Abstract

Fundo

A identificação de marcadores prognósticos adicionais para melhorar a estratificação de risco e evitar tratamento excessivo é uma das necessidades clínicas mais urgentes no câncer de próstata (PCA). MicroRNAs, sendo importantes reguladores da expressão do gene, são promissores biomarcadores em várias entidades de câncer, embora o impacto como preditores de prognóstico em PCA é mal compreendida. O objetivo deste estudo foi identificar os miRNAs específicos como potenciais marcadores prognósticos em CaP de alto risco e para validar seu impacto clínico.

Metodologia e Descobertas Principais

Foram realizadas análises miRNA-microarray em um grupo de estudo CaP de alto risco seleccionados pela sua evolução clínica (sobrevida livre de progressão clínica (CPFS) vs. falha clínica (CF)). Foram identificados sete miRNAs candidatos (

deixe-7a /b /c, miR-515-3p /5p, -181b, -146b

, e

-361

) que apresentaram expressão diferencial entre ambos grupos. Uma análise mais aprofundada qRT-PCR revelou a infra-regulação dos membros da

let-7

família na maioria de uma grande e bem caracterizada coorte de alto risco PCA (n = 98). Expressão de

deixe-7a

/

b

/e

-c

foi correlacionada com parâmetros de resultados clínicos deste grupo. Enquanto

deixe-7a

não mostrou nenhuma associação ou correlação com os dados clínicos relevantes,

let-7b

e

deixe-7c

foram associados com CF em pacientes APC e funcionou parcialmente como marcador prognóstico independente. Validação dos dados usando uma coorte de estudo de alto risco independente revelou que

let-7b,

não, mas

deixe-7c,

tem um impacto como um marcador de prognóstico independente para BCR e CF. Além disso, identificamos

HMGA1

, uma proteína não histona, como um novo alvo de

let-7b Comprar e correlação encontrada de

let-7b

sub-regulação com HMGA1 sobre-expressão em amostras de CaP primários.

Conclusão

Nossas descobertas definir um perfil de expressão miRNA distinta em casos APC com o início CF e identificou

let-7b

como biomarcador prognóstico em de alto risco CaP. Este estudo destaca a importância de

let-7b

como supressor de tumor miRNA em CaP de alto risco e apresenta uma base para melhorar a terapia individual para pacientes de alto risco CaP

Citation:. Schubert M, spahn H, Kneitz S, Scholz CJ, Joniau S, Stroebel P, et al. (2013) Distinct microRNA Expressão perfil na próstata doentes oncológicos com falha clínica precoce eo Impacto da

let-7

como prognóstico marcador de alto risco do cancro da próstata. PLoS ONE 8 (6): e65064. doi: 10.1371 /journal.pone.0065064

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 17 de dezembro de 2012; Aceito: 20 de abril de 2013; Publicação: 14 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Schubert et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta publicação foi financiado pela Fundação alemã de Pesquisa (DFG) e da Universidade de Wuerzburg no programa de financiamento Open Access Publishing, uma bolsa de Ferdinand Eisenberger da Deutsche Gesellschaft für Urologia (Sociedade alemã de Urologia), conceder ID SCM1 /FE-11; e IZKF (Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica), da Universidade de Würzburg, conceder ID Z-3/14. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é a neoplasia maligna mais comum entre os homens na Europa, com uma incidência estimada de 345.900 em 2006 [1]. O curso natural da doença é heterogênea, variando de indolentes para o cancro altamente agressivo que metastasizes na fase inicial causando dor e morte prematura. estratificações de risco atuais como baixa /intermediária /e de alto risco CaP sozinhos são insuficientes para prever o resultado clínico. Mesmo os homens com alto risco CaP (PSA 20 ng /ml e /ou biópsia Gleason score ≥8 e /ou clínica fase ≥ T3) representam um grupo heterogêneo de pacientes. Mesmo que caracterizada como um grupo que tem mais pobre resultado clínico em todos os grupos de risco, apenas até 30% desenvolvem metástases e morrem devido à sua doença [2] – [4]. Portanto, novos biomarcadores de prognóstico são urgentemente necessários para melhor os grupos de risco do Sub-stratify, identificar a doença letal, eventualmente, evitar tratamento excessivo, e melhorar a terapia individual. A identificação de marcadores de prognóstico, especialmente para a doença letal, dificilmente é possível numa colectiva CaP não seleccionada. Apesar de alto risco CaP coortes mostram agora muito melhor do que os resultados esperados, eles ainda representam um grupo ideal para identificar os fatores especificamente correlacionados com a doença letal.

