Abstract

A radioterapia (RT) continua a ser uma das opções de tratamento mais populares para câncer de próstata localizado (PAC). O objetivo do estudo foi investigar a

in vitro

efeito sozinho LBH589 e em combinação com RT no crescimento e na sobrevivência de linhas celulares PAC e os possíveis mecanismos de radiossensibilização desta terapia de combinação. O efeito de LBH589 sozinho ou em combinação com RT em duas linhas de CaP de células (PC-3 e LNCaP) e de uma linha normal da próstata de células epiteliais (RWPE-1) foi estudado por MTT e ensaios clonogénicos, análise do ciclo celular, Western blotting de apoptose proteínas de pontos relacionados com e seleção de células e de DNA duplas marcadores reparação quebra vertente (DSB). A imunofluorescência foi usado para confirmar ainda mais expressão DSB em células PAC tratados. Nossos resultados indicam que LBH589 inibiu a proliferação em ambas PAC e células epiteliais prostáticas normais de uma maneira tempo-e-dependente da dose; baixa dose de LBH589 (IC

20) combinado com RT melhorado significativamente a eficiência de morte celular em células de tampa; em comparação com sozinho TA, o tratamento de combinação com LBH589 e RT induzida mais apoptose e levou a um aumento constante da população sub-G1 e extinção de G2 induzida por RT /paragem H, aumentada e persistente ORL, menos a activação de extremidade não-homóloga juntando (NHEJ) /recombinação homóloga (HR) vias de reparação e um painel de proteínas relacionadas com o ciclo celular. Estes resultados sugerem que LBH589 é um potencial agente para aumentar a radiossensibilidade das células CaP humanos. LBH589 utilizado quer sozinho, ou em combinação com RT é uma estratégia atractiva para o tratamento de CaP humano

citação:. Xiao W, Graham PH, J Hao, Chang L, Ni J, CA alimentação, et ai. (2013) Terapia Combinada com a histona Deacetylase Inhibitor LBH589 e radiação é um regime eficaz de células cancerosas da próstata. PLoS ONE 8 (8): e74253. doi: 10.1371 /journal.pone.0074253

editor: Hari Koul, University of Colorado, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de outubro de 2012; Aceito: 02 de agosto de 2013; Publicação: 26 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Xiao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi em parte apoiada por um Desenvolvimento da Irmandade da carreira de Conselho Nacional de Saúde Medical Research (YL), Austrália; St George Fundo Hospital Cancer Research Trust (PHG), Sydney, Austrália; e ao China Scholarship Council (WWX), China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

opções de tratamento atuais para Cap localizada são a radioterapia (RT), cirurgia e terapia endócrina. Embora a radiação agressiva não melhorar o controle bioquímico, maiores toxicidades retal e urinária também ocorreu [1]. falha local após RT permanece 20% -35% em pacientes intermediário e Cap-alto risco [2], levando ao aumento de metástases e menor sobrevida. Assim, a investigação de uma nova abordagem combinação com um radio-sensibilizador seletivo com RT para melhorar é urgentemente necessária CaP radiossensibilidade.

histona deacetilase inibidores (HDACi) são um grupo emergente de agentes que tem como alvo histona deacetilase (HDAC) e radiosensitizers promissores atualmente sob investigação. Radiossensibilização por HDACi, tais como ácido valpróico [3] tem sido demonstrada em estudos pré-clínicos. HDACi é um potente indutor ou regulador de comportamentos celulares, tais como os processos de apoptose, do ciclo celular e de reparação do ADN. Acredita-se que exercem os seus efeitos principalmente por modificação de estruturas de histonas da cromatina e, assim, modular a transcrição de genes [4]. Além disso, estes acetilases e desacetilases também pode modular funções celulares independentes da expressão do gene, agindo sobre as proteínas não-histonas, tais como p21 [5], p53 [6], Ku70 [6]. Através agindo sobre uma série de proteínas de histonas e não-histonas, HDACi é capaz de mediar a apoptose, ciclo celular, e processos de reparação de ADN de um modo bem orquestrada.

LBH589 é um derivado de ácido hidroxâmico e um pan-novela HDACi [7]. Qian et ai. relataram que LBH589 sozinho reduziu a angiogénese e o crescimento tumoral num modelo de xenoenxerto de animais PC-3 [8]. Um estudo de fase I foi conduzida por tratamento de pacientes resistente à castração cancro da próstata (CRPC) usando LBH589 oral com ou sem docetaxel, demonstrando resultados promissores para uma futura aplicação clínica [9]. Estes resultados suportam a hipótese de que LBH589 pode ser útil em combinação com RT para tratar localizada CaP.

