Abstract

LIV-1, um transportador de zinco, é uma molécula efectora a jusante a partir de factores de crescimento solúveis. Esta proteína tem mostrado promover epitelial-mesenquimal-a transição (EMT) no pâncreas humano, da mama, da próstata e células cancerosas. Apesar da implicação de LIV-1 no crescimento e na metástase do cancro, não houve nenhum estudo para determinar o papel de LIV-1 na progressão do cancro da próstata. Além disso, não houve definição clara do mecanismo molecular subjacente a uma função LIV-em células cancerosas. Na presente comunicação, que encontraram aumento LIV-1 expressão em, PIN, o câncer de próstata metastático humano primário e ósseo benigno. Nós caracterizado por o mecanismo que conduz LIV-1 EMT cancro da próstata humano num modelo de cancro da próstata metástase óssea células de cancro da próstata refractário a andrógenos (Arcap). LIV-1, quando sobre-expresso em Arcap

E (células derivadas de Arcap com fenótipo epitelial) células, promovido EMT irreversivelmente. LIV-1 sobre-expresso Arcap

E células tinham níveis elevados de HB-EGF e metaloproteinases da matriz (MMP) actividades enzimáticas 2 e MMP 9 proteolítica, sem afectar a concentração de zinco intracelular. A ativação de MMPs resultou no derramamento de fator de heparina crescimento de ligação-epidérmico (HB-EGF) de Arcap

células E que suscitou constitutiva do receptor factor de crescimento epidérmico (EGFR) fosforilação e seu sinal extracelular jusante quinase regulada (ERK) de sinalização. Estes resultados sugerem que LIV-1 está envolvida na progressão do cancro da próstata como um alvo intracelular de sinalização do receptor do factor de crescimento que promoveu EMT e cancro da metástase. LIV-1 poderia ser um alvo terapêutico atractivo para a erradicação do cancro pré-existente humano da próstata, ossos e tecidos moles metástases

Citation:. Lue HW, Yang X, Wang R, Qian W, Xu RZH, Lyles R, et al. (2011) LIV-1 promove o cancro da próstata epitelial-a-mesenquimal Transição e metástases através de HB-EGF derramamento e EGFR-Mediated ERK sinalização. PLoS ONE 6 (11): e27720. doi: 10.1371 /journal.pone.0027720

editor: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de junho de 2011; Aceito: 23 de outubro de 2011; Publicação: 16 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Lue et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiado por bolsas de investigação 2PO1CA098912 e 5RO1CA122602 (LWKC) dos Institutos Nacionais de Saúde /Instituto Nacional do Câncer (https://www.nih.gov) e W81XWH-07-0172 (LWKC) do Departamento de Defesa dos Estados Unidos (https://cdmrp.army.mil/pcrp). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

LIV-1, uma proteína da superfície da célula e um mediador candidato da molécula de sinalização do factor de crescimento induzida, tem sido associada a vários processos biológicos importantes por servir como um transportador para o zinco e outros iões [1], [ ,,,0],2], [3], [4], [5]. Como um protótipo do LIV-1 da subfamília dos transportadores ZIP metais [5], [6], LIV-1 ações estrutura secundária com transportadores ZIP e pode ter a capacidade para transportar íons metálicos. LIV-1 demonstrou ser um mediador a jusante do transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3) e caracol, cooperando com Snail na repressão da transcrição do gene marcador epitelial E-caderina (E-cad) [7]. LIV-1 também demonstrou ser um parceiro de interacção para o receptor de estrogénio (ER) em tecidos sensíveis de hormonas [3], [8]. Na linha celular de cancro da mama ER-positivo ZR-75-1, 1-LIV transcrição é induzida por estrogénios [9]. Em tumores de mama, LIV-1 expressão está associada com o estado ER [10], [11], e é positivamente correlacionada com a propagação do câncer para os linfonodos regionais [12]. No cancro cervical, expressão de LIV-1 mostrou-se mais elevado em tumor do que os tecidos normais; supressão de LIV-1 inibiram significativamente a proliferação de células, a formação de colónias de RNAi-mediada, e a reduzida capacidade migratória e invasiva das células HeLa [13]. LIV-1 também tem sido relatada a ser elevada no carcinoma pancreático clínica e EMT induzida em células de cancro pancreático [14]. No peixe-zebra, LIV-1 é essencial para a localização nuclear de Snail, um factor de transcrição mestre promover epitelial para mesenquimal (EMT), causando a migração de células de gástrula organizar [15]. LIV-1 é, portanto, um co-factor obrigatório que regula genes associados a EMT [14], [15], [16].