Há evidências crescentes de que microRNAs (miRNAs) são candidatos adequados para a desenvolvimento de tais biomarcadores. MiRNAs são pequenos cordões não-codificante de ARN que regulam a expressão de genes no pós-transcricional e ao nível da tradução. miRs individuais foram caracterizados quer como supressores de tumores ou oncogenes (oncomiRs) [5].

Vários relatórios descrevem assinaturas de expressão específicos de miARN-PCA, no entanto, o tipo de miARNs regulamentados é diversa. Acordo existe entre estes estudos em que a maioria dos miARNs são regulados negativamente nas amostras de CaP [6] – [10]. Embora uma correlação com o estágio do tumor e grau foi descrito por vários miRs sua relevância como marcadores prognósticos para prever endpoints clínicos duro, como falha clínica ou morte relacionada ao câncer, continua a ser limitado [8], [11] – [14]. No entanto, existem abordagens promissoras para detectar a coerência entre a expressão alterada de miARNs específicos e a progressão da doença. Larne e colaboradores identificaram recentemente um modelo MultiMarker à base de miRNA como ferramenta de prognóstico para a progressão na CaP [15]. O nosso grupo de trabalho descrito anteriormente

miR-221

ser um marcador de prognóstico para a recorrência da doença em alto risco CaP [16].

Alguns dos miRs mais citados que mostram a infra-regulação em CaP são membros da

let-7

família [6], [9], [17], [18]. Esta família é composta por vários membros, cuja diversidade é distinto por isoformas (

let-

7

a-g, -i, miR-98

). A expressão de alguns

let-7

membros mostrou ser regulada em várias outras entidades do cancer assim, como o de mama, ovário e cancro do pulmão [19] – [21]. Conhecidos metas relevantes de

let-7 Quais são oncogenes como

Ras

,

cMyc

,

EZH2

e

HMGA2

[17] [22] – [24], indicando uma função tumor-supressor da

let-7

regulando oncogenes especificamente envolvidos no crescimento e capacidade de auto-renovação das células APC. Mais recentemente, foi demonstrado que as células-tronco CaP são caracterizados por down-regulação da

let-7

membros da família e que

let-7

é criticamente envolvido carcinogénese, controlando a sinalização do receptor de andrógeno, a proliferação e diferenciação [25] – [27]. No entanto, um papel de

let-7

membros da família como marcadores prognósticos em CaP não foi descrito até agora.

O objetivo deste estudo foi identificar os miRNAs diferencialmente expressos em alto risco APC com o resultado clínico diversificado. Detectamos um padrão que consiste em 7 miRNAs associados com recorrência clínica precoce e identificou

let-7

membros da família a ser progressivamente regulada em tumores agressivos. Em uma grande de alto risco CaP coorte que confirmaram estes resultados e demonstrou que a infra-regulação da

let-

7

b

está correlacionada com a recorrência bioquímica e falha clínica. Além disso, confirmou

let-7b

como marcador prognóstico independente no câncer de alto risco em uma coorte de validação independente. Além disso, mostramos que a expressão de

HMGA1

, uma proteína não histona, é regulada pela

let-7b

pela ligação ao 5’UTR de

HMGA1

. Nossos resultados demonstram que de alto risco CaP é caracterizado por um perfil de miRNA específico e que cada

let-7

membros da família são promissores marcadores prognósticos neste grupo de doentes.

Materiais e Métodos

coortes de pacientes

Nós trabalhamos com três diferentes coletivos PCA para nossas análises:

coorte a é constituída por 98 fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) amostra de tecido de um grupo bem caracterizado de de alto risco pacientes CaP [16]. Veja a tabela 1 para os dados clínico-patológico. As amostras de tecido e dados clínicos foram utilizados para microarray e analisa qRT-PCR em microRNAs, bem como estudos de correlação e de associação subseqüentes.

