Abstract

A maioria dos carcinomas de células renais (RCC) são caracterizados por a perda da função de gene supressor de tumor de von Hippel Lindau (VHL), que actua como ligase de ubiquitina para o factor-1α indutível por hipoxia (HIF-1α). Na ausência de VHL, proteína HIF-1α torna-se estabilizado e contribui para a tumorigénese. Dados recentes demonstram a eficácia antitumoral do promotor BVS em células RCC. Este estudo demonstra que o N-Myc gene a jusante-2 regulada (NDRG2) é um potencial regulador de VHL. NDRG2 está envolvido na proliferação e invasão da célula cancerosa, além disso, é frequentemente regulada no carcinoma de células renais. Aqui foi avaliado o efeito de sobre-expressão NDRG2 sobre a proliferação e invasão de células cancerosas renais humanos. A linha celular de cancro renal humano 786-S e A498 foram infectadas com Ad-NDRG2 ou Ad-LacZ. A sobre-expressão de NDRG2 não só inibiu o crescimento das células, mas também suprimiu a invasão. Estudos posteriores mostraram que o gene supressor de tumor de VHL foram supra-regulados, enquanto factor de transcrição HIF-1a e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) foram regulados negativamente em células 786-S infectadas pelo Ad-NDRG2. Finalmente, em um modelo nu do rato, injeções intratumorais de Ad-NDRG2 a cada 3 dias para um total de sete vezes inibiu significativamente o crescimento e angiogénese de tumores 786-O xenoenxerto. Em conclusão, estes dados indicam que NDRG2 podem estar envolvidos na proliferação e invasão por impactando a expressão do VHL e HIF-1α. NDRG2 pode ser um alvo terapêutico atractivo para carcinoma de células renais.

citação: Gao G, Wu L-J, Liu B, Shen H-Z, Pan-T-j, Yu C-G, et al. (2013)-regulação de pVHL juntamente com Down-Regulamento de HIF-1α por NDRG2 Expressão Atenua proliferação e invasão em células de cancro renal. PLoS ONE 8 (12): e84127. doi: 10.1371 /journal.pone.0084127

editor: Georgios Gakis, Universidade Eberhard-Karls, Alemanha |

Recebido: 09 de julho de 2013; Aceito: 12 de novembro de 2013; Publicação: 20 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Gao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Subvencionado pela National Science Foundation Natural da China (No. 81230043 e No. 81.272.812) e chinês National Key Research Basic Programa de Desenvolvimento (2009CB521704). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de células renais (CCR) está entre os 10 principais doenças malignas mais comuns em homens e mulheres [1]. RCC compreende um grupo histologicamente diversificada de tumores sólidos, provenientes de diferentes partes do rim [2]. A grande maioria dos RCCs são carcinomas de células renais claras (CCRCCs celulares), caracterizada pela perda de função do gene supressor de tumor de von Hippel Lindau (VHL). Defeitos no gene VHL são a causa mais comum de câncer de células claras familiar, e mais de 80% dos pacientes com câncer de células claras esporádica tem um gene VHL inactivo ou perda do gene VHL [3].

BVS é um guardião clássica inibir a iniciação do tumor renal [4-6]. A BVS proteína codificada pelo gene VHL, é um componente de um complexo de ubiquitina-ligases E3 que inclui elongin-B, elongin-C, e Cullin-2 [7,8]. Entre os substratos bem documentados da pvhl é o factor indutível por hipoxia (HIF-1α), que é um factor de transcrição que controlam a expressão dos factores induzidos por hipoxia, tais como piruvato desidrogenase cinase (PDK) -1, o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e assim por diante [9,10]. Estes genes alvo tem influência sobre o metabolismo da energia, a proliferação celular e a metástase de câncer de células claras [11]. Sob oxigénio normal, o HIF-1α se liga pvhl através dos seus resíduos de prolina hidroxilados e é polyubiquitinated por pvhl, que em última análise conduz à degradação de HIF-1α através do proteassoma. Durante hipoxia, HIF-1α não é hidroxilado e escapa da degradação pvhl-mediada. O HIF-1α lábil forma então factor de transcrição funcional pela associação com a subunidade HIF-1β constitutivamente expressa [12]. Em conjunto, este complexo liga-se a motivos de ADN como a que se refere a elementos de resposta a hipoxia para regular a expressão de um número de genes envolvidos na proliferação celular, metástase e angiogénese. Por conseguinte, através da promoção da degradação do HIF-1α, pvhl pode suprimir HIF-1α estimulou a transcrição e a função como um supressor de tumor de chave [13]. perda pvhl é um evento comum em câncer de células claras, levando a estabilização de HIF-1α e a sobre-regulação dos seus genes-alvo. Tem sido demonstrado que a expressão de VEGF é frequentemente elevada, juntamente com a regulação positiva de HIF-1α em muitos cancros humanos [14]. Um estudo anterior demonstrou que pvhl é capaz de aumentar a expressão e actividade de outro supressor de tumores bem conhecido, a p53 [14]. No entanto, como a própria pVHL é regulado tem sido raramente relatada. Dados recentes demonstraram a eficácia antitumor de um promotor pvhl em CCRs [15].

