existem vários tipos de NTAPPs, tais como a agulha de plasma, jactos de plasma, e as descargas de barreira dieléctrica (DBDS) [11]. O componente do gás e a duração de pulso e força do campo eléctrico determinar as composições de plasma exactas. O estudo da NTAPPs para aplicações clínicas recentemente se tornou um tema de pesquisa muito ativa; NTAPPs são facilmente geradas no ar e podem ser utilizadas sem causar danos térmicos às células. Os efeitos de NTAPPs em tecidos vivos incluem a esterilização, a cicatrização de feridas, e mudanças de migração celular (para revisão, [10], [12]). A variedade de efeitos diferentes de plasma depende da dose de plasma e suas composições químicas complexas.

Estudos anteriores sobre a aplicação clínica de NTAPP para células de mamíferos têm focado principalmente o seu efeito sobre a morte celular [13], [14] . Vários mecanismos possíveis relacionados com a morte celular mediada por NTAPP foram relatados, incluindo a diminuição da adesão celular [15], [16]. Em particular, vários grupos de investigação demonstraram que NTAPP induz a apoptose em células cancerosas e alguns podem ser utilizados como uma terapia do cancro [17], [18]. Há um crescente corpo de evidências sugerindo que as espécies reactivas de oxigénio (ROS) são os principais jogadores da apoptose induzida por NTAPP

in vitro

[19] – [22].

ROS são quimicamente reativos radicais, iões, ou moléculas que contêm radicais livres de oxigénio e um subproduto do metabolismo normal. Os níveis basais de ROS activar numerosas cascatas de sinalização para promover a proliferação de células em condições fisiológicas normais [23] – [25]. No entanto, níveis excessivos de ROS induzir o stress oxidativo e atacam directamente o ADN, proteínas, lípidos, e outros componentes celulares, em última análise, contribuindo para a célula a senescência e a apoptose [26], [27].

O primeiro passo para se desenvolver como NTAPP uma terapia potencial cancro é avaliar sua eficácia seletiva para as células cancerosas. Aqui, demonstramos que NTAPP induz a apoptose em células cancerosas mutada-p53 mas não em células primárias ou caule. Mostramos também que aumentos NTAPP mediadas por ROS intracelular induzir a morte celular por apoptose de um modo dependente da concentração. Para melhor avaliar a viabilidade de NTAPP para terapia de câncer, nós testamos NTAPP em células cancerosas doxorrubicina resistente e descobriu que ele era capaz de induzir a apoptose. Em conjunto, estes resultados suportam fortemente o potencial de NTAPP como um tratamento anti-cancro selectiva, especialmente para cancros e células mutantes da p53 que são resistentes a drogas anti-cancro existentes.

Materiais e Métodos

cultura celular e NTAPP tratamento

as células utilizadas neste estudo e as suas fontes encontram-se resumidos na Tabela 1. HeLa e células Hep G2 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino ( FBS) e 10 ml /l de penicilina-estreptomicina. G361, HCT116, HCT116 p53

– /-, HCT15, MES-SA, H1299, HT29, DLD-1, LoVo, doxorrubicina-resistente HCT15 /CL02 e MES-SA células /DX5 foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% (v /v) de FBS e 10 ml /l de penicilina-estreptomicina. As células IMR90 e RKO foram cultivadas em Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com 10% (v /v) de FBS e 10 ml /l de penicilina-estreptomicina. células YD-9 foram cultivadas em DMEM:DMEM /F12 (01:01) suplementado com 10% (v /v) de FBS e 10 ml /l de penicilina-estreptomicina. tecido adiposo subcutâneo foi obtida durante cirurgias eletivas com o consentimento do paciente, tal como aprovado pela Samsung Hospital Institutional Review Board (IRB não. KBC11151). De tecido adiposo células estaminais derivadas (ASC) foram isoladas a partir do tecido [28] e cultivadas em DMEM /Ham F-12 (DMEM /F12) suplementado com 10% (v /v) de FBS e 10 ml /l de penicilina-estreptomicina. Todas as células foram mantidas a 37 ° C sob uma atmosfera humidificada de 5% de CO

2.