Coorte B é composto por 92 amostras FFPE de RP. amostra de tecido e os dados clínicos, patológicos foram obtidas do Departamento de Urologia da Universidade Hospital Leuven, Bélgica (Tabela 1). Este grupo serviu como colectivo de validação para confirmar o papel da

let-7b

como marcador prognóstico.

estadiamento pré-operatório no grupo A e B incluído DRE, uma tomografia computadorizada de abdominopelvic (TC) e uma varredura do osso. Neoadjuvante hormonal tratamento, radioterapia ou quimioterapia foi critério de exclusão. Linfonodo metástases e espécimes de próstata (seções inteiras de montagem, intervalos de 4 mm) foram encenadas e classificados de acordo com a classificação TNM 2002 e o sistema de graduação de Gleason como descrito anteriormente [16]. O acompanhamento foi realizado a cada 3 meses para os primeiros 2 anos após a cirurgia, a cada 6 meses, nos 3 anos seguintes, e depois anualmente. recidiva bioquímica (BCR) foi definida como PSA ≥0.2 ng /ml em 2 visitas consecutivas de acompanhamento. falha clínica foi declarado quando metástases locais ou distantes foram histologicamente comprovada ou confirmado por tomografia computadorizada ou osso. A sobrevivência global (OS) foi definido como o tempo a partir de RP à morte atribuída a CaP ou complicações da doença.

hiperplasia prostática benigna (BPH) amostras foram derivadas a partir de amostras adenomectomia próstata. As amostras foram incluídos em parafina bem; regiões com 80% tecido adenoideano foram utilizados. Todos os pacientes tinham níveis normais de PSA antes da cirurgia e carcinoma foi excluído por histopatologia.

Cohort C é composta por 21 amostras de câncer obtidos a partir do Departamento de Urologia da Universidade Hospital Wuerzburg, Alemanha. Pares de tecido CaP fresco congelado e tecido benigno adjacente, foram utilizados para mRNA e miRNA isolamento. Este grupo contém os pacientes com espécime não selecionados histopatológicos CaP (alto, médio e baixo risco de câncer). Desde o isolamento de mRNA de amostra de tecido fresco congelado é mais eficaz em relação ao isolamento em amostras FFPE nós trabalhamos com este grupo para estudos de correlação na expressão de

HMGA1

e

let-7b

. Para esta análise de dados clínico-patológico eram irrelevantes e, portanto, não mostrado. A avaliação histológica foi realizada por um patologista sênior (P. S.). amostras cancerosas que contêm células malignas, pelo menos, 80% foram utilizados para outras análises. Foram selecionadas áreas com pelo menos 80% dutos e há células cancerosas para o tecido benigno adjacente.

Os estudos foram aprovados pelo comitê de ética local da Faculdade de Medicina da Universidade de Wuerzburg, Alemanha (n. 59/04 ) e da Universidade Católica de Leuven, na Bélgica (UZ Leuven número Estudo S54424, número Estudo belga B322201214832); todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito.

Análise Microarray

À tela para o candidato miRs, sendo correlacionados com mau prognóstico 6 tecidos BPH e 13 espécimes PCA-alto risco foram hibridadas com microarrays (coorte A) . espécimes PCA-alto risco foram subdivididos em dois grupos (grupo 1: CPFS (n = 7), Grupo 2:. CF (n = 6) (ver Tabela 2 para detalhes) Um conjunto de 668 miRs (sonda Set 1564V2 Mirvana Biosysems Aplicadas ) foi descoberto em lâminas de microarray Nexterion ™ Hisense e em quadruplicado. Utilizou-se o-link Pure FFPE RNA total kit de isolamento ea concentração Módulo RiboMinus (Invitrogen) para purificação de RNA. Deslize o processamento foi realizado de acordo com a Applied Biosystems

miR

Vana ™ manuais. Os dados microarray está disponível sob o número de GEO GSE18671.