A jusante do gene N-myc Regulada 2 (NDRG2), é um membro da família NDRG, é um supressor de tumor recentemente identificado. Tem sido relatado que a expressão é regulada negativamente na NDRG2 uma variedade de carcinomas, incluindo o cancro do fígado, cancro pancreático, cancro da próstata e meningiomas. Estudos do nosso laboratório e outros mostraram que NDRG2 é envolvido regulação da proliferação celular, apoptose, diferenciação e resposta ao estresse [16-21]. De nota, o nosso estudo anterior sugeriu que NDRG2 upregulated as expressões de p53 e pVHL enquanto down-regula a expressão de VEGF e HIF-1α em linhas celulares de cancro da mama [22]. Recentemente, foi relatado que NDRG2 é regulada negativamente em tecidos ccRCC em comparação com os tecidos não neoplásicos adjacentes [23]. Além disso, a expressão forçada de NDRG2 inibe o crescimento de células claras RCC (ccRCC) linhas celulares e induz a apoptose de células [24]. Estes achados sugerem que NDRG2 desempenha um papel importante na carcinogênese do câncer de células claras. No entanto, o papel exacto do NDRG2 em câncer de células claras não está totalmente compreendido.

Neste estudo, buscou-se investigar se há uma relação regulatória entre NDRG2 e pVHL. Examinamos primeiro correlação expressão entre NDRG2 e pVHL em tecidos tumorais de pacientes com câncer de células claras. Em seguida, foi realizada

in vitro

in vivo

experimentos para investigar o efeito da superexpressão NDRG2 no comportamento das células, bem como na expressão de pVHL e seus efectores a jusante, HIF-1α e VEGF Comprar e .

Materiais e Métodos

Ética Declaração

As amostras humanas foram obtidas de todos os pacientes com consentimento informado por escrito. Ambos consentimento informado eo estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board do Hospital Xijing, Quarta Universidade Médica Militar. Os ratos utilizados nesta pesquisa foram obtidos a partir da Quarta Universidade Médica Militar e foram mantidos em condições livres de patógenos. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Conselho de Administração do Hospital Xijing, Quarta Universidade Médica Militar de Revisão Institucional e conformado com as diretrizes do NIH sobre o uso ético dos animais.

coleta de tecido e imuno-histoquímica

Um total de 130 espécimes embebidos em parafina fixadas em formalina de carcinoma de células renais de células claras primário e seus tecidos renais normais adjacentes foram coletados no Departamento de Patologia do Hospital Xijing, Xi’an, China. Todas as amostras foram obtidas a partir de pacientes que deram consentimento informado para usar o excesso de espécimes patológicos para fins de pesquisa. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito. O uso de tecidos humanos neste estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da Quarta Universidade Médica Militar e foi conduzido de acordo com as directrizes internacionais para a utilização de tecidos humanos. Anti-NDRG2: anticorpos (uma diluição de 500) foram adquiridos a BD Corporation (BD, Nova Iorque, EUA). -Anti-HIF 1a (diluição 1: 500) e anti-VEGF: anticorpos (uma diluição 1000) eram de Santa Cruz Tecnologia (Santa Cruz, CA, EUA). O anticorpo anti-VHL (diluição 1: 500) foi de Neomarkers Corporation (Taipei, China). Anti-β-actina anticorpo (diluição 1: 2000) foi da Sigma (Sigma, EUA). O kit imuno-histoquímica foi adquirido da Boster Company (Wuhan, CHN).

