Abstract

O tipo I proteína transmembranar com fator de crescimento epidérmico e dois follistatin motivos 2 ( TMEFF2), é expresso principalmente no cérebro e da próstata. Expressão de TMEFF2 é desregulado no cancro da próstata, o que sugere um papel nesta doença, mas o mecanismo (s) molecular envolvidos neste efeito não são claros. Apesar de androgénios promover

TMEFF2

transcrição, a entrega de androgénio para animais castrados transportando xenoenxertos de CWR22 aumenta os níveis de proteína de TMEFF2 na ausência de mudanças de ARNm, sugerindo que

TMEFF2

também podem ser regulados pós-transcricionalmente. Aqui nós mostramos que a tradução de

TMEFF2

é regulada por andrógenos. A adição de concentrações fisiológicas de di-hidrotestosterona (DHT) para linhas de células de cancro da próstata aumenta tradução de endógena

TMEFF2

ou transfectadas

TMEFF2-luciferase

fusões, e este efeito é necessária a presença de estruturas de leitura aberta a montante ( uORFs) na região 5 ‘não traduzida (5’-UTR) de

TMEFF2. Usando inibição siARN do receptor de androgénio (AR) e químico, que mostram que o efeito de androgénio em

TMEFF2

tradução é mediada pela AR. Importante, DHT também promove a fosforilação da subunidade α do factor 2 de iniciação da tradução (eIF2α) de uma forma dependente da AR, em paralelo com o efeito sobre a tradução

TMEFF2. condições de estresse Além disso, retículo endoplasmático (ER), que promovem eIF2α fosforilação, também estimulam

TMEFF2

tradução. Estes resultados indicam que a sinalização de androgénio promove fosforilação eIF2α e subsequente tradução de

TMEFF2

através de um mecanismo que requer uORFs no 5′-UTR de

TMEFF2

citação:. Overcash RF, Chappell VA, verde T, Geyer CB, Asch aS, Ruiz-Echevarría MJ (2013) andrógeno sinalização Promove Tradução de

TMEFF2

em células cancerosas da próstata através da fosforilação da subunidade α do Fator de Tradução Iniciação 2. PLoS ONE 8 (2): e55257. doi: 10.1371 /journal.pone.0055257

editor: Hari Koul, University of Colorado, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de julho de 2012; Aceito: 27 de dezembro de 2012; Publicação: 06 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Overcash et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por um subsídio do Instituto Nacional do Câncer (1R15CA155873). Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que nenhum interesse competindo existem

Introdução

os androgénios sinalização através do AR desempenham um papel essencial no desenvolvimento normal da próstata e contribuem para a progressão do cancro da próstata. A ligação dos androgénios ao AR promove uma alteração conformacional que, finalmente, conduz à sua translocação para o núcleo e a regulação da transcrição de um conjunto específico de genes responsivos aos andrógenos. A evidência clínica e experimental sugere que a progressão do cancro da próstata ocorre por meio da alteração da sinalização normal de androgénio, reduzindo a especificidade ou a quantidade de ligando de AR necessária para a proliferação e sobrevivência [1]. Importante, resultados recentes indicam que a função do AR é específico para o estágio da doença, provocando um programa diferente expressão do gene dependente de androgénio em relação ao cancro da próstata independente de androgénios [2]. Embora o papel do eixo AR na regulação da transcrição de sinalização está bem documentada, muito pouco se sabe sobre o seu papel na iniciação da tradução proposta em estudos anteriores [3], [4].