extração de RNA e transcrição reversa

extração de RNA total a partir de amostras embebidas em parafina ou tecido congelado e PCA as linhas celulares foram realizadas utilizando o kit de recuperar todos total isolamento de ácido nucleico e o ARN total Extraction Kit, respectivamente (Ambion e miRNeasy Mini Kit, Qiagen). ADNc específico foi sintetizado a partir de ARN total com os iniciadores de transcrição inversa haste-laçada de acordo com a TaqMan® miR Protocolo de ensaio (PE Applied Biosystems). a síntese de cDNA foi realizada com inespecífica IMPROM-II ™ Sistema de Transcrição Reversa (Promega) de acordo com o protocolo absoluta QPCR SYBR Green (Thermo Scientific).

qRT-PCR

A confirmação dos resultados de microarray sobre amostras independentes e num aumento de tamanho da amostra foi feita utilizando qRT-PCR. H (i) expressão do RNA em amostras de tecidos e linhas celulares foi quantificado com qualquer TaqMan ® (MIR) ou kits de ensaio SYBR Green (ARNm) e a OPTICON BioRad 2, seguindo as instruções do fabricante (Biorad). Primers para

deixe-7a-d, miR-16, -29, -221, -146b,

e

-181b

foram obtidos de Applied Biosystems; small nuclear RNA

RNU6B

foi aplicada para a normalização.

β-actina

serviu como governanta para

HMGA1

expressão (Applied Biosystems). Relativa m (i) RNA-expressão foi calculada com o comparativa Sc

t-method (Sc

t amostra = C

t de amostra – C

t

RNU6B

). A

-ΔΔCt método 2 foi utilizado para avaliar as mudanças de dobragem em m (I) R-expressão entre as amostras e controlos. Significa C

t foi determinada a partir de experiências de PCR em triplicado. O desvio padrão foi ≤0.4, os valores de p 0,05 foram considerados significativos

Cultura de Células e Transfecção Transiente

LNCaP e PC-3 de células foram obtidas a partir de ATCC, Alemanha utilizando passagens 5-35.. As células foram cultivadas a 37 ° C numa incubadora humidificada a 5% de CO

2. As células foram semeadas e simultaneamente transfectadas em placas de 6 poços a uma densidade de 3,5 x 10

5 por poço usando Meio RPMI 1640 Gibco sem Phenolred, contendo 10% de soro fetal de vitelo (Invitrogen), Glutamax (Invitrogen), NEAA (Gibco ), solução tampão HEPES (PAA), e solução de piruvato de sódio (PAA). transfecção transiente foi realizada utilizando o reagente de Lipofectamine ™ (Invitrogen) e Opti-MEM® (Invitrogen-Gibco), seguindo as instruções do fornecedor. Precursor- respectivamente Antigo

let-7b

foi aplicado para induzir ou suprimir

let-7b

expressão, pré e anti-negativo

let-7b

(Applied Biosystems) foram utilizado para a transfecção de controlo. As células foram colhidas 48 h após a transfecção.

Western Blot

As células foram lisadas em Cytobuster ou Phosphosafe (Novagene) após a preparação e determinação de proteínas quantidades iguais foram separados em SDS-PAGE e mais tarde transferido para membrana de nitrocelulose (Bio-Rad). Para a expressão da proteína de

HMGA1

usamos anticorpos policlonais 1 mg /ml de cabra (

HMGA1a /1b

, Abcam);

(Abcam) β-actina

serviu como governanta. Para visualização utilizou-se anticorpos de rábano acoplada com peroxidase (Abcam secundárias e Dako) e o kit ECL Plus (GE Healthcare). Para a quantificação da intensidade da banda foi utilizado Imagem J (https://imagej.nih.gov/ij/).

