Sumário

A chaperona molecular proteoma Hsp90-dependente representa uma rede de proteína complexa de relevância biológica e médica crítica. Conhecido para associar com proteínas com uma ampla variedade de funções denominados clientes, Hsp90 mantém-chave caminhos essenciais e oncogênicos de sinalização. Consequentemente, inibidores de Hsp90 estão a ser testados como drogas anti-cancro. Usando uma abordagem sistemática integrado para analisar os efeitos da inibição de Hsp90 em células-T, que quantificadas alterações diferenciais no proteoma Hsp90-dependente, a Hsp90 interactoma, e uma selecção do transcriptoma. comportamentos cinéticos no proteoma Hsp90-dependentes foram avaliados através de uma estratégia de pulse-chase novel (Fierro-Monti et al., acompanhando artigo), os efeitos sobre a estabilidade da proteína e síntese de detecção. impactos dinâmicos globais e específicas, incluindo respostas proteostatic, são devidos à inibição directa da Hsp90, bem como efeitos indirectos. Como resultado, um decréscimo foi detectado na maioria das proteínas que mudaram seus níveis, incluindo clientes Hsp90 conhecidos. Muito provavelmente, consequências do papel da Hsp90 na expressão do gene determinou uma redução global no

de

síntese líquida novo proteína. Esta diminuição pareceu ser maior em magnitude do que o aumento global concomitantemente observadas nas taxas de decaimento de proteína. Vários novos clientes Hsp90 putativos foram validados, e curiosamente, famílias de proteínas com funções críticas, particularmente a família Hsp90 e os próprios cofatores, bem como proteínas quinases, exibido aumentaram fortemente as taxas de atenuação devido ao tratamento com inibidor da Hsp90. Notavelmente, um surto de vias de sobrevivência, envolvendo chaperones moleculares e várias oncoproteínas, e diminuiu os níveis de alguns supressores de tumor, tem implicações para a terapia anti-câncer com inibidores da Hsp90. A diversidade de efeitos globais pode representar um paradigma de mecanismos que operam para proteger células de stress proteotoxic, através da promoção de funções anti-proliferativas e pro-sobrevivência. Os dados estão disponíveis via ProteomeXchange com PXD000537 identificador

Citation:. Fierro-Monti I, Echeverria P, racle J, Hernandez C, Picard D, Quadroni M (2013) Impactos dinâmicos da inibição da Molecular Chaperone Hsp90 em o T-Cell Proteome ter implicações para a terapia anti-cancro. PLoS ONE 8 (11): e80425. doi: 10.1371 /journal.pone.0080425

editor: Lennart Martens, UGent /VIB, Bélgica

Recebido: 30 de abril, 2013; Aceito: 02 de outubro de 2013; Publicação: 27 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Fierro-Monti et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo número de concessão 31003A_127256 do Swiss National Science Foundation (www.snf.ch), bem como o financiamento interno da Universidade de Lausanne. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

chaperones moleculares são centrais para Proteostase celular. Eles estão intimamente envolvidos em processos biológicos essenciais, como a tradução, dobragem, montagem complexa e desmontagem, a translocação através das membranas e degradação de proteínas [1], [2]. A importância funcional de chaperones moleculares e suas implicações em doenças identificou-os como alvos principais drogas em câncer [3], [4]. Em eucariotas, a proteína de choque térmico 90 (Hsp90) desempenha um papel distinto em meio chaperonas por facilitar a dobragem de factores de transcrição, que regula a activação de quinases [5], [6] e receptores de hormonas esteróides [7], ajudando na formação de complexos de proteína [8], [9], e jogando um papel no retorno da proteína e do tráfico. Para alcançar todas essas funções, associados Hsp90 com co-chaperonas Hsp90, substratos, e seus parceiros interagindo [2], [6], [10]. clientes Hsp90 são definidas como proteínas que estão dependentes da Hsp90. As abundâncias líquidas de muitos, mas não todos os clientes Hsp90, diminuição da inibição da Hsp90, provavelmente devido à degradação proteossómica. Os clientes com uma ampla variedade de funções requerem Hsp90 para adquirir a conformação correcta, para a activação e /ou de estabilidade. Superexpressão de Hsp90 como um complexo multi-acompanhante activado é frequente em células malignas [11], [12], e muitos clientes Hsp90 participar nas vias de sinalização relevante oncogênico [13], [14]. A inibição da Hsp90 pode bloquear as vias principais para o câncer, razão pela qual Hsp90 tem atraído grande interesse como um alvo para o desenvolvimento de drogas anti-câncer [12], [14], [15]. inibidores de Hsp90, como geldanamycin (GA) são inibidores competitivos da ATP vinculativo. Estes inibem a função de chaperona, e como consequência, eles podem exercer uma actividade anti-tumoral, diminuindo os níveis de clientes oncogénicos [12] – [14]. Actualmente, existem cerca de 20 inibidores em ensaios clínicos [13], [15].