A proteína transmembranar com o factor de crescimento epidérmico e dois motivos folistatina 2 (TMEFF2) é uma única proteína transmembranar passe. TMEFF2 é expresso no embrião em [5], [6] e selectivamente no cérebro adulto e da próstata [7] – [9]. Um papel para TMEFF2, no cancro da próstata foi sugerida por estudos que indicam que a expressão de TMEFF2 é alterada de uma fracção significativa dos tumores da próstata primários e metastáticos [5] – [10]. Além disso, foi demonstrado recentemente que a TMEFF2 interage com sarcosina desidrogenase (SARDH), a enzima responsável pela conversão de sarcosina para glicina [11]. Importante, sarcosina foi identificado como um marcador de progressão para cancro da próstata num ecrã grande escala de metabolitos a partir de amostras de próstata humana [12]. O aumento dos níveis no plasma e urina sarcosina distingue o cancro da próstata a partir de tecido da próstata benigna, e foram ainda mais elevados em cancro metastático. Além disso, o metabolismo de sarcosina e as enzimas envolvidas na mesma (isto é SARDH) foram mostrados para agir como reguladores de invasão e metástase de células [12]. Por conseguinte, a interacção de TMEFF2 com SARDH sugere ainda um papel para TMEFF2 na progressão do cancro da próstata. Na verdade, temos também estabeleceu que as funções de TMEFF2 de comprimento completo como um supressor de tumor e que este papel se correlaciona, pelo menos em parte, com a sua capacidade de interagir com SARDH e modular os níveis celulares de sarcosina [11].

neste estudo nós relatamos que a tradução de

TMEFF2

é regulada por andrógenos, e esse efeito requer um AR funcional. Resultados utilizando modelos de xenoenxerto e das linhas celulares de cancro da próstata estabelecido que a expressão de TMEFF2 muda em resposta a androgénios e /ou a condição ou independente de androgénio dependente da das células [8], [10]. Como demonstrado por Gery et al. [8], estas mudanças são, em parte, devido à ativação da transcrição do

TMEFF2

em resposta aos andrógenos. No entanto, o aumento dos níveis de proteína de TMEFF2 na ausência de um aumento correspondente no nível de ARNm ter sido observada após a adição de androgênios em animais castrados transportando xenoenxertos de CWR22, sugerindo que

TMEFF2

também pode ser pós-transcricionalmente regulados [10].

O

TMEFF2

mRNA tem vários quadros a montante aberta de leitura potenciais (uORFs) em sua região líder, e análise de sequência sugere que eles são bem conservada entre mamíferos. Embora apenas presente em 5-10% dos ARNm celulares, uORFs são comuns nas regiões líder de ARNm que codificam oncoproteínas ou de proteínas envolvidas no controlo do crescimento e diferenciação celular, e eles funcionam modulando a tradução destes genes essenciais [13]. Depois de ser traduzido, uORFs geralmente bloquear a tradução do principal região codificadora a jusante, dificultando reinício tradução no principal códon de iniciação da tradução. No entanto, pode promover uORFs tradução selectiva da região de codificação a jusante sob stress celular ou outras condições que aumentam a fosforilação da subunidade α do fator de iniciação eucariótico tradução 2 (eIF2α) [13].

eIF2 na sua GTP forma ligada é necessário para a selecção do codão de iniciação da tradução. A fosforilação da subunidade α de eIF2 a Ser-51 (eIF2α-P) inibe a troca de eIF2-PIB de eIF2-GTP, impedindo o reconhecimento do codão de iniciação e diminuindo a iniciação da tradução mundial [14]. No entanto, como mencionado acima, contendo uORF-mRNAs são activamente traduzida sob estas condições. Dois mecanismos têm sido propostos para explicar este efeito. Na primeira, exemplificado pela

ATF4

ARNm que contém dois uORFs, reiniciação tradução no uORF jusante inibidora é ignorada em condições de eIF2α-P, devido ao fato de que os níveis mais baixos de eIF2-GTP aumento o tempo necessário para os ribossomas de digitalização para readquirir eIF2-GTP e reiniciar tradução [15]. No segundo, observada em ARNm contendo um único uORF, ribossomas de digitalização ignorar o uORF inibidora devido à reduzida eficiência de tradução em codões de iniciação com uma sequência de consenso de Kozak pobre [16]. Em ambos os casos, os resultados de bypass uORF em um aumento do número de ribossomas a partir de tradução no codão de iniciação da sequência de codificação principal, aumentando a síntese de proteínas que específico.