O potencial valor de diagnóstico e prognóstico de LIV-1 no cancro da próstata humana não foi investigada. Desde o zinco desempenha um papel importante na manutenção da homeostase celular epitelial de próstata [17], e do caracol é uma célula chave fator de transcrição controle do câncer de próstata EMT [18], [19], [20], LIV-1 pode ser um participante ativo na a promoção da EMT durante a progressão do cancro da próstata e metástases ósseas. Neste estudo, determinou-se o nível de LIV-1 em linhas celulares de cancro da próstata humano e amostras de tecido clínicos para definir a relação entre LIV-1 e da próstata e progressão de metástases do cancro. O modelo de célula progressão do cancro da próstata humano Arcap foi usada para avaliar o papel da LIV-1. O nosso estudo mostrou que a sobre-expressão LIV-1 promove EMT célula de cancro da próstata e facilita a sua metástases para o osso e tecidos moles. Outras investigações mecanicista revelou que LIV-1 superexpressão poderia upregulate HB-EGF e MMP2 e MMP9 expressão. Este último poderia enzimaticamente decompor membrana-vinculado HB-EGF, para produzir solúvel HB-EGF, que constitutivamente activado EGFR via aumento da fosforilação de EGFR e sua sinalização ERK jusante. Os resultados deste estudo demonstram que anormalmente aumentada LIV-1 expressão é um marcador de progressão do cancro da próstata, e activado LIV-1 é responsável pela activação constitutiva de EGFR que acciona EMT. LIV-1 poderia ser um novo alvo terapêutico atractivo para a inibição da EMT câncer de próstata e osso e metástases de tecidos moles.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Todo o trabalho de animais foi conduzido de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais relevantes, e foi aprovado pelo Comitê Institucional de animal Care and Use (IACUC) da Emory University School of Medicine (Permit número 254-2008).

linhas de células e cultura de células

cancro da próstata humano Arcap

e e Arcap

células M (células derivadas de Arcap com epitelial e fenótipo mesenquimal, respectivamente) foram estabelecidos em nosso laboratório [21]. As células foram cultivadas em meio de t-(Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS, Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). células HEK293 de rim embrionário humano foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas em DMEM (Invitrogen) suplementado com 10% de FBS. RPMI-1640 foi adquirido a Invitrogen (Carlsbad, CA). Todos os meios de cultura foram suplementados com penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /ml). As culturas celulares foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada suplementada com 5% de CO

2.

Anticorpos e reagentes

anticorpo policlonal de coelho contra LIV-1 foi gerado no nosso laboratório. Os coelhos foram imunizados por protocolo de imunização padrão de péptido conjugado com KLH-CPDHDSDSSGKDPRNS, correspondente aos resíduos 146-161 da proteína LIV-1 (número de acesso do GenBank NM_012319). Foi retirado sangue 2 semanas após a quarta impulso e IgG foram purificadas e testadas quanto a reactividade imune específica. anticorpo policlonal para E-caderina (E-cad), anticorpo monoclonal para vimentina e anticorpo fosfo-EGFR foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). anticorpo monoclonal para N-caderina (N-CAD) e EGFR foram de BD Transduction Laboratories (San Diego, CA). Os anticorpos para p44 /42 MAP quinase e as isoformas foram fosforilados a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). anticorpo monoclonal para p-actina era da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) e factor de crescimento transformante-β1 (TGF-β1) foram adquiridos de Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX). factor de crescimento epidérmico (EGF) foi de R D Systems (Minneapolis, MN). Tyrphostin AG1478, U0126 e MMP2 /9 inibidor III foram obtidos a partir Alomone laboratórios (Jerusalém, Israel), Cell Signaling Technology (Danvers, MA), e Calbiochem (Darmstadt, Alemanha), respectivamente.