Neste estudo, a hipótese de que LBH589 poderia matar as células PAC e tratamento de células boné com LBH589 antes RT iria aumentar a sensibilidade de células tampa para RT.

Materiais e Métodos

Chemicals e anticorpos

LBH589 (panobinostat) foi adquirido a Selleck Chemicals (Selleck Chemicals South loop Oeste, Houston, TX, EUA). Outros produtos químicos utilizados foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Austrália), salvo indicação em contrário. Os anticorpos primários e secundários utilizados neste estudo são apresentados na Tabela 1.

Antibody

Origem e Tipo

Diluição

O tempo de incubação

Temperatura

Aplicação

coelho anti-humano caspase-3 (Pro) EpitomicsMAb1: 1000o /N4

° CWBRabbit EpitomicsMAb1 anti-humana caspase-3 (ativo): 1000o /N4

° CWBRabbit anti-humana histona H3 (K9 acetil) AbcamPAb1: 500 ° /N4

° CWBRabbit anti-humana histona H4 (K8 acetil) AbcamPAb1: 500 ° /N4

° CWBRabbit p21AbcamPAb1 anti-humana: 1000o /N4

° CWBRabbit anti-humana p-p53AbcamPAb1: 1000o /N4

° CWBMouse p53AbcamMAb1 anti-humana: 1000o /N4

° CWBRabbit fosfo-CDK1 (Tyr15) celular anti-humana de Sinalização TechnologyPAb1: 1000o /N4

° CWBRabbit Cdk1 AbcamPAb1 (cdc2) anti-humana: 10000o /N4

° CWBRabbit anti-humana p-Chk-1AbcamPAb1: 1000o /N4

° CWBRabbit anti-humana Chk-1AbcamPAb1: 1000o /N4

° CWBRabbit anti-humana p-Chk-2AbcamPAb1: 500 ° /N4

° CWBRabbit anti-humana Chk-2AbcamPAb1: 500 ° /N4

° CWBRabbit fosfo-Rb (Ser795) celular anti-humana de Sinalização TechnologyPAb1: 1000o /N4

° CWBRabbit anti-humana fosfo-Rb (Ser807 /811) Cell Signaling TechnologyPAb1: 1000o /N4

° CWBMouse RbAbcamMAb1 anti-humana: 1000o /N4

° CWBMouse anti-humana γH2AXAbcamMAb 1: 500 (IF) 1: 1000 (WB) o /N4

° CIF WBRabbit anti- Ku70EpitomicsPAb1 humana: 1000o /N4

° CWBRabbit Ku80EpitomicsPAb1 anti-humana: 1000o /N4

° CWBMouse anti-humana BRCA1AbcamMAb1: 200 (IF) 1: 200 (WB) o /N4

° CWB, IFRabbit anti BRCA2AbcamPAb1 -sangue humano: 200 (IF) 1: 1000 (WB) o /N4

° CWB, IFMouse RAD51AbcamPAb1 anti-humana: 100 (IF) 1: 1000 (WB) o /N4

° CWB, IFMouse anti GAPDHMilliporeMAb1 -sangue humano: 500 ° /N4

° CWBMouse anti-humana controlDakoIgG11 IgG1-negativos: 1000o /N4

° CIFGoat anti-IgG de coelho-HRPSanta Cruz BiotechnologyIgG1: 500045 minroom temperatureWBGoat anti-IgG de ratinho-HRPSanta Cruz BiotechnologyIgG1: 500045 . minroom temperatureWBGoat anti-rato Alexa Fluor® 488 Dye ConjugateInvitrogenIgG1: 100045 minroom temperatureIFTable 1. Os anticorpos utilizados para western blot e imunofluorescência

Notas: MAb: anticorpo monoclonal; o /n: durante a noite; PAb: anticorpo policlonal; WB: Western blotting; SE: imunofluorescência; HRP: peroxidas rábano CSV Baixar

cultura celular

Os PC-3 e responsivos aos andrógenos linhas de células LNCaP CaP andrógeno-não-responsivos CSV, ea linha de células normais da próstata humana RWPE-1 foram obtidos a partir Americana Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, EUA). As células PC-3 e LNCaP foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% (vol /vol) de soro fetal de bovino aquecida inactivado (FBS), 50 U /mL de penicilina, e 50 ug /mL de estreptomicina, enquanto as células RWPE-1 foram cultivadas em meio suplementado K-SFM por 0,2 ng /ml de factor de crescimento epidérmico recombinante (RegF) e 25 ug /mL de extracto de pituitária bovina sem FBS. Todas as linhas de células foram mantidas numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO

2.