A fim de expor as células ao NTAPP, 1 × 10

5 as células foram semeadas em placas de 35 -mm placas de cultura e incubou-se durante 24 h. As células foram expostas à dose indicada (5 padrão L /min [SLM], 5 V) de NTAPP durante 30 s a 1 min de cada vez a cada hora durante um período máximo de 10 vezes. Quando necessário, as células foram expostas NTAPP-incubadas durante mais 15 h antes de outras experiências.

análise Western blot

NTAPP-expostas as células foram colhidas e lisadas, como descrito [29]. As histonas foram extraídos com ácido clorídrico 0,6 N. As amostras de proteína total (50 ug) ou histonas foram analisados ​​com soro anti-caspase-3 (Cell Signaling Technology), anti-poli polimerase ribose do ADP (PARP, Cell Signaling Technology), anti-actina (Sigma-Aldrich), e anti fosfo-H2AX (γ-H2AX) soros (Millipore), fosfo-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology), PUMA (Cell Signaling Technology) e Bax (Santa Cruz Biotechnology). Peroxidase de rábano conjugada com anti-ratinho e anti-coelho (Jackson Immuno Research) foram utilizados anticorpos secundários, e as membranas tratadas foram visualizados utilizando o kit ECL (Amersham Biosciences).

detecção intracelular ROS

células HeLa (1 × 10

5) foram semeadas em 35 mm de prato com lamelas de vidro e repetidamente expostos a 5 V NTAPP durante 30 s cada h para um total de sete vezes antes intracelular níveis de ROS foram avaliadas usando uma ROS kit de detecção (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Não-fluorescente carboxilo-H

2DCFDA pode facilmente para permeabilizar as células vivas e é oxidado por ROS intracelular para emitir um sinal de fluorescência verde brilhante. Terc-butil-hidroperóxido (TBHP), que é conhecido por induzir intracelular ROS, foi utilizado como um controlo positivo. N-acetilcisteína (NAC) e piruvato de sódio (SP) foram usados ​​como captadores de ERO intracelular e extracelular, respectivamente.

detecção nitrito Extracelular

A produção de óxido nítrico extracelular (NO), após a exposição para NTAPP foi determinada medindo a acumulação de nitrito, o metabolito estável do nO, segregada para o meio de cultura. Depois as células foram expostas a NTAPP, 50 ul de meio de cultura foi feita, misturado com um volume igual de reagente de Griess (sulfanilamida a 1%, 0,1% de dicloridrato de naftiletilenodiamina, e 2% de ácido fosfórico), e incubou-se à temperatura ambiente durante 10 min. A absorvância foi medida a 540 nm com um leitor de microplacas (SoftMax Pro 4.0, Molecular Devices), utilizando uma curva de calibração com um intervalo de 0-100 | iM concentrações de nano

2. Na experiência n ° limpador, as células foram pré-tratadas com 30, 50, ou 100 uM de concentrações carboxi-PTIO (Sigma-Aldrich) que reage com NO estequiometricamente antes de serem expostos a NTAPP.

A transfecção de pcDNA-p53 -HA

Nós adicionamos 2 ug do plasmídeo pcDNA-p53-HA (gentilmente cedido pelo Dr. J. Song, Universidade Yonsei, Seul, Coreia) em 6 mL linear L-PEI (polietilenimina), misturado com 150 mM de NaCl, e incubado à temperatura ambiente durante 10 min. A mistura foi aplicada às células HT29 antes da incubação durante a noite.