Neste estudo, demonstra-se que

TMEFF2

tradução é regulada por andrógenos. Andrógeno-regulação da

TMEFF2

tradução requer a presença dos uORFs na região do líder da

TMEFF2

mRNA e é dependente eIF2α-P. Além disso, este efeito é mediado pela AR, uma vez que não é observado quando o nível de AR são reduzidos por RNAi ou o antagonista de AR bicalutamida, ou em linhas de células que não o expressam. Estes resultados suportam um novo mecanismo de regulação da sinalização de andrógeno em que uORF contendo mRNAs são translationally activado em resposta a eIF2α-P.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

LNCaP e 22RV1 células foram obtidas da American Type Culture Collection e foram mantidas em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com soro retirado-carvão a 10% de FBS (Gemini Bio-products) ou 10% (Atlanta Biologicals). células PC3 (ATCC) foram obtidas do Dr. D. Terrian (East Carolina University) e também foram mantidas em meio RPMI 1640. fibroblastos de rato embrionário expressam o tipo selvagem e mutante (Ser51 com Ala) eIF2 foram obtidas do Dr. R. Kaufman ( Sanford /Burnham Medical Research Institute) e foram previamente descritos [17]. Estas células foram cultivadas em DMEM. Dihidrotestosterona, bicalutamida e actinomicina D foram adquiridos da Sigma-Aldrich.

construções e repórter Ensaios

A mutagénese por PCR foi usado para transformar os códons de iniciação dos uORFs de agosto de Gug no

TMEFF2

5 ‘UTR. Os iniciadores utilizados para a mutagénese são listados na Tabela 1. Os 5 ‘UTRs foram inseridos a montante do Gaussia

luciferase

gene no vector pCMV-Gluc (New England Biolabs). A TMEFF2-His-myc construção de fusão foi anteriormente descrito (11). Para as análises de uORF, as células foram cultivadas até 70-90% de confluência em placas de 6 cavidades e foram transfectadas com 1,5 ug de cada construção por poço e a mesma quantidade do pSeap-Control Vector II (BD Biosciences). As células foram transfectadas com Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante e utilizando 4 ul /poço de reagente de Lipofectamina. As células e os sobrenadantes foram recolhidos 24 horas após a transfecção, e a actividade da luciferase foi determinada a partir dos sobrenadantes usando o kit Biolux (New England Biolabs). níveis SEAP foram medidos usando o Great Escape Seap Quimioluminescência Kit 2.0 (Clontech Laboratories). Para ambos os ensaios, a luminescência foi detectada usando um 20/20

n luminómetro (Turner Biosystems).

Para os ensaios de repórter estimulada por DHT, as células foram hormona de fome durante 48 horas em vermelhos fenol meio isento de soro contendo 10% despojado com carvão (CSS) antes da estimulação com DHT. Vinte e quatro horas após a remoção da hormona, as células foram transfectadas utilizando o reagente de transfecção de Fugene HD (Promega), seguindo as recomendações do fabricante. Resumidamente, 10 ug de cada construção e 10 ug de pSeap2 foram diluídas em meio RPMI sem soro, juntamente com 30 ul de reagente de Fugene HD para um volume total de 500 ul. 100 ul desta mistura de transfecção foi adicionado por poço de uma placa de 6 poços. No dia seguinte, DHT ou veículo de etanol foram adicionados ao fresco CSS-meio RPMI e as células foram incubadas durante mais 48 horas antes da colheita de células e sobrenadantes. Para medir os níveis de ARNm de luciferase Gaussia, o ARN foi isolado a partir das células usando o kit RNAqueous (Ambion), seguindo o protocolo fornecido. O ADNc foi então sintetizada utilizando o kit iScript (BioRad Laboratories), e os níveis de ARNm de luciferase foram medidas por qRT-PCR utilizando SYBR Green Supermix IQ e o Real-Time PCR Detection System IQ5 (BioRad Laboratories). níveis de mRNA luciferase foram normalizados para P-

actina

e expressão gênica foi analisada utilizando IQ5 software do sistema óptico (BioRad Laboratories). Veja a tabela 1 para primers utilizados para qRT-PCR.

DHT Estimulação Time-claro

As células foram em meio isento de vermelho de fenol contendo 10% de CSS durante a noite antes da estimulação com 10 nM fome hormona DHT ou controlo de DMSO. Actinomicina D foi utilizado a uma concentração de 5 nM. O ARN foi isolado a partir de células utilizando o kit RNeasy (Qiagen) e o ADNc foi sintetizado utilizando Superscript II da Transcriptase Reversa (Invitrogen).