A coloração imuno-histoquímica foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. A intensidade e a extensão da coloração imunológica foram analisados ​​semi-quantitativamente. Secções com qualquer rotulagem ou com menos do que 5% de células marcadas foram pontuados como 0. As secções foram pontuados como um 1 se 5-25% de células foram marcadas, como uma 2 se 25-50% das células foram marcadas, e como um 3 Se 50-75% das células foram marcadas. Finalmente, a rotulagem de ≥75% das células foi pontuado como uma 4. A intensidade da coloração foi marcado de forma semelhante, com 0 utilizado para coloração negativa, para um positivo fraco, 2 para moderadamente positivas e 3 para fortemente positivo. As pontuações para a percentagem de células positivas e para a intensidade de coloração foram multiplicados para gerar um marcador imunorreactivo para cada amostra. O produto das pontuações quantidade e intensidade foram calculados de tal forma que um placar final de 0 indicaram nenhuma expressão, 1-4 indicado fraca expressão, 5-8 indicado expressão moderada e 9-12 indicaram forte expressão. As fotos foram coletados por meio de microscopia de luz (Olympus, Japão).

As linhas celulares e reagentes

renais linhas de células cancerosas humanas 786-O e A498 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, EUA). As linhas de células foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10%, a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO

2. Para o tratamento de hipoxia, as células foram cultivadas sob condições hipóxicas (1% O

2, 5% de CO

2 e 94% N

2) e colhidas às 24 h após a infecção.

celular crescimento ensaio

As células foram semeadas (5 × 10

3 células por poço) em triplicado em placas de 96 poços. Após remoção do meio, 40 MOI adenovírus expressando NDRG2 [24] ou o gene de controlo negativo LacZ (Ad-LacZ) foi adicionado em RPMI 1640 sem soro, incubadas durante 2 h, substituído com fresco RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS. As placas foram então incubadas durante 0, 24, 48, e 72 h. O número de células viáveis ​​foi determinado usando o -2,5-ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) (MTT) e lendo a absorvância a 490 nm. Os dados são a média ± desvio padrão para três experiências independentes.

ensaios de migração e invasão

A migração celular e ensaios de invasão foram feitas essencialmente como descrito anteriormente [15]. ensaio de invasão com um ensaio de membrana e migração de Matrigel-revestidas com uma membrana de Matrigel não revestidos foram efectuadas utilizando um sistema de câmara de 24 poços (BD Biosciences, Bedford, MA), de acordo com as instruções do fabricante. As células foram tripsinizadas e semeadas na câmara superior a 2,5 × 10

5 células /poço em meio livre de soro. O vector portador de LacZ ou NDRG2, a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 40, foi adicionado imediatamente após o plaqueamento de células. Meio suplementado com FBS a 5% (utilizada como um quimio-atractor) foi colocado no fundo do poço. A incubação foi realizada durante 24 h a 37 ° C em ar humidificado com 5% de CO

2 atmosfera. As células foram deixadas migrar através de uma membrana porosa, de Matrigel-revestido ou não revestido (BD Biosciences). Após a incubação, as câmaras foram removidas, e invadir as células no lado inferior da membrana foram fixadas com metanol e coradas com Gimsa. O número de invadir células ou a migração de células foram determinados por contagem de cinco campos de alta potência (400 ×) sobre cada uma das membranas e é calculado como o número médio de células por campo. Os dados são a média ± desvio padrão para três experiências independentes.

análise de transferência de Western

As células foram semeadas (5 × 10

5 células por poço) em triplicado em placas de 24 poços . Após remoção do meio, 40 MOI NDRG2 Ad-LacZ ou Ad-foi adicionado em RPMI 1640 sem soro, incubadas durante 2 h, substituído com fresco RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS. Depois de cultivar durante 24 h, as células foram lavadas com PBS frio e imediatamente lisadas em tampão de lise [1% de Triton X-100,150 mmol /L de NaCl, 100 mmol /L de KCl, 20 mmol /L de HEPES, 10 mmol /L de EDTA, 1 mmol /L de ortovanadato de sódio, 10 ug /ml de aprotinina, 10 ug /ml de leupeptina, e 1 mmol /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo] em gelo. A análise Western blot foi realizada de acordo com o protocolo padrão utilizando membranas de nitrocelulose (Bio-Rad). Para imunotransferência, as membranas foram incubadas com os anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, seguido por 2 horas de incubação com uma diluição de 1: 2000 de peroxidase de rábano (HRP) -linked anticorpo secundário. Finalmente, as proteínas imunorreactivas foram detectadas pelo sistema de detecção por quimioluminescência.