A citometria de fluxo

Depois de 10 exposições repetitivas de 5 V NTAPP seguido por 15 horas de incubação, as células foram colhidas com tripsina-EDTA e fixadas com 70 % de etanol frio. As células foram tratadas com 100 ug /ml de RNase durante 30 minutos em 37 ° C e ressuspenderam-se em 1 × tampão de ligação (Hepes 10 mM pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM

2). As células foram coradas com 0,01 mg /mL de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich), ou double-coradas com 5 mL FITC A anexina V (BD Biosciences), 5 l 7AAD (eBioscience) por milhão de células para detectar células em estado de apoptose. A citometria de fluxo foi realizada com software FACScalibur (biociências BD) e CellQuest.

análise do modelo global de plasma química

Porque é difícil de medir experimentalmente todas as espécies presentes em NTAPP, os engenheiros desenvolveram um plasma modelo global [30], [31] que calcula espécies químicas espacialmente em média, bem como partículas carregadas, sob uma dada condição de condução de circuitos externos usando equação de continuidade dependentes do tempo para cada espécie. O domínio de simulação é dividido em duas regiões: a região de fonte de plasma e o domínio de gás neutro sem plasmas. Os últimos contactos região do prato contendo as células. As reacções químicas são considerados o mesmo que na Tabela 2 por Sakiyama

et ai.

[31], excepto para a adição de hélio (He) espécies, que foram empregados como o gás tampão do dispositivo utilizado NTAPP para esta experiência. O número total de espécies é 68, eo número total de reações é 826.

O modelo global utilizado neste estudo resolvido equação de continuidade para as espécies de partículas pesadas e uma equação do balanço de energia para as espécies de elétrons. Devido à quase neutralidade do plasma, densidade de elétrons pode ser calculada a partir da soma de todos densidade de espécies positivo e a subtração de todos densidade de espécies negativo. As equações foram resolvidas numericamente com um código de in-house usando uma quarta ordem método de Runge-Kutta.

A análise estatística

Todos os dados são representados como a média ± erro padrão da média (SEM) de, pelo menos, três experiências independentes. Nós aplicamos

t

-Testes para avaliar diferenças estatisticamente significativas.

p Restaurant 0,05 (*) e

p

. 0,01 (**) indica significância estatística em comparação com o controle

Resultados

Propriedades do dispositivo NTAPP concebido

Nós projetamos um aparelho que gera NTAPP para expor às células viver. Este dispositivo NTAPP foi concebido para ter o campo eléctrico perpendicular à direcção do fluxo de gás, a fim de reduzir a quantidade de partículas carregadas através do jacto. Assim, o ROS gerado difundir amplamente, mas as partículas carregadas são confinadas dentro da região de geração do plasma. A pequena proporção de área do jacto para o volume de plasma também resulta na diminuição da quantidade de fotões de UV a partir do dispositivo. Além disso, a longa distância a partir do dispositivo para as células e o meio de cultura de reduzir os efeitos de fotões UV que são absorvidas pelos gases e líquidos de fundo muito bem. Portanto, esperamos que este dispositivo fornece principalmente ROS a partir de plasma, em comparação com jatos de plasma diretos que oferecem partículas carregadas diretamente para os alvos. A Figura 1 mostra um diagrama esquemático do gerador de plasma utilizado nesta experiência. O dispositivo é um tipo de descarga de barreira dieléctrica anelar (DBD) [32] especificado para geração NTAPP sob ar ou outros gases de alta tensão quando as formas de onda sinusoidal ou impulsos de curta duração são aplicados entre dois eléctrodos, pelo menos um dos quais é isolado. O isolante impede atual build-up entre os eletrodos, criando plasma eletricamente seguro, sem aquecimento a gás substancial.

(A) Representação esquemática do dispositivo NTAPP geradora utilizado para tratar células vivas. O material dieléctrico utilizado é de Teflon (polytetrafluoroethyle), e o eléctrodo é feito de cobre. (B) NTAPP gerado a partir do dispositivo. A densidade do plasma é da ordem de 10

12 /cm

3, e a potência total consumida no plasma é de 1,11 W por um pico de tensão de pico de 7 kV com uma tensão de entrada CC de 5 V. O quantidades de espécies ROS calculadas são apresentadas na Figura S1.