MTT ensaio

A proliferação celular foi avaliada no tampão e linhas de células da próstata normais após o tratamento LBH589 utilizando um ensaio MTT após um método de publicada [10]. Resumidamente, as células 2000 foram semeadas em placas de 96 poços foram incubadas em meios de cultura durante 24 h. As células foram então tratadas com uma gama de concentrações de LBH589 (0 ~ 20 umol /L) ou o mesmo volume de controlo de DMSO em meio fresco durante mais 24, 48 e 72 h, respectivamente. A absorvância (DO) foi lida a 560 nm num leitor de BIO-TCE de micro-placa (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes. Os resultados são representados como a razão OD das células tratadas e de controlo.

ensaio de formação de colónias

, LNCaP e células PC-3 RWPE-1 IC

20 (concentração inibitória 20%) de LBH589 em 24 horas foi calculada e escolhida para as experiências seguintes. foram utilizados para ensaios de formação de colónias, tal como descrito anteriormente com modificações menores [10]. Resumidamente, 1,5 ~ 2 × 10

6 PC-3, as células LNCaP e RWPE-1 foram tratados em disco de 6 cm com LBH589 na respectiva IC

20 concentrações ou mesmo volume de DMSO (controlo) durante 24 h e em seguida, 200 ~ 2 × 10

5 as células foram semeadas em placas de 6 cm pratos. Após 8 horas de recuperação, as células tratadas com LBH589 e de controlo tratados com DMSO foram expostas a uma única dose de irradiação (0-8 Gy), à temperatura ambiente, utilizando um acelerador linear (Elekta, Estocolmo, Suécia) a uma taxa de dose de 2,7 Gy /min com 6 MV de fótons (Centro Cancer Care, St George Hospital, Sydney, Austrália). Após RT, todas as células foram imediatamente lavadas com meio isento de droga. Após 14 dias de incubação, as células foram coradas com violeta de cristal. As colónias, definidos como grupos de 50 células, foram contadas manualmente com o auxílio de um Olympus INT-2 microscópio invertido (Tóquio, Japão). células de dados de RT isoladamente ou a combinação tratado (LBH589 e RT) foram normalizados contra as células irradiadas-un (marcados como 100% colónia capacidade de formação).

Fluxo de análise de citometria de distribuição do ciclo celular

0,5 ~ 2 × 10

6 PC-3 e LNCaP CaP células foram semeadas em placa de 10 cm, durante 24 h, depois tratou-se com LBH589 na respectiva IC

20 concentrações ou DMSO (controlo) durante mais 24 h antes de submetido a 2 Gy RT. Em pontos de tempo específicos (pré-RT, 2, 6, 12, 24, 48 e 72 h após a 2 Gy), tratadas com tripsina as células aderentes e flutuantes foram recolhidas e fixadas em frio a 70% (v /v) de etanol a 4 ° C. Histogramas de conteúdo de DNA foram analisados ​​utilizando software FlowJo (V.7.6.1, Árvore Star, Inc., Oregon, EUA) para determinar a distribuição do ciclo celular (G1 subs, G1, S e G2 /M).

proteínas por coloração de imunofluorescência γH2AX e reparação RH pathway

células PC-3 e LNCaP PAC foram tratados com o mesmo protocolo, tal como descrito na análise de ciclo celular (ver acima). Depois de receber 2 Gy RT, células tratadas com DSMO-LBH589 tratados e foram submetidas a coloração por imunofluorescência em pontos de tempo específicos (pré-RT, 24, e 72 h após a 2 Gy). A preparação de células por imunofluorescência foi como previamente descrito com modificações [11,12]. As células coradas foram examinadas utilizando um /FV500 Olympus de varrimento a laser confocal FV300 microscópio (Olympus, Tóquio, Japão) e as imagens foram capturadas. Para cada condição de tratamento, γH2AX, BRCA1, BRCA2 e RAD51 focos foram determinados em pelo menos 50 células. A contagem dos γH2AX, BRCA1, BRCA2, e focos nuclear RAD51 nestas células foi realizada por dois observadores independentes (WWX e JLH).