esforços recentes têm sido dirigidas para identificar e quantificar a porção do proteoma que é dependente de Hsp90, mais vulgarmente usando padrão SILAC (Stable Isotope Rotulagem de Aminoácidos em cultura de células, stSILAC) à base de proteômica quantitativos [11], [16] – [19]. Os resultados destes estudos anteriores e utilizando diferentes abordagens proteomic melhoraram a compreensão do papel da Hsp90 no cancro, assim como um alvo de fármacos anti-cancerígenos promissores [20]. perfis de proteínas foi utilizado em conjunto com a triagem proteómica para identificar os componentes dos complexos Hsp90-bound de inibidor [11]. análises quantitativas e alvo-quinase quimio-proteômica [17], [19] do proteoma Hsp90-dependente destaque clientes Hsp90, que são directamente afectadas pela sua inibição, e proteínas que são indiretamente influenciadas. inibição de Hsp90 foi encontrada para afetar especialmente a abundância de todo o proteoma (stSILAC) de proteínas que participam na maquinaria dobramento de proteínas, o DNA danos resposta, bem como a fosforilação de proteínas e de sinalização por quinases [18], [19]. Para expandir nosso conhecimento do proteoma Hsp90-dependente e o efeito de inibição da Hsp90 GA-mediada em células T, foi aplicado uma abordagem sistemática romance integrado. Em primeiro lugar, analisamos a dinâmica (ao longo do tempo) mudanças em abundâncias stSILAC durante curtos (até 6h) e longo prazo (até 20h) GA-tratamento, detecção de alterações em grupos de proteínas com comportamentos distintos. Desde Acredita-se que a inibição de Hsp90 a afetar grandes porções do proteoma (1-10%), através de mudanças tanto decadência e síntese, foi aplicado um SILAC romance pulse-chase estratégia (pcSILAC) que forneceu insights sobre como as mudanças na abundância de proteínas são gerados ( Fierro-Monti et al., artigo que acompanha). Diferenciais e dinâmicas mudanças no

de novo

síntese e decadência foram identificados em proteínas em termos de constantes de taxa de decaimento [k

d] e as taxas de síntese [V

s]. Detectamos uma maior diminuição global na síntese de proteínas do que a estabilidade da proteína, enquanto muitas famílias principais de proteína diminuiu suas meias-vidas devido à inibição da Hsp90. Modelagem de nosso conjunto de dados quantitativos sobre um banco de dados de interação Hsp90 [21] ajudou a distinguir e avaliar as mudanças dinâmicas mais específicos de validação potencialmente novos clientes Hsp90 dentro do interactome Hsp90. Como abundância de proteínas pode ser influenciada por alterações ao nível da transcrição, foram determinados, por conseguinte, os níveis de mRNA para uma selecção de proteínas com abundâncias stSILAC líquidos aumentada ou diminuída mediante GA-tratamento. Ao todo, a nossa análise da inibição da Hsp90 permitiu uma avaliação integrada da dinâmica do T-cell proteoma Hsp90-dependentes, dando novas perspectivas sobre o mecanismo de ação de um inibidor da Hsp90.