Luciferase Assay

A 3’UTR do humano

HMGA1

gene foi amplificado por PCR usando os seguintes iniciadores que continham Hind III adicional ou sítios Spe I: HMGA1Hindfor: 5′-GATC AAGCTTCATATTGTGGTGATGGAG-3 ‘; HMGA1SpeIrev: 5’-CAAT ACTAGT GAACATTTGGCGCTGGTAG-3 ‘. A resultante

HMGA1

fragmento de PCR contendo os dois mais a jusante localizada

let-7b

locais complementares ao

HMGA1

foi clonado a jusante do codão luciferase Renilla parada em um plasmídeo repórter luciferase (pMIR- RELATÓRIO-luciferase, apllied Biosystems) utilizando os locais de Hind III e Spe I. Para realizar ensaios de luciferase As células LNCaP foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 3,5 x 10

5 por poço e incubou-se durante 24 horas. O vector repórter foi co-transfectado para células de LNCaP com um oligonucleótido de ARN de controlo não segmentação ou

let-7

precursor de miARN. transfecção transiente foi realizada utilizando o reagente de Lipofectamine ™ (Invitrogen). 48 horas após a transfecção da actividade de luciferase foi analisada por Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega). atividade Renilla foi utilizado para normalização e como um controle para a eficiência de transfecção

Estatística e Análise de Bioinformática

Microarray-Análise:. intensidades spot de diapositivos digitalizados foram quantificados utilizando ScanAlyze Software (http: //rana .lbl.gov /EisenSoftware.htm). Os dados foram analisados ​​com diferentes pacotes R do projeto Bioconductor (www.bioconductor.org). Resultando intensidades de sinal foram normalizados por estabilização variância [28]. Diferencialmente expressos genes foram selecionados a partir dos dados de microarranjos por limma (modelos lineares para Análise de microarray) pacote [29]

qRT-PCR-Análise:. As amostras foram comparadas com uma Welch duas amostras teste t. Antes de prosseguir a análise da coletiva A, z-scores dos valores de expressão relativa foram criados. Posteriormente, o ponto de corte ideal para o

let-7

expressão foi determinado pelo receiver operating characteristic (ROC) análise da curva (R-package ‘proc’). Com base no limiar resultante dos valores de expressão foram dicotomizados. As associações entre expressão e recorrência clínica foi determinada por regressão de Cox com modelos uni e multivariada. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar a função de sobrevivência em vários pontos de tempo. taxas de risco uni e multivariada e seus intervalos de confiança de 95% (IC) foram estimados usando o modelo de riscos proporcionais de Cox ( “sobrevivência” Bioconductor pacote). valores P 0,05 foram considerados significativos. Para testar, se essa abordagem é aplicável a um conjunto de dados de teste independente, z-scores foram criados para B. coletiva No entanto, para dicotomização foi utilizado o limite derivado colectiva A. Todos os passos subsequentes foram realizados como descrito para A. coletiva Para correlação entre

HMGA1

e

let-7b

correlação de Pearson foi calculado.

Resultados

Cancro específico Estado miRNA Expressão em alto risco CaP

Foram realizadas análises microarray de miRNA isolado de seis BPH embebidos em parafina e 13 amostras de CaP para triagem de miRNAs candidatos a ser associado com o desenvolvimento ou a progressão da doença de alto risco. Os casos de CaP analisadas foram parte de um coletivo de alto risco bem caracterizado (coorte A) (Tabela 1) e foram selecionados com base em sua evolução clínica. Os casos pré-selecionados CaP foram separados em dois grupos por falha clínica e seguimento sem recorrência da doença (grupo 1: CPFS vs grupo 2: CF). A Tabela 2 mostra as características de câncer de ambos os grupos.

O objetivo desta análise foi para o rastreio de uma assinatura específica miRNA de pacientes com câncer de alto risco com recorrência da doença. Inicialmente, em comparação miARN expressão em todos os casos de CaP 13 de alto risco em conjunto para que da doença benigna. De todos os miRNAs diferencialmente expressos (expressão de mudança dobra 1,5 e p valor 0,05) a maioria dos 61 miRs foram regulados negativamente e 21 miRs foram regulados positivamente na doença de alto risco. Veja a Tabela S1 para a listagem de todos os miRNAs cima e para baixo-regulados. agrupamento hierárquico, com base nos 82 miRNAs diferencialmente expressos selecionados, gerou uma árvore com clara distinção entre a doença maligna ea hiperplasia benigna (Fig. 1A). Mesmo que a comparação foi feita apenas entre a benigna e a doença maligna, um sub-grupo dos tumores com base na sua evolução clínica foi evidente.