TMEFF2

níveis de mensagem foram medidos através de amplificação por qRT-PCR utilizando TaqMan

TMEFF2

iniciadores (Hs00249367_m1, Applied Biosystems), e normalizadas para

níveis de GAPDH

mensagens (amplificado com Hs99999905_m1, Applied Biosystems).

receptor andrógeno Knockdown

expressão AR foi reduzida em 22RV1 células usando o ON-TARGET além de piscina SMART por AR humana (Thermo Scientific). Não segmentação siARN foi incluído como um controlo. Resumidamente, 5 ul de ARN de silenciamento e 7,5 ul de DharmaFECT Transfection Reagent (Thermo Scientific) foram cada um diluídos separadamente em 300 ul de soro livre, fenol RPMI isento de vermelho. Após 5 min de incubação, as soluções foram combinadas e incubadas durante mais 20 min à temperatura ambiente, em seguida, adicionada a uma monocamada de células confluentes a 85% em um frasco T-25 contendo 2,4 ml de completa, o fenol livre de RPMI-vermelho.

imunotransferência

Os lisados ​​celulares foram preparados com radioimunoprecipitação Ensaio (RIPA) de tampão [25 mM de Tris-HCl pH 7,6, 150 mM de NaCl, 1% de Trition X-100, 1% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS] suplementado com mM β-glicerofosfato e 0,1 de cocktail de ortovanadato de sódio e 0,5 mM de inibidor de protease (Sigma). Vinte ug de lisados ​​foram separados em géis de TGX Mini-protean (BioRad) e transferidas para membranas de PVDF. Estes foram depois bloqueadas durante 30 minutos em 5% NFDM diluído em TBS-T, e incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. As incubações com uma diluição 1:10,000 de anticorpo secundário conjugado com HRP (Santa Cruz Biotechnology) foram durante 1 hora à temperatura ambiente. A detecção foi levada a cabo usando SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific) durante 5 min. Em alguns casos, as manchas foram retirados com Restaurar PLUS Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) seguindo as recomendações do fabricante. Os anticorpos contra TMEFF2, PSA, e eIF2α-P (Ser51) eram de Abcam, eIF2α e anticorpos CREB2 /ATF4 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, e P-eIF2α (Ser51) eram anticorpos de Cell Signaling Technology.

Análise polissoma

monocamadas de células foram lavadas uma vez com PBS frio e raspadas 1X com tampão de lise [100 mmol /L de KCl, 10 mmol /L de HEPES (pH 7,4), 0,5% de NP40, 5 mmol /l de MgCl

2, 100 ug /ml de ciclo-heximida], e incubadas em gelo durante 10 minutos, seguido de 5 minutos de centrifugação a 10000 rpm a 4 ° C para sedimentar os detritos celulares. As concentrações proteicas iguais de extractos citoplasmáticos (1,8 mg) foram, em seguida, colocado sobre um gradiente de sacarose linear [15-45% (w /v) 10 mmol /L de HEPES (pH 7,4), 100 mmol /L de KCl, 5 mmol /l de MgCl

2] e centrifugou-se a 35.000 rpm durante 2 horas a 4 ° C num rotor SW41-Ti sem o travão. Usando um ISCO UA-6, recolheram-se fracções com monitorização UV contínua a 254 nm. O ARN foi isolado a partir das fracções, utilizando o reagente Trizol (Ambion). Vinte e cinco microgramas de ARN foram então utilizados para a síntese de ADNc utilizando um kit de iScript (BioRad Laboratories). Uma amostra de 0,1 ug de cada preparação de ADNc foi utilizada para amplificar

TMEFF2

,

ATF4

, e

β-actina

por PCR utilizando o sistema de Platinum Taq DNA polimerase de alta fidelidade ( Invitrogen). Os produtos de PCR foram então visualizadas em um gel de agarose a 1% e analisados ​​utilizando o NIH programa Imagem J domínio público (desenvolvido pelo US National Institutes of Health e disponível na Internet, no https://rsb.info.nih.gov/nih- image /).