A transfecção

a região de codificação para o ADNc humano LIV-1 completa de comprimento e foi clonado confirmada por sequenciação de ADN. O cDNA foi em seguida clonado a jusante de um promotor precoce do citomegalovírus no mamífero pcDNA3.1 vector de expressão /V5-His (Invitrogen). HEK293 e Arcap

E células foram semeadas a 3 x 10

5 células por poço em placas de 6 poços de 24 horas antes da transfecção. As células foram transf ectadas com 4 ug de a construção de expressão LIV-1 utilizando 8 ul de Lipofectamina 2.000 (Invitrogen). Para isolar clones estavelmente superexpressando Arcap LIV-1, transfectadas

E células foram tratadas com G418 (600 ug /ml) 2 dias depois da transfecção. Quatro clones individuais com superexpressão LIV-1 proteína (LIV # 8, # 12, # 14 e # 17) e dois clones transfectados com vector de controlo (CON1 e CON2) foram utilizados para os estudos.

siRNA knockdown

LIV-1 siARN foi adquirido de Invitrogen. Arcap

M células foram semeadas a 3 x 10

5 células por poço em placas de 6 poços por 24 horas. As células foram transfectadas com 2,5 ul de 20 uM LIV-1 siRNA ou igual quantidade de controlo universal siRNA, utilizando 8 ul de Lipofectamina 2000 por poço. As células foram colhidas e analisadas 48 horas após a transfecção.

A análise da expressão semiquantitativa com reacção em cadeia com polimerase de transcrição reversa (RT-PCR)

O ARN total foi isolado a partir de células cultivadas utilizando o RNeasy Mini Kit ( Qiagen, Valencia, CA). De cada amostra, uma quantidade igual de RNA (2 ug) foi utilizada no primeiro filamento de reacção de síntese de ADNc com o kit de síntese de ADNc Superscript First-Strand (Invitrogen). Volumes iguais de ADNc (3 ul) de cada reacção foram utilizados para análise de PCR, utilizando pares de primers oligonucleotídicos específicos do gene: 5′-GCAATGGCGAGGAAGTTATCT-3 ‘e 5′-CTATTGTCTCTAGAAAGTGAG-3′ para LIV-1; 5’-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3 ‘e 5′-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3′ para E-cad; ; 5’-CCATCACTCGGCTTAATGGT-3 ‘e 5′-GATGATGATGCAGAGCAGGA-3′ para N-CAD; 5’-CGAAAGGCCTTCAACTGCAAAT-3 ‘e 5′-ACTGGTACTTCTTGACATCTG-3′ para caracol; 5’-TGCCCGGCGGAATCTCCTGA-3 ‘e 5′-GATGCAGGAGGGAGCCCGGA-3′ HB-EGF; 5’- GCTGTCTGCGTGGTGGTGCT -3 ‘e 5’TGGTGTGGTGGGTCCAGGGC -3′ para EGF; e 5’-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3 ‘e 5′-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3’ para GAPDH. As reacções foram iniciadas com uma incubação de 4 minutos a 94 ° C, seguido de 30 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 1 minuto. A reacção foi terminada com uma extensão de 7 minutos a 70 ° C durante 7 minutos. Os produtos de PCR foram visualizados após electroforese através de um gel de agarose a 1,2% e coradas por brometo de etídio (0,5 ug /ml).

Western blotting

células em 80% de confluência foram lisadas num conjunto de células tampão de lise como relatado anteriormente [22]. Os lisados ​​foram incubados em gelo durante 30 minutos e centrifugou-se a 10000 rpm a 4 ° C durante 10 minutos. A partir de cada amostra, 35 ug de proteína no sobrenadante foi resolvido por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (BioRad, Hercules, CA), que foi bloqueada em leite desnatado a 5% em PBST (137 mM de NaCl, fosfato 12 mM, 2.7 mM de KCl, e 0,1% de Tween 20) à temperatura ambiente durante 20 minutos, e incubada com anticorpo primário a 4 ° C durante a noite. As membranas foram então lavadas três vezes em PBST e incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano durante 1 hora à temperatura ambiente. Após cinco lavagens em PBST, sinais específicos foram detectados por incubação da membrana com reagente de ECL (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Medição intracelular concentração de zinco