Procedimentos Experimentais

células

Jurkat linfócitos T clonar J77.20 foram um presente tipo de Dr. Oreste Acuto, da Universidade de Oxford e foram previamente descritos [22], [23]. As células foram cultivadas em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Cell Culture Technologies, Gravesano, Suiça) com 10% (v /v) de soro fetal bovino dialisado (FBS) (Invitrogen), enquanto executa stSILAC ou pcSILAC experiências.

stSILAC experimentos

aminoácidos marcados com isótopos (

13 C

6-L-lisina,

13 C

6

15 N

4-L- arginina, Cambridge Isotope Laboratories (CIL), Andover, MA) foram incluídos na ‘stSILAC-pesado forma’ a 100 mg /l, enquanto que a prolina foi fornecido a 180 mg /L (um excesso de 9 vezes em relação a sua concentração padrão em meio RPMI médio) em todos os meios stSILAC e pcSILAC. rotulagem pesada ou leve-stSILAC (mesmo meio que heavy-stSILAC, mas contendo lisina e arginina padrão) foi obtida por cultura das células durante 2 semanas para permitir, pelo menos, 5 divisões celulares. Antes do início das experiências, os testes foram realizados para verificar que a rotulagem pesada era 98%, e Arg Pro a conversão era inferior a 5%. células marcadas-stSILAC pesados ​​foram tratadas com 1 uM geldanamicina (GA) (sinalização celular, Danvers, MA) em dimetilsulfóxido (DMSO) durante 6 ou 20 horas, e as células de luz stSILAC-marcadas foram tratadas com o mesmo volume de DMSO e usado como um controlo. Três repetições biológicas independentes (, controle de luz) células tratadas (pesados ​​marcado) ou não tratados foram conduzidos em paralelo. Uma das três repetições foi invertido usando luz rótulo para o tratado, e pesada do rótulo para as células não tratadas.

As células foram lisadas em sulfato de dodecilo e sódio a 4% (SDS), 100 mM de Tris /HCl pH 7,5, ditiotreitol 100 mM (DTT), seguido por aquecimento a 95 ° C. Após a centrifugação e a concentração de proteína medições, extractos a partir de células equimolares leves /pesados ​​ou heavy-/marcado com médias foram combinadas, alquiladas com iodoacetamida e digerida como descrito [24]. As misturas de peptídeos obtidos (200 ug material total) foram dessalinizadas em cartuchos SepPak C18 (Waters Corp., Milford, MA), secou-se, dissolveu-se em ureia 4 M com 0,1% de anfólitos pH 3-10 (GE Healthcare) e fraccionou-se por fora do gel concentrando-se tal como descrito [25]. As 24 fracções obtidas foram dessalinizadas sobre uma microC18 placa de 96 poços (Waters Corp., Milford, MA), seco e ressuspenso em ácido fórmico a 0,1%, 3% (v /v) de acetonitrilo para análise por LC-MS. As amostras foram analisadas num espectrómetro de massa de armadilha linear LTQ-Orbitrap Velos híbrido (Thermo Fisher, Bremen, Alemanha) com interface através de uma fonte de nanospray a um sistema 3000 nanoHPLC RSLC Dionex (Dionex, Sunnyvale, CA, EUA). Os péptidos foram separados numa fase reversa Acclaim Pepmap nanocolumn (75 uM ID x 15 cm, 2,0 uM, 100 ^, Dionex) com um gradiente de 5 a 85% de acetonitrilo em ácido fórmico a 0,1% (tempo total: 120 min). Completos exames de pesquisa de MS foram realizadas em 60.000 resolução. Na aquisição dependente de dados controlada por Xcalibur 2.0.7 software (Thermo Fisher), foram selecionadas as vinte mais intensos íons precursores de cargas múltiplas detectados na verificação completa do levantamento MS para Colisão Induzida dissociação (CID) a fragmentação na armadilha LTQ linear com um janela isolamento de 3.0 m /z e depois excluídos dinamicamente a partir de uma outra seleção durante 120s. Os dados de proteômica espectrometria de massa foram depositados ao Consórcio ProteomeXchange (https://proteomecentral.proteomexchange.org) através do repositório parceiro PRIDE [26] com o PXD000537 identificador de conjunto de dados