imunofluorescência

As células foram plaqueadas a uma densidade de 10.000 células /poço em Lab-Tek 8 desliza bem câmaras (Nalge Nunc International) e incubou-se durante a noite numa atmosfera humidificada de 37 ° C incubadora com 5% de CO

2. As células foram lavadas em PBS e fixadas em paraformaldeído a 4% durante 10 minutos, lavadas em PBS e permeabilizadas com 0,1% de Triton-X100 em PBS e bloqueadas com soro de cabra normal a 5% em 0,1% de PBST. As amostras foram incubadas durante 1 hora com os anticorpos primários indicados. Os anticorpos secundários correspondentes foram adicionados a uma diluição 1:500 em 5% de soro de cabra em PBS-T (0,1% de Tween 20): anticorpo de cabra anti-IgG de coelho-AF488 (Invitrogen) e de cabra anti-IgG de ratinho-AF488 (Invitrogen). As células foram lavadas 3 vezes em PBS-T (0,1% de Tween 20). As lâminas foram secas ao ar e montadas em meio contendo DAPI.

Fraccionamento subcelular

Os extractos de células cultivadas na presença de 10 nM de DHT, ou DMSO como controlo, foram fraccionados em citosólica, membranosa, frações nucleares e citoesqueleto usando o kit subcelular Proteome Extraction (Calbiochem).

Análise estatística

os dados são expressos como média ± SD. As diferenças foram analisadas utilizando emparelhado, testes t de duas caudas. Os valores de P ≤ 0,05 (*) ou ≤0.01 (**) foram considerados significativos.

Resultados

O

TMEFF2

5′-UTR contém vários uORFs que bloquear a tradução de Proteína TMEFF2

a 5 ‘UTR do

TMEFF2

mRNA contém vários uORFs potenciais (Figura 1A) que, se traduzido seria potencialmente bloquear a tradução do

TMEFF2

codificação principal sequência, e, portanto, contribuir para a regulação da expressão

TMEFF2

. Para investigar o papel das uORFs na regulação da expressão da proteína de TMEFF2, foi perguntado se a bloquear a tradução dos uORFs afectaria de tradução da proteína de TMEFF2 em linhas celulares de cancro da próstata humano. A TMEFF2-Gaussia luciferase (glic) repórter foi gerado para esta finalidade por clonagem do

TMEFF2

5′-UTR, incluindo quatro uORFs, a montante das sequências glic (pTM1234-Gluc; Figura 1B). O

TMEFF2

fusão -Gluc foi colocado sob o controlo do promotor de CMV. A contribuição de regulamentação dos uORFs

TMEFF2

tradução foi avaliada por mutação dos codões de iniciação (augs) dos quatro uORFs potenciais (AUG para GUG, Figura 1B) e determinando o seu efeito sobre a expressão gluc na-androgénio dependente linha de células de cancro da próstata LNCaP e sua, linha de células C4-2B derivado independente de androgénios óssea metastática. Um aumento de seis a sete vezes da expressão da luciferase foi observada quando as AUGs a partir de todas as quatro uORFs foram mutados (pTMXXXX-gluc; Figura 1C). mutações individuais sobre os AUGs dos segundo, terceiro ou quarto uORFs promoveu um aumento de 3-4 vezes na expressão de glic, enquanto a mutação do agosto do primeiro uORF teve um efeito muito pequeno, sugerindo um papel mínimo, se houver, na regulação da TMEFF2 expressão. Assim, as mutações combinadas de uORFs 2, 3, 4 e resultou em um de cinco a seis vezes aumento na expressão de luciferase do repórter, semelhante à observada quando todas as quatro uORFs foram mutados (Figura 1C). Foram obtidos resultados semelhantes em outras linhas de células de cancro responsivos aos andrógenos (22Rv1) e independentes (PC3) da próstata. A mutação do uORFs resultou num aumento da expressão de luciferase do repórter Gluc, embora a indução de dobragem variável (Figura 1D). Nas construções usadas para estas experiências, a expressão do gene de fusão foi dirigida pelo promotor de CMV, e a actividade de luciferase foi normalizada para os níveis de mRNA. Em conjunto, esses resultados sugerem que os uORFs no 5′-UTR de

TMEFF2

função de mRNA em sinergia para reprimir a tradução do principal ORF a jusante.

