Abstract

O objetivo deste estudo é determinar se pacientes com degeneração cerebelar paraneoplastic (PCD) e cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) têm um repertório de anticorpos específicos, se os anticorpos SOX1 (SOX1-ab) pode prever a presença de SCLC, e se os anticorpos para antigénios de superfície celular ocorrer nesta síndrome. análise de anticorpo foi feito usando imuno-histoquímica em cérebro de rato, immunoblot com antígenos recombinantes, o rastreio de bibliotecas de expressão de cDNA e imunomarcação de neurônios vivos em 39 pacientes com PCD e SCLC. VGCC-ab foram medidos por RIA, e SOX1-ab, Hu-ab, e ZIC4-ab por immunoblot. síndrome miastênicas Lambert-Eaton (LEMS) esteve presente em 10 dos 23 pacientes com estudos eletrofisiológicos. Pelo menos um anticorpo foi detectado em 72% dos pacientes. As frequências individuais foram: 49% SOX1-ab, 44% VGCC-ab, 31% Hu-ab, e 13% ZIC4-ab. SOX1-ab ocorreu em 76% dos pacientes com VGCC-ab e 27% daqueles sem VGCC-ab (p = 0,0036). SOX1-ab não foram encontrados em 39 pacientes com ataxia cerebelar de início tardio esporádica, 23 com ataxia cerebelar e anticorpos descarboxilase do ácido glutâmico, e 73 com PCD e de câncer que não SCLC (31 sem anticorpos onconeural, 25 com Yo-ab, 17 tipos com Tr-ab). Cinco pacientes (13%) tinham anticorpos contra antigénios de superfície de células neuronais desconhecidos mas nenhum deles melhorado com a imunoterapia. Um soro imunorreagiram contra o segmento inicial axónio dos neurónios e outro soro contra ELKS1, uma proteína altamente expressos no cerebelo que interage com a subunidade-beta4 do VGCC. Em conclusão, 72% dos pacientes com SCLC PCD e tinha um ou mais anticorpos que indicam a presença desse tumor. Nesses pacientes, VGCC-ab e SOX1-ab ocorrer firmemente associado. SOX1-ab são preditores de SCLC em pacientes ataxia com uma especificidade de 100% e sensibilidade de 49%. Ao contrário de encefalite límbica com CPPC, os anticorpos para a célula que não VGCC-ab antígenos de superfície, são pouco frequentes e não prever a resposta ao tratamento

Citation:. Sabater L, Höftberger R, Boronat A, Saiz A, Dalmau J, Graus F (2013) Antibody repertório em Paraneoplastic cerebelar Degeneration e Pequenas células do cancro do pulmão. PLoS ONE 8 (3): e60438. doi: 10.1371 /journal.pone.0060438

Autor: Michael Platten, Hospital Universitário de Heidelberg, Alemanha |

Recebido: 08 de novembro de 2012; Aceito: 27 de fevereiro de 2013; Publicação: 25 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Sabater et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelo Fondo de Investigaciones Sanitarias. Madrid. Espanha (#FIS PS09 /0193 FG), o Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung, Áustria, J3230 Projeto (RH) e NIH RO1NS077851, NCI RO1CA089054, Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS, 11/01780), e Fundació la Marató de TV3 (JD). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Dr. Dalmau tem uma bolsa de investigação EUROIMMUN, e recebe royalties de patentes para o usar de Ma2 e NMDAR como testes de auto-anticorpos. Ele não tem interesses concorrentes financeiros, tais como a propriedade de ações ou quotas, de emprego ou de consultoria pagos, participação no conselho, bolsas de viagem e honorários para falar ou a participação em reuniões, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados, ou presentes de qualquer espécie etc. A relação de Dr. Dalmau com a empresa EUROIMMUN não altera os autores, a adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Nenhum dos outros contribuintes têm quaisquer conflitos de interesse.

Introdução

A célula de Purkinje é um dos alvos mais comuns da resposta imune que alguns pacientes com câncer construído contra antígenos partilhada pelo tumor e no sistema nervoso [1]. A morte das células de Purkinje resulta na síndrome pancerebellar chamada degeneração cerebelar paraneoplastic (PCD) [1]. cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é um dos tumores mais comuns que se associam com PCD [2]. Considerando que muitos pacientes ( 80%) com outras síndromes neurológicas paraneoplásicos e anticorpos SCLC porto Hu (Hu-ab), a frequência de Hu-ab em PCD é baixa (23%) [3]. Aproximadamente, 40% dos pacientes de PCD com CPPC têm anticorpos para canais de cálcio dependentes da voltagem (VGCC), e alguns também apresentam evidência clínica ou neurofisiológico da síndrome miastênica de Lambert-Eaton (LEMS) [3]. Até 60% dos pacientes com LEMS e SCLC tem SOX1-ab, um marcador sorológico de SCLC [4].