análise de dados MS:. Identificação e quantificação dados

MS foram analisados ​​e quantificados utilizando MaxQuant versão 1.0.13.13 [27], combinado com Mascot (Matrix Ciência, Londres, Reino Unido) versão 2.3. Peaklists foram gerados com MaxQuant com parâmetros padrão. pesquisas de banco de dados foram realizadas na base de dados v3.68 humano IPI, filtrou-se para manter apenas as entradas de mapeamento de um identificador UniProtKB /Swiss-Prot (34743 entradas realmente procurou), a fim de maximizar a sequência e anotação qualidade em outros passos de análise. especificidade de clivagem foi tripsina (clivagem após K, R, nenhuma clivagem no KP, RP), com dois perderam clivagens. tolerâncias de massa foram de 7 ppm para o precursor e 0,5 Da para espectros de massa CID tandem. O derivado de iodoacetamida de cisteína foi especificada como uma modificação fixa, e a oxidação da metionina e proteína acetilação N-terminal foram como especificado modificações variáveis. identificações de proteína foram filtradas em 1% a taxa de falsas descobertas (FDR), criada pelo MaxQuant contra um banco de dados de sequência invertida. Um mínimo de um peptídeo original era necessário para discriminar sequências que compartilhados peptídeos. Os conjuntos de sequências de proteínas que não podem ser discriminadas com base em péptidos identificados foram listados em conjunto, como grupos de proteína e são totalmente relatado nas tabelas. Detalhes de pico quantificação e computação proporção de proteína por MaxQuant são descritos em outro lugar [27]. Todas as proteínas com valores quantificados (elementos mínimos de prova count = 1) foram retidos na primeira, mas filtrada em etapas subsequentes (ver abaixo)

StSILAC análise de dados:. Filtragem do conjunto de dados de Quality

Toda a filtragem etapas foram realizadas com scripts Perl feitos sob medida (Perl v5.10.1, scripts disponíveis como dados suplementares). tabelas de grupos de proteínas de MaxQuant foram ainda processados ​​para remover contaminantes anotados no banco de dados e corresponde a reverter sequências. A mais 63 proteínas a partir de uma lista de laboratório interno de 65 contaminantes ambientais também foram removidos. Mais adiante, as proporções foram removidos quando calculado com base em evidências individuais, assim como, para cada ponto de tempo, as proteínas, se eles foram identificados apenas em um replicado. grupos de proteínas outlier, definidos como proteínas com uma relação diferente por mais de um fator de 1.41 entre quaisquer duas repetições em qualquer ponto do tempo, foram removidos (28 proteínas). definição de outlier foi feito através da representação gráfica dos dados e selecionando pontos com o software de Perseus. Isso resultou na “dataset SILAC filtrada de qualidade” contendo 4050 proteínas (Tabela S2), cada um detectados e quantificados durante pelo menos duas repetições, pelo menos em um ponto do tempo.

T-teste e clustering

Começando com o “conjunto de dados SILAC filtrada de qualidade”, apenas os grupos de proteínas quantificadas em todos os três repetições (3333 proteínas) (Tabela S3) foram mantidos. Para cada ponto de tempo, faça o login

2 de rácios quantificados foram submetidos a um teste t de Welch de duas caudas para uma amostra (hipótese nula H

0: μ = 0), seguida de correção para testes de múltipla (Benjamini-Hochberg ). Todas as proteínas com a p 0,05 (após correcção) foram considerados significativos. grupos de proteínas significativas, pelo menos, um ponto de tempo foram submetidas a modelo de correlação de agrupamento para detectar padrões de comportamento em função do tempo. T-testes e agrupamento foram realizadas com a versão do software R 2.12.1 (2010-12-16). Após a adição de um (0,0) ponto de tempo de referência, os dados foram ajustados pelo cálculo do coeficiente de correlação de Pearson modelos definidos ad hoc, considerando de forma qualitativa simplificado (0 = nenhuma mudança, 1 = log

2 (H /L) 0, -1 = log

2 (H /L) 0) todas as possíveis mudanças ao longo dos dois momentos. Para discriminar alterações como uma função de tempo mais quatro comportamentos foram consideradas quando uma proteína tinha dois valores com o mesmo sinal. Isto resultou em 13 padrões seguintes: [0,2,1] [0,1,2] [0,1,1] [0,1,0] [0,1, -1] [0,0,1 ] [0,0, -1] [0, -1,1] [0, -1,0] [0, -1, -1] [0, -1, -2] [0, -2, – 1] [0,0,0]. grupos de proteínas com t-teste p 0,05 em todos os pontos temporais foram designados para agrupar 13. Proteínas detectada apenas em um ponto de tempo foram designados para agrupar 14.