A) Representação esquemática de 394 nt a montante do

TMEFF2

principal região de codificação e localização relativa de quatro uORFs potenciais (aa = aminoácidos) dentro do 5′-UTR. B) Representação esquemática do repórter de luciferase de TMEFF2-Gaussia e construções mutantes. O X indica mutação de AUG para um GUG para impedir a tradução dos uORFs mutadas. mutações únicas e múltiplas foram introduzidas. actividade de luciferase C) demonstrada pela pTM1234-Gluc e as diferentes construções mutantes em células LNCaP e C4-2. A actividade da luciferase D) demonstrada pela pTM1234-Gluc e a construção com todos os mutantes uORFs (pTMXXXX-Gluc) em células PC3 e 22Rv1. Em C) e D) a actividade da luciferase foi medida no sobrenadante e calculada pela primeira normalizando os níveis de ARNm para cada construção e, em seguida, para a actividade de luciferase demonstrado pela construção repórter pTM1234-Gluc, que não têm mutações nos uORFs, considerada arbitrariamente como 1. Os dados apresentados são média ± SD de pelo menos duas experiências independentes com múltiplas repetições. *,

p Art 0,05, e **,

p

. 0,01

A tradução de um Reporter TMEFF2-luciferase é regulada por andrógenos através de um mecanismo que requer a presença dos uORFs na Líder Região mRNA

a transcrição do

TMEFF2

gene é regulada por andrógenos [8]. No entanto, tem sido sugerido que os andrógenos também afetam

expressão TMEFF2

ao nível pós-transcricional [10], levando-nos a examinar se

TMEFF2

tradução foi afetada por andrógenos. 22Rv1 células foram seleccionadas para estas experiências uma vez que: i) que foram mostrados para ser um modelo útil para ensaios de gene repórter mediada por ar [18], ii) que demonstraram o maior aumento de vezes na expressão do gene repórter de luciferase quando os uORFs foram mutados ( veja a Figura 1D), e iii) que expressam níveis detectáveis ​​de proteína de TMEFF2 endógeno. 22Rv1 células foram transfectadas com o repórter pTM1234-Gluc, cultivadas em meio isento de vermelho de fenol, suplementado com despojado com carvão (CS) de FBS – para remover hormones- esteróide e tratado com diferentes concentrações de di-hidrotestosterona (DHT). A actividade de luciferase foi medida a partir dos sobrenadantes e normalizadas para os níveis de mRNA. A adição de DHT aumentou a express de Luciferase de um modo dependente da dose (Figura 2A), indicando que os androgénios estimulam a tradução da ORF principal. Importante, este efeito foi observado para concentrações de DHT dentro dos níveis fisiológicos encontrados no soro humano [19]. A actividade de luciferase a partir de células que transportem a construção repórter pTMXXXX-Gluc, em que os AUGs de todos os quatro uORFs foram mutados, não se alterou em resposta a DHT, embora, como esperado, foi muito mais elevado (Figura 2A). Estes resultados indicam que a tradução do principal ORF a jusante do

TMEFF2

5′-UTR é regulada por androgénios em forma uORF-dependente.

A) A actividade da luciferase demonstrado pela pTM1234-Gluc e o mutante pTMXXXX-Gluc em construir 22Rv1 células na presença de diferentes concentrações de DHT. B) A actividade da luciferase demonstrado pela pTM1234-Gluc em construir 22Rv1 células na presença de diferentes concentrações de DHT e DHT 20 uM bicalutamida (BIC), um agonista de AR. A actividade da luciferase C) demonstrada pela pTM1234-Gluc construir em células PC3, na presença de diferentes concentrações de DHT. Por todas estas experiências, as células foram em meio isento de vermelho de fenol contendo carvão soro despojado sedentos de hormona. A actividade de luciferase foi normalizada para os níveis de ARNm para cada construção e, em seguida, para a actividade de luciferase demonstrado por cada um das construções expressas em células cultivadas na ausência de DHT, que foi definido como 1. Os dados apresentados são média ± S.D. de pelo menos três experiências independentes com múltiplas repetições. *,