Western blot

PC-3 e LNCaP CaP células foram tratado com o mesmo protocolo, tal como descrito na análise de ciclo celular (ver acima). células tratadas com LBH589 e de controlo foram submetidos a 2 Gy RT. Ambas as células flutuantes e aderentes foram colhidas nos pontos de tempo específicos (pré-RT, 2, 6, 12, 24, 48 e 72 h após a 2 Gy) para transferência de Western como descrito anteriormente [13]. As membranas foram incubadas com diferentes anticorpos primários e peroxidase de rábano (HRP) marcado com anticorpos secundários em condições específicas (Tabela 1). sistema ImageQuant LAS4000 (cuidados GE Saúde, EUA) foi utilizado para a gravação de imagem.

A análise estatística

Todos os experimentos foram realizados pelo menos três vezes (n = 3). Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (SD). Para as experiências de irradiação, as fracções de sobrevivência foram calculados como se segue: SF = [média plaqueamento eficiência de radiação (± LBH589) células tratados dividido pela média plaqueamento eficiência de controlo (± LBH589)]% de sobrevivência fracções de células tratados com combinação foram corrigidos para a citotoxicidade de LBH589. curvas de sobrevida RT foram ajustados de acordo com o modelo linear-quadrática usando GraphPad Prism software 4.0 (GraphPad, San Diego CA):

Survival = e

– (aD + βD

2)

foram calculados os seguintes parâmetros: valor α, valor β, valor α /β, ID90, id

50, e ID10 (RT dose que produz uma fracção de sobrevivência de 10%, 50%, e 90%, respectivamente) ; e SF2 (fracção sobrevivente com 2 Gy). O efeito sensibilizador de LBH589 foi representado pelo factor de intensificação da dose (DEF), calculado como o ID

50 para células tratadas RT dividida pelo ID

50 para células tratadas com combinadas [14]. ANOVA two-way foi usada para estudar a influência da dose de RT e LBH589 sobre os parâmetros de resultados (por exemplo, fracção de sobrevivência, a distribuição do ciclo celular, γH2AX número de focos). Um teste t de duas amostras foi usado para comparar a porcentagem média de subs G1, G1, S e G2 /células em fase M e a média γH2AX, BRCA1, BRCA2, RAD51 focos número entre duas condições de tratamento específicos. diferenças significativas possíveis (

p Art 0,05) foram avaliados usando SPSS v 16.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA)

Resultados

O efeito da LBH589 sozinho. na proliferação de células usando células PAC e células epiteliais da próstata normais

O tempo eo efeito de inibição da proliferação celular dependente da dose foi encontrada em ambas as células tampa (PC-3 e LNCaP) e células epiteliais da próstata normais (RWPE-1) (Figura 1A). IC

20 valor às 24 h para PC-3, LNCaP e RWPE-1 foi de 10 umol /L, 2,5 nmol /L e 15 nmol /L, respectivamente, sugerindo que duas linhas de células de tampa são mais sensíveis à LBH589 de . a linha normal das células epiteliais da próstata

(a) células foram tratadas com uma gama de concentrações de LBH589 para 24, 48 e 72 h; (B) As células foram tratadas com RT ou a combinação com RT e LBH589 para análise de eficiência de formação de colónias. fracções de sobrevivência foram significativamente reduzidos em células PC-3 e LNCaP tampa (

P

0,01), mas não em células normais REWP-1 (

P

0,05); (C) imagens típicas são mostradas para o crescimento da colônia na RT e tratamento combinado (LBH589 e RT) no tampão e as células da próstata normais. Todos os resultados foram de três experiências independentes (n = 3). Pontos, quer dizer; bares, SD.

O efeito do tratamento combinado na formação de colónias usando boné e células da próstata normais

O efeito radiossensibilização de LBH589 no PC-3 e LNCaP foi indicado pela sobrevivência significativamente reduzida fracções (

p

= 0,0075 para PC-3,

p

= 0,0074 para LNCaP) e DEF nestas duas linhas de células 1 (1,77 por PC-3 e 1,29 para LNCaP) ( A Figura 1B-C). Radiossensibilidade não aumentou significativamente em RWPE-1 por LBH589 pré-tratamento com DEF de 1,18 (

p

= 0,0823) (Figura 1B-C). RT parâmetros para RT sozinho e o tratamento de combinação em cada linha celular estão sumariados na Tabela 2. SF2, ID90, id

50 e ID10 foram todos significativamente diminuída em PC-3 e LNCaP por pré-tratamento LBH589 (

P

. 0,05), mas nenhuma delas significativamente alterada para RWPE-1