Dois métodos foram utilizados para determinar concentração intracelular de zinco. Para preparar as amostras para o ensaio de zinco intracelular total por parte da espectrometria de massa com plasma acoplado indutivamente (ICP-MS), células cultivadas em 80% de confluência foram tratadas com tripsina e lavadas em PBS, e depois incubado em 300 ul de ácido nítrico a 70% a 37 ° C durante 2 horas. As células foram então colocadas em ácido nítrico a 2% e submetido a ICP-MS com um instrumento Varian. Uma curva padrão foi gerada com diluições em série de padrões de instrumentos de zinco. Para preparar as amostras para o ensaio de zinco lábil intracelular por um método fluorométrico, as células foram semeadas a 3 x 10

5 células por poço em placas de 6 poços um dia antes da medição. As células foram carregadas com 2 uM de FluoZIN-3 AM (Invitrogen) durante 1 hora em Opti-MEM contendo 0,02% de Pluronic F127 (Invitrogen). Após lavagem em PBS, as células carregadas foram incubadas em livre de indicador de Opti-MEM durante 30 minutos. Fluorescência do FluoZin-3 foi medida usando um Victor PE

3 V leitor de placas.

ferida risco de cura ensaio

Arcap

células M transfectadas transitoriamente com LIV-1 siRNA ou controle de siRNA universal foram usadas para determinar o comportamento migratório. As células foram suavemente e lentamente riscada com uma ponta de pipeta de 10 uL através do centro do poço 48 horas após a transfecção. Depois de coçar, o poço foi lavado suavemente duas vezes com meio para remover as células destacadas. O poço foi reposto com meio fresco. As fotografias foram tiradas 48 horas depois de coçar. Vários pontos de vista de cada poço foram documentados, e três experimentos independentes foram realizadas.

migração Trans-bem e invasão ensaios

Para realizar um ensaio de migração trans-well, 2,5 × 10

4 as células na câmara de topo de 24 poços, placas de Transwell de 8 um de tamanho de poro (BD Biosciences) foram incubados durante 16 horas em meio completo que foi adicionada à câmara inferior. As células foram então fixadas com formalina e coradas com violeta de cristal a 0,5%. As células que não migraram para dentro da câmara foram removidas por raspagem. O violeta de cristal para as células que migram foi solubilizado em tampão de Sorenson (0,1 M de citrato de sódio e 50% de etanol, pH 4,2) e mediu-se a absorvância a OD

590. O ensaio de invasão foi realizada utilizando câmaras de invasão BD BioCoat Matrigel (BD Biosciences; 8 mm de tamanho de poro). Os mesmos procedimentos descritos acima foram utilizadas, excepto os filtros foram pré-revestidas com 100 uL de Matrigel a uma diluição de 1:04 em meio RPMI-1640.

Avaliação de potenciais tumorigénicas e metastáticos

O funcional papéis de LIV-1 na formação de tumores e metástases da próstata foram avaliadas como descrito anteriormente [23]. Para avaliar o crescimento local do tumor, os ratos do sexo masculino atímicos 4 semanas de idade (Ncr-nu /nu, National Câncer Institute, Frederick, MD) foram inoculados subcutaneamente com Arcap

células E (1 × 10

6 em 50 ul PBS) transduzidas estavelmente com LIV-1. dimensão do tumor foi medido com um compasso de calibre nos dias 23, 32, 43, e 50 após a injecção, e o volume do tumor foi calculado como comprimento x largura x altura x 0,5236 [24]. Para avaliar as metástases cancerosas, ratinhos atímicos machos foram inoculados com intracardiacally Arcap

células E (2 × 10

6 em 100 ul de PBS) estavelmente transduzidas com LIV-1 para os ventrículos esquerdos. Os animais foram observados durante 4 meses para o desenvolvimento de lesões metastáticas. metástases ósseas foram gravadas por radiografia de raios-X e metástases tecidos moles foram confirmados por exame histopatológico

imuno-histoquímica (IHQ) de tissue microarray (TMA)