. profiling Microarray de 6 de BPH e 13 de alto risco amostras de tecido PCA (coorte A). Estes últimos foram subdivididos por evolução clínica: grupo 1: PCA-alto risco + CPFS (n = 7); grupo 2: CaP de alto risco + CF (n = 6). Linha por linha escalado heatplot de genes que mostram uma mudança dobra 1,5 e um valor de p 0,05. Red indicando expressão elevada, baixa expressão verde. tecidos da próstata cancerosas e não-cancerosas são claramente separados. Clustering indica uma distinção entre o grupo 1 e 2. B. validação técnica dos dados de microarray por qRT-PCR. A expressão relativa de

miR-16

,

-29

, e

-221

foi analisada em 6 BPH (branco) e 13 amostras de CaP de alto risco (cinza). expressão miRNA é mostrado como meio de BPH e expressão CaP de alto risco com barras de erro para o desvio padrão. * Indica p . 0,01, valores de p foram calculados utilizando a 2 amostra teste t de Welch

Para executar uma validação técnica dos resultados da matriz foi analisada a expressão de três dos miRNAs mais diferencialmente expressos, entre outros. Como mostrado na Figura 1B e 2B pudemos confirmar a regulação significativa de

deixe-7a /b /c, miR-16

,

-29

,

-146, – 181 Comprar e

-221

visto antes nos dados da matriz por qRT-PCR.

a. diagrama de Venn mostra as relações entre miRs humanos que foram expressos significativamente diferente (± 1,5 vezes) em CaP grupo 1 vs grupo 2 vs CaP HBP (p adj 0,05). Círculos incluir números de miRs humanos para cima ou para baixo-regulados de cada comparação de pares. miRs comuns entre os diferentes comparações são mostradas em intersecções. caixas cinzentas indicam o status dos

let-7

membros da família expressão. A tabela abaixo lista todos os miRs humanos em que a expressão foi significativamente diferente seja: entre (GR.1 vs. Gr.2), (Gr.2 vs. BPH) e (GR.1 vs. BPH) (coluna vermelha); entre (Gr. 1 vs. gr. 2) e (gr 2 vs. BPH.) (coluna verde); ou entre (gr. 1 vs. gr. 2) e (gr. 1 vs. BPH) (coluna azul). Todos os miARNs são classificados com base na variação máxima expressão dobra. As duas colunas lado a lista de miRNAs indicam uma regulação para baixo para cima ou na expressão (ver setas) e a dimensão da mudança expressão dobra. B. validação dos dados de microarray por qRT-PCR. A expressão relativa de

miR-146b

,

-181b

, e

deixe-7a

/

b

/e

-c

6 foi analisado em BPH (branco), 7 amostras de CaP de alto risco com CPFS (grupo 1) (cinzento claro), e 6 amostras de CaP de alto risco com FC (grupo 2) (cinzento escuro). miARN expressão é apresentado como meio de expressão em tecido BPH e de alto risco, respectivamente, com barras de erro para o desvio padrão. * Indica p . 0,01, valores de p foram calculados utilizando a 2 amostra teste t de Welch

MiR Expressão Perfil do CaP de alto risco com diversos Clínica sobrevida livre de progressão

Based sobre a separação de ambos os grupos de risco pela análise de agrupamento temos a hipótese de encontrar um perfil de miRNA em casos APC com doença progressiva. Portanto, foram analisados ​​os dados de microarray no que respeita à miRs que foram diferencialmente expressos em ambos os grupos de alto risco (dobre mudança 1,5 e valor de P 0,05). O diagrama de Venn na Figura 2A e Figura S1 visualizar a plotagem de todas as miRs humanos que foram diferencialmente expressos em tecido de BPH, em alto risco tecido APC com CPFS, e no tecido de alto risco com CF. No total, 148 miRs foram diversamente expressa em todos os três tipos de tecido. A expressão de sete miRNAs (ou seja,

deixe-7a /c, miR-515-3p /5p, -181b, -146b

, e

-361

) foram encontrados para ser significativamente diferente entre todos os três grupos analisados ​​(HBP, grupo 1 e 2), indicando um perfil específico para miARN CaP de alto risco de doença progressiva. 47 miARNs mostraram expressão diferente do grupo 1 vs Grupo 2; entre os dez melhores miRNAs mais diferencialmente expressos encontramos vários membros da

let-7

família (Fig. S1).