Como se mostra na Figura 1, o aparelho é combinado com um sistema que ele gás de alimentação, um fornecedor de energia de CA, e o dispositivo de DBD coberto com plástico casos, para reduzir a difusão ROS. Ele gás flui para dentro da entrada do dispositivo, a uma taxa de 1 a 5 litros padrão por minuto (SLM), que é controlado por um controlador de fluxo de massa (MKP, MPR-2000). tensão alternada é aplicada ao eléctrodo interior do dispositivo de DBD a uma frequência de 11,4 kHz e um pico aplicada a tensão de pico de 7 a 20 kV, a qual é gerada utilizando um circuito transformador composto por díodos rectificadores e transistores de potência bipolar (Ramsey Electronics, PG13 kit gerador de plasma). A tensão de entrada CC varia de 5 a 12 V, que é designado como um parâmetro de controlo para alterar a tensão aplicada ao dispositivo DBD. Por exemplo, as tensões de entrada de 5, 6, 12 e V correspondem a pico-a-pico de tensão de 7,5, 8,9, e 18,8 kV de saída, respectivamente. A energia total consumida no plasma é de 14,11 W para o pico de tensão de pico de 7 kV com uma voltagem DC de entrada de 5 V, que é a condição para a maior parte da medida experimental.

A informação sobre o plasma componentes e composição é indispensável para a reprodutibilidade e mecanismo de ação NTAPP. No entanto, é difícil de medir cada elemento gerado a partir do dispositivo de plasma, especialmente, à pressão atmosférica, porque muitos ROS não emitem luz que pode ser detectada na espectrometria de emissão óptica, e espectroscopia de massa também é difícil de usar a esta pressão. modelagem global é geralmente usado para a análise da cinética de reacção química e NTAPP plasma, nas condições de funcionamento [30], [31]. Por conseguinte, a fim de analisar os componentes e a composição do nosso dispositivo NTAPP, que usaram um modelo global, que é muito semelhante ao da Sakiyama et ai. [31], exceto para a adição de reações relacionadas com Ele. Os resultados de modelagem global com a variação de He fracção molar, assim como a humidade, a uma potência fixa de entrada de 80 W são apresentados na Figura S1.

Para ar seco com uma humidade de zero, as reacções relacionadas com a água são excluídos, e, assim, o número total de espécies e o número total de reacções são reduzidos para 43 e 454, respectivamente. Como Sakiyama et ai. [31] mostrou duas regiões de simulação diferentes para a camada de descarga e de domínio gás neutro, os domínios de simulação da região de descarga e região gás neutro foram considerados separadamente. Figura S1A e S1B são os resultados da região de descarga, e a Figura S1C e S1D são da região de gás neutro contactar os pratos. Figura S1A mostra a densidade de ROS dentro do dispositivo de plasma para diferentes fracções de gás He que pode ser controlado alterando o caudal do gás. Uma vez que as energias de limiar para interacções com ROS são mais baixos do que aqueles com ele, as densidades de ROS são determinados principalmente pela quantidade de ar, e a espécie mais dominante no interior da região de descarga é oxigénio atómico, devido ao processo de dissociação de impacto de electrão de O

2 e O

3 [30]. As espécies mais abundantes são átomos de oxigénio, óxido nítrico, e ozono, quando a fracção de ar misto é maior do que 1%. Figura S1B mostra o efeito da humidade sobre ROS densidade para a mistura de 99% e 1% Ele ar. A fracção molar considerado de vapor de água é de 1%, o que corresponde a 30% de humidade relativa à temperatura ambiente. A mudança de ROS densidade não é significativa com a inclusão do efeito da humidade, excepto pela existência adicional de OH, H, H

2O

2, HNO

2, HNO

3, HO

2 e H

2. O ROS gerado no dispositivo de plasma difundir para fora para o ar, e eles são representados graficamente na Figura S1C após o tempo de difusão de 0,1 ms que foi estimada como a hora de chegada das espécies a partir do bocal de plasma para o prato. Após o processo de difusão do ROS durante todo o ar, a espécie mais dominante é o ozono em vez de oxigénio atómico, e facilmente atribui ao O