Os tecidos normais e doentes da próstata analisadas eram de.: 1) Uma feito por encomenda TMA com tecidos normais da próstata a partir de 4 homens saudáveis; câncer combinados, e tecidos PIN benignos de casos de câncer de próstata 12; combinando tecidos benignos e de cancro a partir de 11 casos; combinado PIN e câncer a partir de 1 caso; A hiperplasia prostática benigna (BPH) a partir de 2 casos; e câncer de próstata metástase óssea de casos de câncer de próstata 3. 2) Uma feito por encomenda TMA consistiu de 47 osso tecidos metástase de pacientes com câncer de próstata 11. 3) Quatro TMA contendo cada 66 casos de cancro da próstata e doenças da próstata benigna (US Biomax. Rockville, MD).

O protocolo de IHQ para avaliar a expressão de genes tem sido relatada [22]. Resumidamente, os espécimes foram desparafinizadas, reidratadas e submetido ao antigénio de recuperação. Após o bloqueio da peroxidase endógena, as amostras foram incubadas com anticorpo primário a 4 ° C durante a noite, seguido de uma incubação de 30 minutos com o reagente DakoCytomation EnVision + HRP. Os sinais foram detectados pela adição de diaminobenzidina como cromógeno e contracoloração pela hematoxilina. soro de coelho pré-imunização serviu como controlo negativo. coloração IHC foi pontuado por dois investigadores, independentemente, com base em quatro intensidades de coloração de 0 a +++ como relatado anteriormente [22].

Gelatina zimografia

Todos os reagentes zimografia foram adquiridos a Invitrogen. As células foram cultivadas em meio RPMI1640 isento de soro durante 24 horas e o meio condicionado foi recolhido. Proteína no meio foi concentrada com um filtro AmiconUltracel 30 kDa (Millipore, Billerica, MA). Quantidades iguais de proteína (10 ug /amostra) foram misturados com 2 × tampão de amostra de Tris-glicina Novex de SDS, e fraccionado num gel de gelatina a 10% sob condições não redutoras. O gel foi então incubada a 37 ° C em tampão de renaturação de 30 minutos e no desenvolvimento de tampão durante 30 minutos. Finalmente, o gel foi corado em SimplyBlue SafeStain, e as bandas que representam a actividade de gelatinase de MMP2 e MMP9 foram quantificados.

ensaio de imunossorvente ligado a enzima (

ELISA) para HB-EGF

As células foram cultivadas em meio RPMI1640 isento de soro durante 24 horas. O meio condicionado foi recolhido e analisado quanto à concentração de HB-EGF com o kit humano HB-EGF DuoSet ELISA (R D Systems), seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Cada amostra a partir de três experimentos independentes foi ensaiada em triplicado.

A análise estatística

Para analisar a associação potencial da LIV-1 progressão do câncer de expressão da proteína e da próstata a partir de /benignos, neoplasia intraepitelial prostática normais (PIN ), cancro primário localizada, a metástase óssea, o nível de expressão LIV-1 foi dividido em duas categorias: intensidade de coloração de alta (3) contra o meio para null (2-0, respectivamente). O teste não-paramétrico de Kruskal Wallis foi usado para determinar a igualdade das medianas populacionais entre progressões de câncer de próstata de, PIN, câncer primário, e metástase óssea normal /benigno. Este ensaio é equivalente ao teste de ANOVA paramétrica utilizada quando existem mais do que dois grupos a ser comparados. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney foi aplicado para determinar a igualdade das medianas populacionais entre duas progressões de câncer, 1) metástase óssea vs. câncer localizado; e 2) metástase óssea vs. câncer localizado benigna, PIN, e primário. Este ensaio é equivalente ao teste t paramétrico utilizado quando existem apenas dois grupos a ser comparados. A regressão logística foi usada para modelar a relação entre a pontuação de Gleason binários que foram divididos em variáveis ​​binárias de bem diferenciado (GI≤6) vs. moderada a (GI≥7) cancro da próstata pouco diferenciado. SAS e Minitab foram utilizados nesta análise.