Usando RT-PCR diferenças de expressão análise entre BPH, grupos 1 e 2 para

deixe-7a, deixe-7c

,

miR-146b

, e

-181b

pôde ser confirmada (Fig. 2B). Desde expressão de

let-7b Comprar e

-d

foi mostrado para discriminar, pelo menos, dois dos três tipos de tecidos que incluíam tanto

let-7

membros da família em análises posteriores . Como previsto pelos dados de matriz, o

let-7

membros da família mostraram uma regulação progressiva de benigno a maligno (grupo 1) e após a doença agressiva (grupo 2), enquanto que a expressão de

miR-146b e

-181b

foi menor no grupo 1 (Fig. 2B).

Deixe-7d

expressão era dificilmente detectável por RT-PCR e foi, portanto, excluída em outras investigações.

A expressão de

deixe-7a /b /c

é significativamente regulada para baixo em alto risco CaP

por microarray e análises RT-PCR foram identificados alguns

let-7

membros da família (

deixe-7a-c

) como potencial miRs candidatos para marcadores de diagnóstico e prognóstico em alto risco CaP.

agora queria confirmar estes resultados por experimentos qRT-PCR em nosso toda de alto risco coorte a (n = 98). A análise estatística dos dados de qRT-PCR confirmou a regulação negativa significativa de

let-7a-c

nos casos de CaP de alto risco em comparação com hiperplasia benigna (p≤0.001) (Fig. 3A). Em cerca de 81/84 /e 96% das amostras de tecidos analisados, a expressão de

let-7a /b

e

-c,

respectivamente, era inferior a expressão média das amostras BPH (Fig. 3B), indicando o valor específico de tumor do

let-7

familiares em pacientes com câncer de próstata de alto risco.

a. Box- e suiça-enredo de expressão relativa de

deixe-7a /b /c

em 6 BPH (barra branca) e 98 de alto risco CaP (cinza bar) amostras de tecido. A expressão foi avaliada por qRT-PCR. B. Figura 3B resume a expressão média de

deixe-7a

/

b

/

c

em 6 BPH e 98 amostras APC e mostra o desvio padrão e o valor p correspondente . A expressão média das amostras BPH foi utilizado como limiar. A percentagem de amostras de APC com regulada para baixo

let-7

expressão são mostrados na sexta coluna da tabela. C. Box- e suiça-enredo mostra a expressão de

let-7b

e

-7C

em 98 de alto risco tecido APC e 6 amostras de HPB; avaliada por qRT-PCR. Subgrupos são baseados em: • características do tumor patológico como Gleason Pontuação e estágio do tumor patológico (GS ≤7, pT ≤3a – cinza claro), (GS ≥8, pT ≥3b – cinza escuro) e • características clínico-patológico como BCR, CF, CRD (sem BCR /não CF /não CRD – cinza claro), (BCR /CF /CRD – cinza escuro). A. + C.

Deixe-7a

/

b

/e

-c

expressão é mostrado como meios com barras de erro para o desvio padrão. * Indica P 0,01 (A) ou P 0,05 (C). valores de p foram calculados utilizando a 2 amostra teste t de Welch.