células

imunofluorescência

786-S foram semeadas em lamelas de vidro. Após remoção do meio, 40 MOI NDRG2 Ad-LacZ ou Ad-foi adicionado em RPMI 1640 sem soro, incubadas durante 2 h, substituído com fresco RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS. As placas foram então incubadas como descrito acima durante 24 h. Depois de permeabilização (0,5% de Triton X-100), a fixação (4% de formaldeído), e de bloqueio (soro de cabra normal, 10% e 0,5% de Triton X-100), anti-rato NDRG2, VHL, e HIF-1α anticorpo monoclonal de VEGF foi adicionado às células durante a noite a 4 ° C, respectivamente. As células foram então coradas com anticorpo policlonal de cabra anti-ratinho conjugado com FITC ou Cy3-conjugado a 37 ° C durante 2 h, no escuro. A intensidade da coloração de fluorescência foi então examinada por microscopia de imunofluorescência.

ELISA

As células foram semeadas (5 × 10

5 células por poço) em triplicado em placas de 24 poços. Após remoção do meio, 40 MOI NDRG2 Ad-LacZ ou Ad-foi adicionado em RPMI 1640 sem soro, incubadas durante 2 h, substituído com fresco RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS. Os meios condicionados de culturas de células 24 h foram ensaiadas para o VEGF, utilizando kits de ELISA comerciais (Endogen sanduíche, Woburn, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Cada amostra foi testada em duplicado. Os dados foram expressos em VEGF (pg /ml).

ensaios de inibição de crescimento

in vivo

Os ratos-Six semanas de idade BALB /C atímicos (nu /nu) foram fornecidos pelo Centro Experimental animal da Quarta Universidade médica Militar (Xi’an, China). Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso do animal na Quarta Universidade Médica Militar e foram realizados de acordo com as regras de cuidados de animais estabelecidos pela universidade (número de autorização: 10001). Todos os esforços foram feitos para reduzir o número de animais utilizados e para minimizar seu sofrimento. As células 786-S foram colhidas e ressuspensas em PBS estéril. As células 786-S (5 × 10

6 células) em 0,2 ml foram injectados subcutaneamente nos flancos da esquerda dos ratinhos nus de 6 semanas de idade. Quando o tamanho médio dos tumores atingiu 200 mm

3, todos os ratos foram divididos aleatoriamente em três grupos (Ad-NDRG2, Ad-LacZ e PBS grupos de controlo, n = 10 por grupo). injecções intratumorais de adenovírus (1 × 10

9 pfu em 100 ul de PBS) foram feitas a cada 3 d para um total de sete vezes. Os volumes dos tumores foram calculados com base em medições calibradas de comprimento (a) e largura (b) das lesões utilizando a seguinte fórmula: V = AB

2/2. A curva de crescimento foi então obtido a partir destes dados. As condições dos ratinhos foram monitorizados todos os dias, e sobrevivências de ratinho foram registados durante o período experimental. O rato foi sacrificado por deslocamento cervical, quando apareceu caquexia, que foi caracterizado como um estado geral de saúde, acompanhada de uma perda de massa corporal magra e massa gorda, fraqueza, fadiga, lentidão, acentuadamente diminuição da ingestão alimentar, ascite e anorexia [25]. Todos os sacrifícios foram realizadas sob anestesia (cetamina 130 mg /8,8 mg de xilazina /kg de peso corporal). Em seguida, as amostras de tumor foram removidos para preparar secções de parafina de coloração histológica. Os níveis de expressão de NDRG2, pvhl, HIF-1α, proteína VEGF nos tumores inoculados foram detectados utilizando histologia e imuno-histoquímica, tal como descrito acima.

A análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS versão 19.0. As comparações entre os grupos foram realizadas usando-se análise de variância e teste exato de Fisher. As curvas de Kaplan-Meier e log-rank testes foram utilizados para a análise de sobrevivência.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

A expressão de NDRG2, pVHL e HIF-1α em tecidos renais normais e tecidos ccRCC

Para determinar se o regulamento entre NDRG2 e pVHL existe em câncer de células claras, que em primeiro lugar, detectou a expressão de NDRG2 e aqueles de pvhl e HIF-1α em 130 amostras ccRCC e os tecidos normais emparelhadas. Como é mostrado na Tabela 1 e Figura 1, a taxa de expressão positiva NDRG2 em amostras de tecido ccRCC foi de 30,0% (Figura 1A e 1B), o que foi significativamente mais baixa do que no tecido renal normal de 60,0% (Figura 1G e 1H) (

P

= 4.40 × 10

-9). E a taxa de expressão pvhl positiva em amostras de tecido câncer de células claras (Figura 1C e 1D) também foi significativamente mais baixa do que no tecido renal normal (Figura 1I e 1J) (26,9% vs 66,2%,

P = 3,02 ×

10

-10). Pelo contrário, a taxa de expressão positiva HIF-1α em amostras de tecido câncer de células claras (Figura 1E e 1F) foi significativamente mais elevada do que no tecido renal normal (Figura 1K e 1L) (55,4% vs 33,7%,

P

= 0,006). Além disso, como é mostrado na Figura 1 M e 1N, os níveis de expressão NDRG2 foram positivamente correlacionados com os de amostras de tecido em pvhl ccRCC (

R

= 0,749,

P

= 3,25 × 10

-5), enquanto os níveis de NDRG2 expressão foram negativamente correlacionados com os de HIF-1α em amostras de tecido ccRCC (

r

= -0,331,

P

= 1.85 × 10

-3).

Grupo

Subgrupo

negativa (%)

positivo (%)

χ Página 2

P

valor

NDRG2 câncer de células claras tissue91 (70,0) 39 (30,0) 23,64

P

= 4.40 × 10

-9normal tissue52 renal (40,0) 78 (60,0) pVHLCCRCC tissue95 (73,1) 35 (26,9) 40.21

P

= 3.02 × 10

tissue44 renal -10normal (33,8) 86 (66,2) HIF-1αCCRCC tissue58 (44,6) 72 (55,4) 8,18

P = 0,006

tissue81 renal normal (62,3) 49 (37,7) Tabela 1. a expressão de NDRG2, pVHL e HIF-1α em tecidos renais normais e tecidos ccRCC.

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microfotografias representativos de coloração imuno-histoquímica para NDRG2, pVHL e HIF-1αin normais renal tecidos e tecidos ccRCC. (A e B) NDRG2 expressão em tecidos ccRCC (200 x de ampliação). (C e D) pvhl expressão em tecidos ccRCC (200 x de ampliação). (E e F) expressão de HIF-1α em tecidos ccRCC (200 x de ampliação). (G e H) NDRG2 expressão nos túbulos renais normais (200 x ampliação). (I e J) pvhl expressão em túbulos renais normais (200 x ampliação). (K e L) HIF-1αexpression nos túbulos renais normais (200 x de ampliação). (M) Os níveis de NDRG2 de expressão são positivamente correlacionados com os de pVHL. (N) Os níveis de expressão NDRG2 estão negativamente correlacionados com aqueles de HIF-1α. O número de espécime foi mostrado como “escala”. As disparidades entre os grupos foram analisadas pelo coeficiente de correlação de Pearson e o gráfico foi gerado pelo software SPSS19.0.

NDRG2 superexpressão inibe a proliferação de células cancerosas renais humanos

in vitro

para investigar os efeitos da sobre-expressão NDRG2 sobre o crescimento de células cancerosas renais humanas, utilizou-se o Ad-LacZ ou Ad-NDRG2 para infectar as células 786-S e células A498. Após a infecção, durante 24 h, a forte expressão da proteína NDRG2 em células 786-S (Figura 2A) e as células A498 (Figura 2B) foi confirmada por análise de Western blot utilizando um anticorpo monoclonal contra NDRG2. A inibição da proliferação celular foi medida com o ensaio de infecção de MTT 12, 24, 36, 48, 60 e 72 h seguintes. Tal como mostrado na Figura 2C e 2D, o Ad-LacZ tinha nenhum efeito significativo na proliferação de células tanto em linhas de células em comparação com o grupo de controlo (