análise Anotação: remoção de subconjuntos e atualização de anotação de proteínas

Para simplificar comparações post-MaxQuant de conjuntos de dados, as proteínas do subconjunto (identificados com um subconjunto de péptidos) foram removidos a partir dos grupos de proteínas. Para garantir que o UniProt, GO, KEGG e Pfam anotações eram completamente up-to-date, um RESTO script Perl automatizado (Representational State Transfer) solicita ao UniProt (https://www.uniprot.org/uniprot/) e EBI websites (https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/GAnnotation) e Simple Object Access Protocol (SOAP) solicita ao KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes e Genomas) website (https://soap.genome.jp/KEGG.wsdl), bem como re-importação desses dados na tabela de resultados na base dos grupos de proteínas simplificados. A atribuição de cada termo de anotação para cada identificador em um grupo de proteínas foi mapeada, e é relatado na Tabela S4. Gene ontologia (GO) Análise de Enriquecimento de expressão foi realizada com a ferramenta online gorila (https://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il/) [28], utilizando os genes de proteína em cada grupo como consulta, ser comparado com todo o conjunto de proteínas identificadas

organização de dados com base em rede e descoberta

Integração de dados experimentais na interação proteína-proteína (PPI) redes para construir mapas exploráveis ​​usando Cytoscape (http.: //www.cytoscape.org) foi anteriormente descrita [29], [30]. Assumiu-se que a significância estatística é menos importante em uma análise de rede, que conexões privilégios e padrões e, assim, foi utilizado um conjunto de dados menos rigorosa filtrada como entrada. Utilizando a base de dados de PPI-centrado humano [21], foi possível extrair uma rede com as de 1263 proteínas que passaram o teste t (p 0,05) antes da correcção de testes múltiplos, pelo menos, em um dos dois pontos de tempo (6h ou 20 h). Um “nó” nesta rede corresponde a uma proteína e a ligação entre eles é chamado “extremidade” e refere-se à PPI entre estes dois nós. Os rácios de H /L normalizados para 6h e 20h stSILAC conjuntos de dados foram, em seguida, carregado sobre esta rede. Nós foram coloridos com um vermelho-to-azul do inclinação (calor mapa thermogram) de acordo com a sua

2 rácios /fold-change valores, de modo que o vermelho eo azul representam o enriquecimento e exaustão, respectivamente log. Informações para os diferentes membros da rede também foi carregado a partir de diferentes bases de dados (UniProt, Gene Ontology, OMIM) para tê-lo disponível no gráfico como metadados. Com base na organização da rede, integração de dados stSILAC e informações sobre a função da proteína, o Cytoscape plug-in Mcode [31] permitiu a detecção de grupos altamente interconectadas de nós (subgraphs) que podem ser considerados como complexos de proteínas e módulos funcionais para diferentes processos de interesse. Uma vez que foi detectado um módulo funcional de interesse (com funções semelhantes e comportamento semelhante nos dados stSILAC), este sub-rede foi mais explorado para encontrar outros módulos conectados (presentes na rede principal) envolvidos em processos biológicos relacionados em saúde ou doença. Estes esforços foram, então, complementada pela mineração literatura para melhorar a nossa compreensão da relevância biológica destes módulos conectados.

O alinhamento de conjuntos de dados

grupos de proteínas em conjuntos de dados analisados ​​de pcSILAC e stSILAC foram pareados por identificadores de IPI . Somente quando todos os identificadores de IPI em um grupo de proteínas eram idênticos em dois conjuntos de dados, os grupos de proteínas e valores quantitativos foram comparados e alinhados em uma tabela conjunta.

Os anticorpos

O anti-soro anti-OGT policlonal foi um presente de Winship Herr, CIG, da Universidade de Lausanne. Policlonal anti-BRAT1, anti-ITK, anti-eIF2α e anti-fosfo-eIF2α anti-soros foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EUA).