p Art 0,05, e **,

p

. 0,01

Para determinar se o efeito DHT em tradução é mediada pela AR , as experiências descritas acima foram repetidas na presença de bicalutamida para bloquear a activação de AR. A adição desta droga reduziu a indução mediada por DHT expressão do repórter de luciferase pTM1234-Gluc para níveis basais próximas, embora um pequeno período de dois a três vezes a indução pode ser observada a 10 nM de DHT (Figura 2B). Estes resultados indicam que o efeito de DHT na tradução da construção repórter requer sinalização AR. De acordo com estes resultados, não observamos tradução induzida por DHT do repórter pTM1234-Gluc em células de câncer de próstata PC3 que não expressam o AR (Figura 2C). No seu conjunto, estes resultados indicam que a tradução induzida por DHT de

TMEFF2

requer a activação de AR e é mediado pelos uORFs na região líder do ARNm.

A tradução da proteína endógena é TMEFF2 regulados por andrógenos

alterações na expressão da proteína de TMEFF2 endógeno em resposta a androgénios foram também analisados. Para este fim, as células 22Rv1 foram cultivadas em meio sem vermelho de fenol suplementado com FBS a CS-tratados com diferentes concentrações de DHT, e os lisados ​​analisados ​​para a expressão de TMEFF2 por western blotting. Na ausência de androgénios, a expressão de TMEFF2 foi dificilmente detectável. No entanto, a adição de DHT aumento da expressão de TMEFF2 (Figura 3A), e resultou em níveis mais elevados dentro da gama de concentrações fisiológicas de DHT. a expressão induzida por DHT de TMEFF2 endógena foi também observada nas células LNCaP de cancro da próstata responsivos aos andrógenos (Figura 3A). A expressão de androgénio específico da próstata (PSA), um alvo AR utilizado como controlo para a actividade de transcrição de androgénio, foi reforçada com a adição de DHT (Figura 3A). O tratamento das células com bicalutamida nomeadamente inibiu a expressão de TMEFF2 induzida por DHT e PSA que só foi observada nas concentrações mais elevadas de DHT (Figura 3A). A inibição da expressão de TMEFF2 induzida por DHT também foi alcançada depois de derrubar expressão da AR utilizando siRNA (Figura 3B). No seu conjunto, estes resultados indicam que a expressão da proteína de TMEFF2 endógena é regulada por sinalização AR.

A) Western blots representativos indicando um aumento na expressão de TMEFF2 em resposta à adição de DHT em células 22Rv1 e LNCaP (α = anticorpo ). A adição simultânea de 20 uM a bicalutamida 22Rv1 células (painel do meio) preveniu o aumento na expressão de TMEFF2 observado na concentração fisiológica de DHT. PSA foi usado como controlo positivo uma vez que a sua expressão é induzida por androgénio numa forma dependente da AR. β-tubulina foi utilizada como um controlo de carga. B) Western blot indicando batida eficaz para baixo das duas formas da AR nas células 22Rv1 usando siRNA (direita). Western blot representativo indicando que a adição de DHT não tem efeito sobre a expressão de TMEFF2 em células nas quais os níveis de AR foram reduzidas por RNAi. PSA foi usado como controlo e, como esperado, a sua expressão não foi afectado por DHT nas células tratadas AR-siRNA. β-tubulina foi utilizada como um controlo de carga. C) mudanças na

TMEFF2

níveis de mRNA em linhas de células LNCaP e 22Rv1 em resposta a DHT como medidos por qRT-PCR. Os valores foram normalizados para a p-tubulina de ARNm. Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes e, para as imagens representativas apresentadas, as membranas foram retirados e re-sondada com os diferentes anticorpos ou as mesmas amostras foram re-correr num gel diferente. β-tubulina foi utilizada como um controlo de carga de cada vez as amostras foram corridas.