2 para gerar O

3. Finalmente, a Figura S1D mostra o número de moles de ROS de chegar ao prato por unidade de área e unidade de tempo. O número total de moles pode ser calculada multiplicando a área da superfície do prato e a quantidade total de tempo de interacção. Por exemplo, com um diâmetro de 3,5 cm de prato e com tempos de operação de 30 segundos, o factor de multiplicação é total de 289. Por conseguinte, o número máximo mole de ozono entregues aos meios de comunicação é de cerca de 30 mmol. O transporte de ROS dentro de meios líquidos não é bem compreendida e é muito difícil de calcular, mas existem algumas referências para as taxas de reacção de electrões hidratados e os radicais hidroxilo, bem como para o transporte de protões movimentada em solução aquosa [31]. Se assumirmos que 10-30% dos ROS gasosos são entregues em meios líquidos, o número total de moles dentro das gamas líquidos 3-9 mmol.

Efeitos diferenciais de NTAPP em diferentes tipos de células humanas

para determinar as condições de exposição ideais de NTAPP para inibir a proliferação de células cancerosas, o experimento inicial avaliou os efeitos de diferentes intensidades NTAPP na viabilidade celular em células normais e cancerosas. Em primeiro lugar, aplicou-se NTAPP com uma gama de tensão de entrada (5-10 V) uma vez que a linha celular de cancro HepG2, a linha de células de fibroblastos embrionários de pulmão normais WI38, e ASC durante 1 min, em seguida, as células foram incubadas durante 24 h antes de quantificou a viabilidade celular utilizando ensaios MTT. O ensaio de MTT é para avaliar a viabilidade celular, que reflete o número de células viáveis ​​presentes. O aumento da viabilidade sugere que as células tratadas proliferam mais rapidamente do que as células de controlo. A diminuição da viabilidade significa que as células tratadas proliferam mais lento do que o controlo ou a algumas das células tratadas sofrem morte celular. Nesta experiência, a distância (3 cm) entre o dispositivo e NTAPP as células e o fluxo de gás (5 SLM) foram corrigidos.

Como se mostra na Figura S2, enquanto as diferenças na viabilidade não foram observadas entre doentes tratados e as células HepG2 não tratadas, os números de WI38 VA13-ASC e células aumentou ligeiramente mais do que as células de controlo não tratadas. Estes resultados sugerem que a exposição NTAPP podem induzir diferentes respostas fisiológicas em células não-cancerosas e cancerosas. Verificamos também que as mudanças na viabilidade celular é devido à exposição NTAPP e não pelo gás Ele usado para gerar NTAPP (Figura S3).

A seguir, tentou deduzir as condições NTAPP adequados para bloquear a proliferação de células cancerosas mas não em células normais. Quando as células HeLa foram expostos a 5 V NTAPP durante 30 s cada h para um máximo de 9 h (10 exposições NTAPP repetitivas), como se mostra na Figura 2A, a percentagem relativa de células viáveis ​​foi ligeiramente menor aumento em células expostas (134%) em comparação para células de controlo não expostas (145%). Além disso, a diferença de as células viáveis ​​relativos entre NTAPP-tratadas e células HeLa não tratadas tornaram-se mais pronunciado quando as células foram incubadas durante mais 15 h, após 10 exposições NTAPP: a percentagem relativa de células viáveis ​​foi de apenas 106% em células expostas a 10 repetitivo NTAPP com 15 horas de incubação adicional, em comparação com 200% no controlo sem tratamento (Figura 2A). Curiosamente, quando aplicada nas mesmas condições de NTAPP de fibroblasto primário células IMR90 e ASC, o número relativo de células foi aumentado em células NTAPP-expostas em comparação com controlo não tratado (Figura 2C e E). As percentagens relativas de células viáveis ​​na ASC e IMR90 células que foram expostas a NTAPP 10 vezes e ainda incubadas durante 15 horas eram 178% e 168%, respectivamente, enquanto que a de células não tratadas foi de aproximadamente 150% (Figura 2C e E). Estas observações sugerem fortemente que nós empregamos as condições de exposição NTAPP direita (exposição repetitiva de 5 V de entrada NTAPP com posterior incubação) para inibir seletivamente a proliferação de células HeLa e ativa proliferação nas células IMR90 e ASC.