Resultados

O cancro da próstata humana células Arcap estabelecidos em nosso laboratório [21] pode ser prontamente promovido a sofrer EMT em resposta a fatores solúveis e proteínas da matriz presentes no microambiente tumoral [20], [25], [26], [27]. Para elucidar o mecanismo molecular que regula a EMT, epitelial Arcap

E foi analisado para expressão diferencial de genes em resposta a factores solúveis, em comparação com o seu Arcap

H homólogo que apresentaram um fenótipo mesenquimal. LIV-1 era um dos genes diferencialmente expressos identificados [27]. No presente estudo, investigamos o papel de LIV-1 na regulação da EMT em células Arcap para avaliar o possível mecanismo de LIV-1 ação na promoção do osso câncer de próstata e de metástases de tecidos moles.

LIV-1 estava envolvido na promoção de EMT no modelo celular Arcap

relatado anteriormente que Arcap

e células EMT submetidos quando tratados com factores solúveis, incluindo IGF-1, EGF, TGF-β1 e β-2 microglobulina (β -2m) [20], [25], [26], [27]. No presente estudo, quando Arcap

E células foram tratadas com TGF-β1 ou IGF-1, uma indução da expressão LIV-1 foi detectada por ambos RT-PCR e análise de mancha Western (Figura 1A). Quando diferentes concentrações de IGF-1 foram adicionados ao meio de indução, a capacidade de resposta de um LIV-expressão se verificou ser dependente da dose (Figura 1A). induzida por IGF-1 LIV-1 na expressão Arcap

E células ocorreu concomitantemente com um interruptor da morfologia celular e a expressão de genes para o fenótipo mesenquimal,

ie

, a perda de morfologia epitelial polarizada com força adesiva para se tornar fracamente disperso células fibroblásticas, com um aumento da expressão de N-CAD e vimentina, mas a diminuição da expressão de e-cad, uma característica retido por células epiteliais polarizadas (Figura 1B). Activado LIV-1 expressão parecia ocorrer concorrentemente com a transição de Arcap

E para Arcap

M, uma variante Arcap mesenquimais [21].

O papel de LIV-1 foi avaliada pela sua mudado expressão durante a EMT. A, Arcap

E células foram tratadas durante 48 horas com factores de crescimento para induzir EMT. RT-PCR e transferência de Western foram usadas para mostrar aumento da expressão LIV-1 (painel da esquerda), e a capacidade de resposta de dose de expressão (painel da direita) a. B, Western blot foi utilizada para confirmar as alterações Expressional EMT-like no Arcap tratados

células E. C, células mesenquimais, como Arcap

M células foram submetidas a siRNA knockdown para LIV-1 expressão durante 48 horas. RT-PCR e transferência de Western foram usadas para detectar alterações reflectem Expressional reversão de EMT nas células tratadas. D, cicatrização de feridas zero e transpoço invasão ensaios foram utilizados para determinar o comportamento migratório e invasivo em Arcap tratada siRNA

células M. * Indica a significância estatística comparativamente ao clone de controlo CON1 (P 0,05). E, Arcap

células E foram transfectadas com LIV-1 construção de expressão. RT-PCR e transferência de Western foram realizadas 48 horas após a transfecção para detectar alterações reflectem eventos Expressional EMT-like. GAPDH serviu como um controlo interno para as reacções de RT-PCR, e β-actina foi utilizado como um controlo de carga em Western blotting.

Para definir o papel de LIV-1 na mediação da EMT, que transitoriamente reduzida o nível LIV-1 no mesenquimais-like Arcap

células M por siRNA knockdown. Arcap

células M tratados com específica LIV-1 siRNA mostraram uma redução marcada LIV-1 transcrições (Figura 1C). Importante, as células tratadas apresentaram a diminuição da expressão de marcadores mesenquimais N-CAD e caracol, mas o aumento da expressão do gene da E-cad, tanto por RT-PCR e análise de mancha Western (Figura 1C). Além disso, Arcap

células M tratados com específica LIV-1 siRNA exibiram muito reduzida capacidade migratória e invasivo em risco de cicatrização de feridas e transpo� ensaios de invasão (Figura 1D). Estes resultados sugeriram que LIV-1 está associado com a expressão de EMT e diminuiu-LIV uma expressão que leva a transição epitelial para mesenquimal (TEM), uma reversão de EMT. A presença de LIV-1 pareceu ser necessária para a manutenção de um fenótipo mesenquimal.