Immunoprecipitation

Células foram lisadas durante 15 min em gelo em tampão de lise (Tris-HCl 20 mM pH 7,4, KCl 150 mM, MgCl 0,2 mM

2, ditiotreitol 1 mM, 2% de Triton X-100). Os extractos foram sonicados e clarificados por centrifugação a 12.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. 1 mg de proteínas do sobrenadante (em 1 ml) foi incubada com cada um dos anticorpos durante a noite a 4 ° C. Após a lavagem dos imunoprecipitados com soro fisiológico tamponado com Tris, as proteínas foram eluídas em tampão de amostra de SDS-PAGE sem DTT por ebulição. DTT 50 mM foi adicionado aos sobrenadantes e as proteínas separadas por SDS-PAGE e processadas para imunotransferência. Para re-sondagem das manchas com um anticorpo diferente, eles foram retirados durante 2 horas a 65 ° C com solução salina tamponada com Tris contendo 0,2% de Tween-20.

ciclo celular análise

Células ( 2 × 10

6) foram fixadas com 2% de paraformaldeído durante 10 min à temperatura ambiente, e foram feitas permeável a seguir ao tratamento com o fosfato tamponado salino (PBS) contendo 0,5% de saponina (Sigma), 2% de FCS e 2 mM de EDTA, durante 5 min à TA. Eles foram, em seguida, incubadas com Hoescht 33342 (20 ng /ml; Invitrogen) durante 5 min à TA. Os dados foram adquiridos em um LSR II (Becton Dickinson) e foram analisados ​​com software FlowJo (TreeStar)

RNA:. NanoString nCounter análise quantitativa

De cada repetição biológico (3 para stSILAC e 2 para pcSILAC) e ponto de tempo, duas amostras de células independentes foram tomadas e processadas separadamente. O RNA foi purificado a partir de extractos celulares utilizando mini-colunas de centrifugação (RNeasyPlus Mini Kit da Qiagen, Hilden, Alemanha). 200 ng de ARN total foram hibridadas com sondas Nanostring multiplexados e as amostras foram processadas de acordo com o procedimento publicado [32]. Os códigos de barras foram contados para 1150 campos de visão por amostra. Correcção de fundo foi feito subtraindo a média mais dois desvios padrão dos controlos negativos para cada amostra. Valores 1 foram fixados para Foram utilizadas como avaliação da qualidade 1. Os controlos positivos. Isto foi feito através da verificação de que a relação entre o maior e o menor controlos positivos média entre as amostras foi inferior a 3. Em seguida, conta para genes alvo foram normalizados com a média geométrica dos 12 genes de referência (lista de genes) seleccionados como os mais estáveis ​​usando o algoritmo geNorm [33]. Dobrável alterações foram calculadas como rácios da média geométrica das contagens em condições experimentais (GA) sobre a da condição de controle (DMSO) e foram expressos como log

2 valores.

Resultados

sistema experimental

a linha de células Jurkat de linfócitos T tem sido utilizado como um modelo para a definição de mecanismos de susceptibilidade de cancro a drogas [34] e para analisar o impacto de inibidores de Hsp90 em proteínas individuais ou funções celulares [35] – [39]. membros da família de Hsp90 em células eucarióticas são representados por Hsp90β citosólica (constitutiva, codificada por HSP90AB1) e Hsp90α (indutível, codificada por HSP90AA1), retículo endoplasmático (ER) Grp94 (endoplasmin) e a isoforma mitocondrial TRAP1. O tratamento de células com GA foi mostrado para inibir Hsp90β, Hsp90α, e Grp94, enquanto TRAP1 é, possivelmente, menos ou não afectada por GA em células intactas [40].

Primeiro, foi realizado um padrão SILAC (stSILAC) análise global dos efeitos da inibição da Hsp90 durante o curso do tratamento, expressos como mudanças na abundância relativa de GA-tratado versus células controlo de DMSO. Utilizou-se uma concentração sub-letal de drogas [1 uM] no meio (abaixo da concentração intracelular de proteínas prevista de Hsp90). A concentração de AG utilizado foi encontrada para reduzir o número de células em t = 20 h após o tratamento. Isto ocorreu muito provavelmente através da indução de uma paragem do ciclo celular, que foi detectado por uma citometria de fluxo como um enriquecimento de células bloqueadas tanto em G1 ou fase G2 /M (Fig. S1A-B), e foram acompanhados por uma depleção de células em fase S. Foi avaliada a indução de apoptose por imunotransferência, detectar a clivagem do substrato de caspase poli (ADP-ribose) polimerase (PARP1), mas observou nenhuma forte indução de apoptose sob as condições de ensaio (Fig. S1C). A dinâmica dos efeitos do inibidor de Hsp90 em abundância de proteína foi monitorizada por amostragem de alíquotas de células e extracção de proteínas em pontos de tempo t = 6 horas e t = 20 h após a adição da droga. As amostras foram também recolhidas a t = 5 h T = 19 h e para a purificação de ARNm total para determinar os níveis de transcrição (Figura 1A). Os dados de stSILAC foram integrados com as interações proteína-proteína para construir uma rede e com as taxas de síntese e de degradação a partir de dados pcSILAC e mRNA para uma análise multi-parâmetro do sistema (Figura 1B).