(A-F) (a, B) de HeLa, (C, D), as células adiposas derivadas de tecido do caule (ASC), e (e, F) As células IMR90 foram expostos com 5 V de entrada NTAPP durante 30 s cada h para 10 vezes, e a viabilidade celular foi avaliadas em cada frequência de exposição indicado. O tempo de incubação indica o tempo após a exposição inicial ao NTAPP. A amostra de incubação de 24 h foi preparado com 10 exposições NTAPP repetitivas seguido de outra incubação durante 15 h. (A, C, E) As percentagens relativas de células viáveis ​​são apresentados comparando o número inicial de células antes da exposição e de incubação como 100%. As células viáveis ​​foram quantificadas com ensaios MTT, e os dados são apresentados como média ± SEM de três experiências independentes.

p Art 0,05 (*) e

p Art 0,01 (**) indicam diferenças significativas em comparação com a condição de controle. (B, D, F) Para as mesmas amostras NTAPP-expostas em (a), (C), (E), respectivamente, γ-H2AX, caspase-3, caspase-3 clivada, PARP, e PARP clivada foram avaliadas pela analisa western blot. A actina é mostrado como um controlo de carga.

então examinado se diminuição da proliferação de células HeLa a seguir a exposição repetitiva NTAPP foi devido a apoptose através da monitorização da clivagem de caspase-3 e PARP seu efector a jusante, sendo que ambos são activados por apoptose. Quando expostas a 10 repetitivo V NTAPP 5 durante 30 seg cada, caspase-3 clivada e PARP foram detectadas em células HeLa mas não em células IMR90 ou ASC (Figura 2B). Consistente com os números de células relativa mostrada (Figura 2A, C, e E), caspase-3 clivada e PARP foram significativamente aumentada pelo adicional de 15 horas de incubação em células HeLa, mas não foram observadas em ASC ou células IMR90 (Figura 2B, D, e F). Estes resultados demonstram que o tratamento NTAPP induz a apoptose em células HeLa mas não em ASC normal ou células IMR90. Nós também confirmado que a exposição repetitiva NTAPP induz a apoptose em células HeLa utilizando citometria de fluxo com Anexina-V /7AAD coloração (Figura S4).

Considerando que a instabilidade genómica, devido a danos no ADN é uma das principais causas de apoptose, nós investigamos exposição se NTAPP induzida danos no DNA em células HeLa apoptóticos. A fosforilação da histona H2AX é um dos primeiros eventos celulares que ocorrem em resposta a quebras de ADN de cadeia dupla [7]. Enquanto as células cancerosas, incluindo células HeLa, geralmente apresentam baixa expressão γ-H2AX basal sem qualquer esforço, que foi significativamente aumentada em células HeLa-NTAPP expostas (Figura 2B). Não surpreendentemente, nenhuma expressão γ-H2AX foi detectado em ASC ou células IMR90 primárias (Figura 2D e F). Esta observação indica que a exposição NTAPP induz selectivamente danos de DNA que leva a apoptose de células HeLa.

efeito anti-proliferativo de NTAPP sobre melanoma e carcinoma de células orais

vez que a exposição de NTAPP induz selectivamente apoptose em células HeLa mas não em IMR90 primária ou ASC, examinámos o seu efeito sobre outros tipos de células cancerosas, incluindo G361 de melanoma e de carcinoma escamoso de células orais YD-9, que são derivadas de cancros encontrados na superfície do corpo em que o tratamento de plasma pode ser facilmente aplicáveis. Como mostrado na Figura 3A e C, 10 exposições repetitivas de 5 V NTAPP seguido por 15 horas de incubação teve um efeito anti-proliferativo em G-361 e YD-9 células em comparação com células de controlo não tratadas. exposição NTAPP também induziu expressão γ-H2AX por danos no ADN e apoptose em G-361 e células YD-9 (Figura 3B e D). Estes resultados demonstram que, como em células HeLa, a exposição NTAPP leva a morte celular por apoptose substancial no melanoma e células de carcinoma escamosas orais, sugerindo o potencial de aplicação de plasma para a pele e cancros orais.