P valor

em 24, 36, 48, 60 e 72 horas é de 0,55, 0,61 , 0,96, 0,98 e 0,60, respectivamente em células 786-O;

P

valor é de 0,60, 0,68, 0,60, 0,15 e 0,60, respectivamente em células A498). No entanto, a proliferação celular foi significativamente inibida em células 786-S Ad-infectadas com NDRG2 (

P valor

em 24, 36, 48, 60 e 72 h é 048, 1,54 x 10

-4, 2,01 × 10

-4, 2,15 × 10

-4 e 4,32 × 10

-6, respectivamente em células 786-O) e as células A498 Ad-NDRG2-infectados (

P

valor é 0,47, 0,43, 2,20 × 10

-4, 4,08 × 10

-4 e 1.70 × 10

-6, respectivamente em células A498), respectivamente, em relação ao grupo Ad-LacZ.

(A e B) Os níveis de expressão de proteína em NDRG2 Ad-NDRG2-infectado 786-S e células A498 Ad-NDRG2-infectadas foram respectivamente examinados por transferência Western. (C e D) O crescimento das células 786-S e A498 foi inibida por sobre-expressão de NDRG2 após 72 horas de incubação. A significância estatística foi avaliada utilizando ANOVA de uma via. *** Indica

P Art 0.001, quando comparado com o grupo Ad-LacZ.

NDRG2 superexpressão inibe a invasão e migração de células de cancro renal humanos

in vitro

Para melhor avaliar o efeito da superexpressão NDRG2 sobre a atividade metastática, foi realizada

in vitro

Matrigel-revestidas Transwell ensaios de invasão, bem como os ensaios de migração, com duas linhas de células de cancro humano diferentes, renais 786-O e A498. micrografias representativas foram tomadas a partir da superfície inferior do filtro Transwell, e as células que migraram invadiram ou foram coradas com Gimsa. Como mostrado na Figura 3A e 3B, o potencial invasivo, que é determinada pela capacidade das células para invadir uma barreira de Matrigel, foi significativamente suprimida por infecção ad-NDRG2 em células 786-S (

P = 1,46 ×

10

-5

vs

grupo Ad-LacZ) e A498 células (

P

= 2,23 × 10

-5

vs

Ad- grupo LacZ) . No entanto, não houve diferenças significativas entre o grupo Ad-LacZ e grupo controle em ambas as células 786-O (

P

= 0,79) e células A498 (

P

= 0,58). Além disso, a sobre-expressão de NDRG2 nestas linhas celulares suprimiu significativamente a sua migração através da transpoço quando comparado com a infecção por Ad-LacZ (

P

= 1,19 × 10

-5 para células 786-O e

P

= 1,09 × 10

-3 para as células A498, respectivamente) (Figura 3C e 3D). Mas não houve diferenças significativas entre Ad-LacZ e grupos de controle em ambas as linhas celulares (

P

= 0,73 para as células 786-O e

P

= 0,94 para células A498)

(A e B) A capacidade de invasão foi estimada usando Transwell revestidas com Matrigel. A quantidade de células invadidas foi calculada em cinco campos aleatórios de alta potência (400 × ampliação). O histograma representa a quantificação de células que invadiram. (C e D) A capacidade de migração foi estimada usando Transwell não revestido com Matrigel. A quantidade de células que migraram foi calculada em cinco campos aleatórios de alta potência (400 × ampliação). O histograma representa a quantificação de células que migraram. Os dados são a média ± desvio padrão (SD) para três experiências independentes. A significância estatística foi avaliada utilizando ANOVA de uma via. ** Ou *** indica

P Art 0,01 ou

P Art 0.001, respectivamente, quando comparados com o grupo Ad-LacZ.

regulação da expressão de pVHL, HIF-1α e VEGF pelo aumento da regulação do NDRG2 em células 786-O