A) Rotulagem e amostra esquema de preparação. Geldanamicina ou DMSO foram adicionados a t = 0. Os extractos de proteína total foram recolhidos em t = 6h e 20h, enquanto que ARNm total foi feita em t = 5 h e t = 19 h. B) A análise dos dados e interpretação dos dados combinados sobre alterações abundância de proteína (stSILAC) com interacções proteína-proteína (PPI) analisada como uma rede, a síntese e os valores de degradação para proteínas nas duas condições e os níveis de transcrição. Enriquecimento de termos de anotação Gene Ontologia foi utilizada para extrair informações funcionais sobre as categorias de proteínas com comportamentos comuns.

recursos globais dos conjuntos de dados stSILAC

A análise dos dados de EM com MaxQuant com parâmetros padrão identificados 5707 grupos de proteínas (Tabela S1) antes de filtrar. Conjuntos de proteínas identificadas eram altamente semelhantes entre as repetições, com 73% dos grupos de proteínas totais identificados em todas as três repetições de cada ponto de tempo. correlação de rácios /controle tratados entre repetições em 20h de Pearson foi maior do que 0,85 (Fig. S2A-B), indicando boa reprodutibilidade. As diferenças entre as células tratadas com GA e de controlo aumentou com o tempo, como mostrado pelo alargamento da distribuição de proporções indo de 6h a 20h (Fig. 2A). A correlação entre a proporção de mediana para a 6h e 20h foi apenas parcial (r = 0,59, Fig. S2C), sugerindo que, embora na maioria dos casos, os níveis de proteína alterada na mesma direcção, padrões mais complexos de alterações no tempo podia ser observada.

a) histogramas de rácios /controle tratados normalizado para o 6h stSILAC (amarelo) e 20h (verde) conjuntos de dados (4050 proteínas). B) Doze possíveis padrões de mudança após tratamento GA foram definidos (pequenos lotes) como modelos para o agrupamento de correlação. agrupamentos complementares (não mostrado) incluído proteínas com alterações significativas (grupo 13) e proteínas com dados somente em um ponto de tempo (grupo 14). O número de genes que codificam proteínas () identificadas em cada cluster são indicados na caixa.

Análise e agrupamento de dados stSILAC

Para a análise de todo os dados proteoma, o stSILAC conjunto de dados foi filtrada para reter apenas as proteínas detectadas em todas as três repetições (Tabela S3) e, em seguida, submetido a um teste-t para identificar proteínas que variaram significativamente entre o controlo e as amostras de inibidor tratadas. 565 proteínas (17%) passaram o teste t (p 0,05, com correcção de Benjamini-Hochberg) em pelo menos um dos dois pontos de tempo e, portanto, mostrou estatisticamente alterações significativas após tratamento com GA. Este conjunto de dados foi montado para

ad hoc

padrões definidos, resultando em 12 grupos, cada um representando padrões qualitativamente distintos de variação de abundância, ou comportamentos em 6 e 20h (Fig. 2B) (Fig. S3, Tabela S3). Proteínas não significativamente afetadas pela GA foram omitidos da análise de agrupamento. A vantagem desta abordagem em relação a métodos de agrupamento sem supervisão que é um comportamento comum de proteínas em cada cluster pode ser facilmente deduzida. Curiosamente, os quatro maiores clusters (agrupamentos 2, 6, 7 e 11) continham cada um mais de 80 proteínas e, juntos, responderam por 94,3% de todas as proteínas em cluster. Estes aglomerados 4 correspondeu, respectivamente, para as proteínas aumentar ou diminuir continuamente a partir de 6 a 20 h (respectivamente, aglomerados 2 [0: 1: 2] e 11 [0: -1: -2]), ou de proteínas significativamente variando apenas às 20h (grupo 6 [0: 0: 1] e 7 [0: 0: -1]) (Fig. 2B). Todos os outros clusters continha números menores de proteínas, com um máximo de 10 para cluster de 5.