próxima examinado se elevados LIV-1 nas células

E Arcap-epiteliais, como seria suficiente para iniciar a EMT, tal como determinado por análises moleculares. Após a transfecção transiente com uma construção de expressão LIV-1, Arcap

E células foram examinadas por tanto por RT-PCR e ensaios de transferência Western para a expressão de marcadores de EMT-associados. O Arcap transfectadas

células E exibidos aumentou acentuadamente LIV-1 expressão (Figura 1E), acompanhado pelo aumento da N-cad e caracol, mas uma expressão de E-cad diminuiu. Estas alterações Expressional estavam de acordo com aqueles observados em EMT factor de crescimento induzida (Figura 1B). Os resultados de LIV-1 knockdown siRNA e LIV-1 Estudos superexpressão em Arcap

M e Arcap

células E sugeriu que LIV-1 serve um regulador chave da EMT em células cancerosas humanas da próstata.

Produção e caracterização de anticorpos policlonais para LIV-1 humana

Para avaliar se um LIV-expressão está associada com a progressão clínica do cancro da próstata humano, que levantada anticorpos policlonais por imunização de coelhos com um péptido KLH conjugada LIV-1. Especificidade de anticorpos LIV-1 foi confirmada por transferência de Western dos extractos de células completas a partir de células que sobre-expressam exógeno LIV-1. A partir das células HEK293 transientemente transfectadas com LIV-1, observou-se uma única proteína imuno-reactiva LIV-1, a 110 kDa (Figura 2A). Uma vez que o peso molecular calculado de LIV-1 proteína é de 90 kDa, [5], o diferencial de 20 kDa entre os detectados e os tamanhos previstos foram provavelmente atribuído a glicosilação N-ligada da proteína LIV-1, como descrito anteriormente [5]. Importantemente, o sinal detectado por anticorpos os LIV-1 foi abolido quando os anticorpos foram pré-adsorvidos com o péptido LIV-1 usado na imunização. Além disso, o aumento da intensidade de sinal foi detectado em Arcap

células E transitoriamente transfectadas com a construção de expressão LIV-1, enquanto que uma redução do sinal foi visto em Arcap

células M tratada com uma LIV-1 vetor knockdown transiente em ambos transferência de Western e ensaios IHC (Figura 2B e 2C). Estes resultados indicaram que os anticorpos produzidos LIV-1 poderia detectar especificamente LIV-1 de proteína, que foi modificado nas linhas celulares testadas.

Os anticorpos produzidos em LIV-1 foram submetidos a validação para a especificidade. Um, células HEK293 transientemente transfectadas com a construção de expressão LIV-1 foram submetidos a análise de transferência de Western com os anticorpos para LIV-1 (painel superior). A especificidade dos anticorpos foi determinada através da pré-absorção do anticorpo com o péptido imunizante (painel do meio). B,

sub células E Arcap foram transientemente transfectadas com a construção de expressão LIV-1 para sobre-expressar

células LIV-1 e M Arcap com o siRNA específico para suprimir a expressão LIV-1. Nos painéis superiores 2, transferência de Western foi realizada 48 horas mais tarde com os anticorpos para LIV-1. Nos painéis inferiores 2, estas células foram analisadas por RT-PCR para confirmar a expressão LIV-1. β-actina foi utilizado como controlo em Western blotting e GAPDH foi usada como controlo para a análise de RT-PCR. C, IHC foi conduzido para confirmar ainda mais a especificidade LIV-1 Ab em Arcap

células E transitoriamente transfectadas com a construção de expressão LIV-1 e

células Arcap M transitoriamente transfectadas com o siRNA específico (200 ×).