(A-D) (A , B) de carcinoma escamoso YD-9 e (C, D), as células de melanoma G361 orais foram expostos com 5 V de entrada NTAPP durante 30 s cada h para 10 vezes, e a viabilidade celular foi avaliada em cada um indicado frequência da exposição. O tempo de incubação indica o tempo após a exposição inicial ao NTAPP. A amostra de incubação de 24 h foi preparado com 10 exposições NTAPP repetitivas seguido de outra incubação durante 15 h. (A, C) As percentagens relativas de células viáveis ​​são apresentados comparando o número inicial de células antes da exposição e de incubação como 100%. As células viáveis ​​foram quantificadas com ensaios MTT, e os dados são apresentados como média ± SEM de três experiências independentes.

p Art 0,05 (*) e

p Art 0,01 (**) indicam diferenças significativas em comparação com a condição de controle. (B, D), para as mesmas amostras expostas NTAPP-de (A) e (C), respectivamente γ-H2AX, caspase-3, caspase-3 clivada, PARP, e PARP clivada foram avaliadas por análises Western blot. A actina é mostrado como um controlo de carga.

efeito anti-proliferativo Altamente preferencial de NTAPP em células cancerosas deficientes em p53

De acordo com as mesmas condições NTAPP, o seu efeito anti-proliferativo foi maior em células HeLa que em L-361 e células YD-9 (Figura 2A e 3), embora, eventualmente, todos os tipos de células foram submetidos a apoptose. γ-H2AX fosforilação e a apoptose foi observada nas células HeLa, quando 10 estimulações NaTPF repetitivas foram aplicadas, mas isto só foi observada em G-361 e células YD-9 quando as células foram incubadas durante mais 15 h após a exposição NTAPP. HeLa, L-361, e YD-9 são todas as células cancerosas, mas apenas as células HeLa falta p53 funcional [33] – [35]. Considerando que NTAPP induz apoptose através de danos no ADN e que a p53 é o supressor de tumores chave, em resposta a tensões genotóxicos, postulamos se a presença ou ausência da p53 funcional em células HeLa, YD-9, e células de G361 faz a diferença no anti-proliferativa efeito de NTAPP.

de modo a demonstrar a relação entre a função de p53 e a sensibilidade das células de cancro para NTAPP, comparou-se o efeito anti-proliferativo de NTAPP em linhas celulares de cancro colo-rectal HCT116 (p53

+ /+) e HCT116-E6 (p53

– /-), sendo que ambos têm o mesmo fundo genético exato exceto para p53 funcional. Quando HCT116 (p53

+ /+) e HCT116-E6 (p53

– /-) recebeu 10 repetitivas 5 V estimulações NTAPP seguido por 15 h a incubação adicional, nas mesmas condições usadas no tratamento NTAPP anterior, a relativa percentagem de células viáveis ​​foram reduzidas em ambos HCT116 (p53

+ /+) e HCT116-E6 (p53

– /-) em comparação com células de controlo não tratadas (Figura 4A e B). Curiosamente, HCT116-E6 (p53

– /-) células mostraram hipersensibilidade a NTAPP comparação com HCT116 (p53

+ /+); A percentagem relativa de células viáveis ​​foi de apenas 80% em HCT116-E6 e 140% em HCT116, em comparação com 180% em ambos os grupos de controlo não tratadas (Figura 4A e B). Estes resultados são consistentes com o efeito observado para NTAPP de HeLa, YD-9, e células de G361 e sugerem fortemente que as células cancerosas sem p53 funcional são significativamente mais sensíveis do que as células de NTAPP que com p53 funcional.

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