Down-regulação da

let-7b

está associada a características câncer agressivo

Com base na suposição de que alguns

let-7

membros da família estão progressivamente regulada nos casos mais agressivos PCA (grupo 2), postulamos que a infra-regulação da

let-7

também pode ser associado com características clínico-patológico ou prognóstico de pacientes APC. Portanto, nós olhamos para a correlação entre a

deixe-7a /b /c

de expressão e de tumor características do A coletiva CaP como Gleason Score (7≤ GS ≥8), estágio do tumor patológico (3a ≤pT ≥3b) e desfechos clínicos como BCR, CF, e CRD (ver Tabela 2). Encontramos a infra-regulação progressiva da

let-7b

em pacientes com características cancerosas pobres como o alto Índice de Gleason (≥8), recidiva bioquímica e falha clínica (p 0,05) (Fig 3C.). No entanto, a expressão de

deixe-7c

foi correlacionada com apenas CF. Não houve correlação entre o

let-7b

ou

-7C

expressão e tumor patológico fase (3a ≤pT ≥3b) ou CRD (Fig. 3C). Desde

deixe-7a

faltava resultados significativos em termos de características de câncer e desfechos clínicos que negligenciado este miR em nossas análises posteriores (Fig. S2).

Deixe-7b

e

deixe-7c

como prognóstico marcador para a progressão em um de alto risco CaP Coletiva (coorte a)

para determinar se

let-7b

ou

– 7c

poderia servir como um indicador prognóstico para recidiva bioquímica ou falha clínica que dicotomizada um grupo de estudo de alto risco (coorte a) em baixa e alta

let-7b /c

expressão com base em escores z. As estimativas de Kaplan-Meier mostrou uma diferença significativa entre os grupos de let-7b

expressão alta e baixa

em BCR (log rank p = 0,01), enquanto

deixe-7c

mostrou significância limítrofe (log rank p = 0,08) (Fig. 4A). A taxa de sobrevida livre de progressão bioquímica 10 anos foi de 65% e 37% para a expressão alta e baixa

let-7b

, respectivamente. Para

let-7b e

deixe-7c

Kaplan-Meier também estima previu uma diferença significativa entre os grupos de alta e baixa expressão na CF (log rank p 0,001) (Fig. 4A) . 14 de 38 pacientes (37%) com baixa

let-7b

expressão, mas apenas 5 de 60 pacientes (8,3%) no

grupo alta expressão let-7b

foram encontrados para ter experimentado CF.

a análise de Kaplan-Meier para a recaída clínica e bioquímica de 98 e 92 pacientes com doença de alto risco (coorte a e B). Os grupos foram dicotomizados em baixa e alta

let-7b Comprar e –

7c

expressão. As curvas de sobrevivência foram gerados utilizando o pacote Bioconductor “sobrevivência”. análise A. Kaplan Meier da coorte A, os dados de aprendizagem definido (n = 98). análise B. Kaplan Meier da coorte B, o conjunto de dados de teste (n = 92). Low

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expressão está associado a BCR e CF.

A análise de regressão de Cox mostrou que

let-7b

mas não

deixe-7c

expressão era univariada significativa para a predição de BCR (HR 0,36 (0,16-0,82)). Quando

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expressão e Gleason Score foram considerados em conjunto em um modelo multivariado ambas as variáveis ​​previu independentemente BCR. Eventualmente, nós avaliamos se

let-7b

ou

deixe-7c Quais são marcadores independentes para falha clínica em coorte A. A expressão de ambos os miRs são univariada significativa para a predição de falha clínica (Tabela 3). No entanto, em um modelo de regressão multivariada de Cox Pontuação só alta Gleason, mas não

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ou –

c

foram significativamente correlacionada com mau prognóstico

Em resumo. as estimativas de Kaplan-Meier e análise de regressão Cox indicam que a baixa

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e

deixe-7c

expressão pode ser correlacionada com BCR e CF na coorte A.

Validação de

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e

deixe-7c

como prognósticos marcadores em um independente, de testes externos Coletiva (coorte B)

Para validar o papel da

let-7b Comprar e –

c

como marcadores prognósticos que trabalharam com um coletivo independente de casos de PCA-alto risco primários (coorte B). Como já observado para o grupo A foi detectada uma diminuição da regulação significativa de

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e

deixe-7c

em amostras de CaP quando comparado com BPHS (Tabela S2). Criamos níveis z-score com base na Sc analisados ​​

Os dados de ambos t Expression

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s na coorte de testes. Posteriormente, dicotomizada da coorte de teste usando os níveis de corte identificados para A. coletiva Cada amostra foi previsto para ser em alto ou baixo risco para a BCR ou CF com base nesses limites.