Observamos um aumento

TMEFF2

níveis de ARNm em resposta a DHT como medidos por qRT-PCR ( Figura 3C), de acordo com um relatório anterior, indicando que os andrógenos estimulam

TMEFF2

transcrição [8]. No entanto, o ligeiro aumento nos níveis de ARNm não podem explicar o aumento mediada por DHT observada na expressão da proteína. Para excluir a possibilidade de que o aumento na proteína de TMEFF2 endógena, observado em resposta a DHT era apenas devido ao aumento da transcrição, utilizou-se actinomicina D ao bloco de transcrição e avaliados os níveis de proteína de TMEFF2 e ARNm em 22Rv1 células em diferentes pontos de tempo após a adição de DHT, para induzir

TMEFF2

expressão, e /ou os níveis de proteína actinomicina D. TMEFF2 aumentou dramaticamente 60-120 minutos após a adição de DHT, mas não DMSO, o controlo de veículo (Figura 4A). Importante, na presença de actinomicina D, a adição de DHT ainda promovido um aumento na expressão da proteína de TMEFF2, embora a um nível inferior do que a observada na ausência do inibidor de transcrição. Tal como indicado por análise de

TMEFF2

níveis de ARNm por qRT-PCR, a adição de actinomicina D inibiu basal e induzida por DHT

TMEFF2

transcrição (Figura 4B). A adição de DHT sozinha promoveu um ligeiro aumento inicial na transcrição (1,2 vezes depois de 20 minutos) que progressivamente diminuiu para níveis basais após 60 minutos de tratamento (não mostrado). Portanto, estes resultados revelam que os andrógenos regulam não só a transcrição da

TMEFF2

gene, mas também a tradução da endógena

TMEFF2

mRNA, suportando os resultados apresentados acima, usando um repórter TMEFF2-luciferase.

a) western blot representativo que demonstra a proteína de TMEFF2 nos pontos de tempo indicados após a adição de 10 nM de DHT na presença ou ausência de 5 nM de actinomicina D (Act D) para bloquear a transcrição. DMSO ou DHT e actinomicina D foram adicionados simultaneamente. A determinação quantitativa das manchas é apresentado abaixo do Western blot. As intensidades de banda das amostras tratadas com DHT foram normalizados primeiro a p-tubulina e, em seguida, com os valores obtidos para as amostras de DMSO nos pontos de tempo correspondentes. B) Mudanças no

TMEFF2

níveis de mRNA em 22Rv1 células em resposta a DHT ou DMSO e actinomicina tratamento D, medida pelo qRT-PCR. Os valores foram normalizados para

GAPDH

. Os dados apresentados são representativos de duas experiências independentes.

Outras proteínas incluindo β-catenina e ocludina translocar para o núcleo ou regiões de contacto celular após tratamento de androgénio. No entanto, nossos resultados indicam que o tratamento de andrógeno não alterou a localização subcelular de TMEFF2 (Figura S1).

andrógeno sinalização Promove eIF2α fosforilação

A fosforilação de eIF2α reduz tradução global, mas também fornece um mecanismo que aumenta selectivamente a tradução de ARNm contendo uORF-[13], [20]. Nós, portanto, a hipótese de que DHT promove endógena

TMEFF2

tradução através da fosforilação de eIF2α. O efeito de DHT no eIF2α fosforilação foi examinada por análise de Western blot em cancro da próstata PC3 22Rv1 e células cultivadas em meio isento de vermelho de fenol suplementado com FBS e CS-tratados com diferentes concentrações de DHT. Aumento dos níveis de eIF2α-P foram claramente detectadas, de um modo dependente da dose, em lisados ​​de células 22Rv1 tratados com DHT, mas não em lisados ​​de células PC3 AR-nula tratado com DHT (Figura 5A), indicando que os androgénios promovem eIF2α-P e que este efeito é dependente da presença de um AR funcional. Em concordância com estes resultados, o pré-tratamento das células com o antagonista 22Rv1 bicalutamida AR impediu os aumentos mediados por DHT no eIF2α fosforilação (Figura 5B). Além DHT também promoveu um aumento na expressão da proteína ATF4, um factor de transcrição regulado por eIF2α fosforilação (Figura 5A).

A) Western blots representativos indicando um aumento no eIF2α-P em resposta à adição de DHT em 22Rv1 células. Este efeito foi abolida em células PC3, que não expressam AR (à direita). Os níveis de proteína ATF4 foram medidos como um controlo positivo, uma vez que é induzido por eIF2α-P. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. B) Adição de 20 uM a bicalutamida 22Rv1 células preveniu o aumento em eIF2α-P observada após a adição de DHT.