Efeitos da inibição de Hsp90 com base nos termos GO enriquecidos nos clusters e em experimentos adicionais

Para determinar se funcionalmente ou proteínas estruturalmente relacionadas foram flutuação da mesma maneira aquando do tratamento de droga, foi realizada uma análise de enriquecimento anotação em cada um dos 12 grupos (Tabela S4, uma selecção de aglomerados e alguns dos seus termos GO associados é mostrado na Tabela 1). Globalmente leve (max. Aumento de 4 vezes no máximo. Diminuição de 5 vezes) foram detectados efeitos sobre proteínas e complexos de proteínas envolvidas em uma ampla variedade de processos e vias de sinalização.

Clusters com níveis crescentes sobre Hsp90 inibição

nos estágios iniciais da inibição da Hsp90 por GA (grupo 2), identificamos um aumento de proteínas envolvidas na resposta ao dobrar o estresse no citosol, mas também na ER, de acordo com os resultados anteriores em mieloma células tratadas com inibidores de Hsp90 [41], [42]. Muitas proteínas localizadas em compartimentos vesiculares foram também aumentadas. As mesmas ou relacionados termos GO também foram enriquecidos em proteínas mais tarde, aumentando em conjunto 6, juntamente com os componentes do citoesqueleto, pequenas GTPases ligada à membrana (proteínas Rab), proteínas de Golgi e do proteassoma. Em geral, um aumento da regulação do dispositivo de dobragem no citosol e ER, juntamente com um stress geral e da resposta pro-sobrevivência emergem do conjunto de proteínas aumentado. Como a resposta ao estresse ER observado, avaliou-se a fosforilação da subunidade α do fator de iniciação eucariótico 2 (eIF2α), quer por cinases de proteínas que se localizam no citoplasma (PKR), ou na membrana ER (PERK), uma vez que tem foi estabelecida como um mecanismo de resposta ao estresse para inibir a síntese de proteínas [43]. Nós confirmamos um ligeiro aumento da fosforilação da eIF2α logo após a GA-tratamento (Fig. S4), de acordo com estudos anteriores realizados em células HeLa [44].

Clusters com diminuição dos níveis em cima Hsp90 inibição

Foi observada uma diminuição acentuada (até 6h) de proteínas de ligação a ATP e proteínas quinases (grupo 11). Entre estas proteína-quinases, observou-se uma diminuição contínua e progressiva de membros da via de sinalização do receptor de células-T. Observou-se um número considerável de proteínas ligadas a cinetócoro e funções de cromossomas condensados. A maior parte destas proteínas eram proteínas poro nuclear implicados no transporte nucleo-citoplasmático. efeitos tardios (grupo 7) refletiu o enriquecimento de vários termos GO ligados a biogênese do ribossomo (processamento de rRNA, proteínas nucleolares). Alguns fatores essenciais para a replicação do DNA (passo de alongamento) foram também diminuiu em momentos tardios. biogénese ribossoma, um dos processos celulares mais caros em termos de energia, é conhecida por estar correlacionada com a progressão do ciclo celular pela via de MDM2-p53 [45]. No geral, a regulação negativa da síntese protéica máquinas em conjunto com mudanças ligadas à paragem do ciclo celular parecem surgir a partir do conjunto de proteínas decrescentes.

A análise de redes

O tratamento medicamentoso levou a uma abundância reduzida de ambos muitos potencialmente novos clientes Hsp90 conhecido e. Nós fundamentado que o esgotamento não pode ser tomado por si só, no sentido de que uma proteína é um cliente de Hsp90, e nós explorada outras estratégias para dissecar os eventos. Nós portanto os conjuntos de dados modelados stSILAC quantificados para a rede previamente construído Hsp90 interacção proteína-proteína (PPI) Hsp90Int [21]. Vários subgraphs altamente interligados e módulos funcionais foram extraídos do banco de dados Hsp90Int para exibir mudanças dinâmicas com base no conjunto de dados stSILAC.

Componentes da Hsp90 chaperona molecular máquina

Os chaperones moleculares Hsp70 e Hsp40 foram detectados