Para compreender o mecanismo molecular através do qual NDRG2 inibe a proliferação de células 786-S e invasão, analisamos o efeito de NDRG2 sobre a expressão de pvhl, HIF-1α e sua VEGF alvo, que desempenham um papel importante na proliferação celular e invasão em cancro renal . Nós infectado as células 786-S com Ad-NDGR2 e examinados pvhl, HIF-1α e expressão de VEGF por análise Western Blot. Como resultado, revelou a expressão aumentada e reduzida pvhl HIF-1α e VEGF em comparação com a do grupo de controlo e células 786-O grupo Ad-lacZ (Figura 4A). Enquanto isso, utilizou-se teste de imunofluorescência para afirmar ainda mais regulação da expressão de pVHL, HIF-1α e VEGF por superexpressão de NDRG2. rotulagem de imunofluorescência indireta mostrou sinais fracos de NDRG2 e pVHL em grupo controle e células 786-O grupo Ad-LacZ, enquanto houve coloração mais forte de NDRG2 e pVHL em células 786-O Ad-NDRG2 infectados. Além disso, os sinais de HIF-1α e VEGF no grupo controle e Ad-LacZ foram mais fortes do que aqueles no grupo Ad-NDRG2 (Figura 4B). células

(A) 786-O, Ad-LacZ-786-O e Ad-NDRG2-786-S foram incubadas sob normóxia e hipóxia por 24 h. Após a incubação, as células foram analisadas por ensaio Western Blot. os níveis de p-actina de proteínas foram utilizadas como um controlo de carga. (B) Após a infecção de células 786-S com 40 MOI Ad-NDRG2 sob normoxia durante 24 h, os níveis de proteína de NDRG2, pvhl, HIF-1α e VEGF nas células foram medidas utilizando um ensaio de imunofluorescência (400 × de ampliação).

produção de VEGF é inibida por NDRG2 superexpressão

para testar se a expressão NDRG2 afeta a produção de VEGF em células de cancro renal, utilizamos Ad-NDRG2 para infectar as células 786-o e A498 e mediu o os níveis de VEGF em meio de cultura de células sob condições de normóxia ou hipóxia. Os resultados do ensaio ELISA mostrou que o grupo Ad-NDRG2 de células 786-O, em comparação com Ad-LacZ exibiu significativamente diminuição da secreção de VEGF sob qualquer normóxica (Figura 5A) (

P

= 7,32 × 10

-8) ou condições de hipóxia (Figura 5B) (

P

= 9,95 × 10

-8). Enquanto isso, a secreção de VEGF de células A498 foi também diminuiu significativamente em condições de sobre-expressão NDRG2 independentemente de normóxia (Figura 5C) (

P

= 6,12 × 10

-7) e hipoxia (Figura 5D) (

P

= 0,005). Mas a infecção Ad-LacZ não tem nenhum efeito sobre a produção de VEGF em comparação com o grupo controle, quer em normoxia (

P

= 0,55 para 786 O células;

P

= 0,91 para as células A498) ou em hipóxia (

P

= 0,94 para 786 O células;

P

= 0,90 para as células A498)

(a e B) 786-O, Ad-LacZ-786-O. e as células DA-NDRG2-786-S foram incubadas sob condições de normóxia e hipóxia durante 24 h. Após a incubação, os meios foram analisadas para os níveis de VEGF por ensaio de ELISA. (C e D) A498, células A498 Ad-LacZ- A498 e Ad-NDRG2- foram incubadas sob condições de normóxia e hipóxia durante 24 h. Após a incubação, os meios foram analisadas para os níveis de VEGF por ensaio de ELISA. Os dados foram a média ± desvio padrão (SD) para três experiências independentes. A significância estatística foi avaliada com one-way ANOVA. ** Ou *** indica

P Art 0,01 ou

P Art 0.001, respectivamente, quando comparados com o grupo Ad-LacZ.

A supressão do crescimento do tumor em um modelo nu do rato por injecção intratumoral de Ad-NDRG2

Para investigar os efeitos do anúncio -NDRG2 no crescimento do tumor

in vivo

, injetamos adenovírus (1 x 10

9 pfu em 100 ul PBS) Ad-NDRG2, Ad-LacZ ou PBS a cada 3 dias em humana pré-estabelecido 786- O tumores de câncer renal (cerca de 200 mm

3) cultivados em ratinhos nus. Como mostrado na Figura 6A, o grupo Ad-NDRG2 conseguida uma inibição sustentada e significativa do crescimento do tumor comparada com o grupo Ad-LacZ (