Stable LIV-1 superexpressão EMT induzida em

células E Arcap

na sequência knockdown transitória de LIV-1 em Arcap

células M, uma reversão esperada da forma da célula mesenquimais fibroblásticas a morfologia epitelial foi observada. Estes switches morfológicas foram facilmente detectável por alterações de expressão gênica (Figura 1C). Em contraste, transitoriamente superexpressão LIV-1 em Arcap

células E não induziu mesenquimais transição morfológica, apesar das mudanças Expressional concertadas indicativo de EMT (Figura 1E). Nós suspeita de que a ausência de alterações na morfologia pode ser atribuível à natureza da transfecção transiente. Por conseguinte, sub

E Arcap clones estáveis ​​foram estabelecidos para avaliar se LIV-1 é um regulador crítico associado com morfológicas, bem como a transição do expressional e comportamentais numa epitelial para um fenótipo mesenquimal.

4 isolada Arcap

clones de e (LIV # 8, 12, 14 e 17) que expressam estavelmente elevados níveis de proteína LIV-1, como detectado por Western blotting (Figura 3A). Dois clones de controlo (Con1 e CON2) também foram isoladas a partir da transfecção com o vector de controlo. Os superexpressam LIV-1 apresentaram alterações Expressional EMT-like típicas, com a diminuição da expressão de E-cad, mas aumentou N-cad e expressões Caracol (Figura 3A). Significativamente, todos os clones mostrou acentuadamente diferente morfologia celular: em vez do tamanho de pequenas células com forma de paralelepípedos, como com firmemente dispostos contato intercelular típica da célula-like epitelial Arcap

E, todos os quatro clones adaptados morfologia notavelmente alterado exibindo uma perda de contacto intercelular e a morfologia das células mesenquimais em forma de fuso típica (Figura 3B). A transição morfológica era permanente e irreversível, que persistiu após mais de 30 passagens em cultura contínua, enquanto que os dois clones transfectados com vector permaneceu tipo célula epitelial. Parece que estável LIV-1 superexpressão poderia trazer tanto morfológica e de transição EMT bioquímica. LIV-1 é assim um potente promotor de EMT em Arcap

células E.

Arcap

clones E com superexpressão LIV-1 demonstraram alterações EMT-como na expressão genética, morfologia celular e comportamento. A, todos os quatro LIV-1 sobre-expressam Arcap

E clones mostrou mudanças Expressional EMT-como detectado por transferência de Western, enquanto que os dois clones de controlo do vector (1 e 2) manteve um perfil de expressão de células do tipo epitelial. B, morfologia celular dos LIV-1 células com superexpressão mostrou alterações marcantes dos clones de controlo (200 ×). C, LIV-1 células com superexpressão (LIV Nº 8 e LIV # 14 foram comparados com clones de controle de vetores 1 e 2 e dos pais Arcap

E e

células Arcap M para a capacidade migratória alterada em transpo� ensaios. Cada resultado é a significa ± desvio padrão de um ensaio triplicado. D, o LIV-1 superexpressão # 8 e # 14 clones foram comparados com clones de controle de vetores 1 e 2 e dos pais Arcap

e e

células Arcap M para invasão alterada. * indica significância estatística comparativamente ao clone de controlo CON1 (

P

0,05).

os efeitos de LIV-1 em mudanças comportamentais foram avaliados para a sua promoção da migração celular e invasão em ensaios de câmara de Boyden. Enquanto o controle neo transfectadas Arcap

clones e mostrou capacidades de migração e invasão similares que imitam de perto as dos Arcap

células e, ensaios repetidos parental revelou que LIV-1 superexpressão conferido significativamente maior capacidade migratória (Figura 3C) e potencial invasivo para penetrar matrizes extracelulares (Figura 3D). Tomados em conjunto, estes dados suportam a noção de que o aumento dos níveis LIV-1 promover a motilidade e comportamentos invasivos de células cancerosas da próstata.

LIV-1 formação superexpressão tumor de próstata promovido e metástases à distância

in vivo

Foi examinado o papel de LIV-1 expressa de forma estável em ARCAP

células e na modulação de comportamentos tumorigênicos e metastáticos subsequentes em camundongos. Nós comparamos o crescimento metastático local e distante do Arcap

tumores E por protocolos de inoculação de células tumorais subcutâneos e intracardíacos, como descrito anteriormente [21], [23].

Após a implantação subcutânea, LIV-1 clones com superexpressão induzida a incidência semelhante de formação de tumores para os controlos transfectados com vector, tendo cada grupo 6 tumores a partir de um total de 8 inoculações.