P

valor é de 0,002, 1,54 × 10

-6, 1,77 × 10

-6, 9,7 × 10

-11, 8,69 × 10

-12 e 1,35 × 10

-9 em Day6, 9, 12, 15, 18 e dia 21, respectivamente). análise de sobrevivência Kaplan-Merier mostrou que a injeção intratumoral de Ad-NDRG2 prolongou significativamente o tempo de sobrevivência ratos (

χ

2 = 11,75,

P

= 0,003) (Figura 6B). Não foram observadas diferenças significativas entre o grupo controle e no grupo Ad-LacZ (

χ

2 = 4,67,

P

= 0,122), e os resultados foram consistentes com os da

in vitro

ensaios. Depois os ratinhos foram sacrificados, os tumores foram removidos para análise da expressão de NDRG2, pvhl, HIF-1α e VEGF. Imunomarcação para VEGF e HIF-1a foram menores em tumores extirpados dos ratos no grupo Ad-NDRG2. Além disso, os níveis de expressão NDRG2 e pVHL no grupo Ad-NDRG2 foram dramaticamente aumentada enquanto os níveis de HIF-1a e VEGF diminuiu em relação ao grupo Ad-LacZ (NDRG2,

P

= 6,47 × 10

-8 ; pVHL,

P

= 1,55 × 10

-8; HIF-1α,

P

= 0,0001; VEGF,

P

= 6,07 × 10

-7). Não houve diferença significativa entre os grupos controle e Ad-LacZ (NDRG2,

P

= 0,98; pVHL,

P

= 0,94; HIF-1α,

P

= 0,78; VEGF,

P

= 0,69) (Figura 7A e 7B).

(A) curvas de crescimento do tumor. O crescimento do tumor foi avaliada a cada 3 dias até o dia 21 do tratamento, medindo dois diâmetros perpendiculares e calcular o volume em mm

3. A análise estatística foi avaliada com one-way ANOVA. ** Ou *** indica P 0,01 ou P 0.001, quando comparado com o grupo Ad-LacZ. (B) de Kaplan-Meier foi mostrado no Control, Ad-LacZ e grupos Ad-NDRG2, com cada grupo que consiste em dez ratos. Houve diferença significativa entre os tratamentos Ad-LacZ Ad-NDRG2 e. A significância estatística foi avaliada através de testes de log-rank. ** Indica

P Art 0,01 quando comparado com o grupo Ad-LacZ.

(A) expressões intratumoral de NDRG2, pVHL, HIF-1a e VEGF foram avaliados por imuno-histoquímica (200 × ampliação) na embebido em parafina 786-O secções de tumor de células. Imagens representativas são mostrados. Foram avaliadas a densidade óptica (B) Integrada (DOI) valores de NDRG2, pvhl, HIF-1α e expressão da proteína VEGF dos tumores. Além disso ImagePro software foi utilizado para analisar os valores IOD das áreas positivas de coloração imuno-histoquímica, e os histogramas resultantes são mostrados. A análise estatística foi realizada utilizando-se ANOVA. Os resultados foram apresentados como a média ± DP. *** P 0,001.

Discussão

Embora a ressecção cirúrgica e terapia adjuvante são comumente usados ​​para tratar pacientes com câncer renal, a taxa global de sobrevivência para o câncer renal requer melhorias. Sabe-se que é resistente a RCC Radio-, hormono-, quimioterapia e [26]. Portanto, é urgente o desenvolvimento de terapias biológicas para o câncer renal. A ocorrência e o desenvolvimento de cancro renal depende da expressão de vários genes relacionados, como o HIF-1α, PDK1, VEGF e assim por diante [27].

Vários estudos demonstraram agora que o HIF-1α-regula a expressão de VEGF PDK1 e [28]. Além disso, PDK1 e expressão de VEGF são aumentados em RCC [29,30]. PDK1 é conhecido para fosforilar e activar algumas cinases de proteínas que pertencem à família de AGC de protea-quinases. Uma das cinases de proteína é a proteína quinase B (PKB, também conhecida como Akt). PDK1 activa Akt por fosforilação de um resíduo de Ser /Thr na ansa de activação. Akt é anormalmente ativados no câncer de células claras e envolvidos na proliferação e metástase [31]. E VEGF é o principal meio de todos os fatores angiogênicos e promove tanto tumorigênese e invasão de RCC [32]. HIF-1α são também frequentemente overexpressed no cancro renal, que se correlacionam com prognóstico clínico pobre [33].