Devido à associação frequente de PCD com CPPC, e às vezes com LEMS, que argumentou que a determinação de SOX1-ab também pode ser útil para prever se os pacientes com suspeita de PCD têm um SCLC subjacente. Além disso, os pacientes com encefalite límbica e SCLC, mas sem anticorpos onconeural muitas vezes têm anticorpos contra receptores de superfície neuronais, se este paradigma também se aplica para o PCD é desconhecida [5].

No presente estudo foi analisado o repertório de anticorpos em um série de pacientes com PCD e CPPC, com foco na frequência de SOX1-ab ea presença de novos anticorpos para antígenos de superfície celular neuronal.

Métodos

os pacientes

Foram selecionados do nosso banco de dados, os pacientes com o diagnóstico de PCD e SCLC. Nós especificamente excluídos pacientes que apresentaram ataxia, mas desenvolveram rapidamente sintomas para além da disfunção cerebelar. Estes pacientes foram considerados como tendo encefalomielite paraneoplastic, que em contraste com PCD quase sempre associa com [6] Hu-AB. A deficiência neurológica foi avaliada pela escala de Rankin modificada como descrito [6], [7]. A informação clínica foi obtida a partir de formulários preenchidos pelos neurologistas referentes e entrevistas telefónicas.

padrão de protocolo aprovações, registros e paciente consentir

As amostras de soro e CSF utilizados no estudo são depositadas no coleta de amostras biológicas com o nome “neuroinmunología” registrado no biobanco do Institut d ‘Pi Investigació Biomedica agosto i Sunyer (IDIBAPS), Barcelona, ​​Espanha. Considerando-se que muitos pacientes estavam mortos no momento que o estudo foi realizado eo estudo é completamente anônima de forma que nenhum exemplo pode ser identificado a um paciente particular, ela foi aceita renunciar ao consentimento informado por escrito específico dos pacientes ou parentes mais próximos pelo Comité Etic d’Investigació Clínica (CEIC), do Hospital Clínic. procedimentos de manuseio de animais foram aprovados pelo Comitê de Ética local (99/1 Universidade de Barcelona) e da Generalitat de Catalunya (1094-1099), de acordo com a Directiva 86/609 /UE da Comissão Europeia. O estudo, como explicou foi aprovado pelo CEIC do Hospital Clínic.

A detecção de anticorpos anti-neuronais

soro e CSF, quando disponíveis, foram avaliados quanto à presença de onconeural (Hu, Yo, Ri, CV2, amphiphysin, Ma2, Tr), anti-neurópilo (NMDAR, Ampar, GABA

BR, CASPR2, LGI1, mGluR1 e mGluR5) ou possíveis novos anticorpos por imuno-histoquímica em cortes congelados de perfusão-paraformaldeído ou pós-fixada cerebelo de rato como descrito [8]. positividade Onconeural anticorpo foi confirmada por imunotransferência comercial (Ravo Diagnostika GmbH, Freiburg, Alemanha) e anticorpos anti-neuropil por um ensaio baseado em células usando células HEK293 transfectadas com os plasmídeos adequados, como anteriormente descrito [9]. Os anticorpos contra a subunidade β4 e γ2 de VGCC foram detectados por imunofluorescência em células HEK293 transfectadas com os plasmídeos (MC201619 e SC312948; Origene, Rockville, Maryland, EUA). Os anticorpos para P /Q tipo VGCC foram medidos por um radioimunoensaio comercial (DLD Diagnostica GmbH de Hamburgo, Alemanha). SOX1-ab e ZIC4-ab foram determinados utilizando filtros de nitrocelulose com placas de fagos mistos (50% das placas de clones positivos e 50% a partir de clones irrelevantes). Os filtros foram cortados em pedaços, cada uma incubada com diferentes soros do paciente (diluição 1:1000) e desenvolvido por uma técnica de imunoperoxidase de avidina-biotina como descrito [4].

Para confirmar a especificidade da SOX1-aB na diagnóstico de PCD associada com SCLC, SOX1-ab também foram analisados ​​no soro de 31 pacientes com PCD e diferentes tipos de câncer, além SCLC, que não abrigava anticorpos onconeural que poderiam confirmar o diagnóstico de PCD, 25 com PCD, mama ou câncer de ovário, e Yo-ab, 17 com PCD, doença de Hodgkin, e Tr-ab, 39 pacientes com ataxia cerebelar esporádica de início tardio, e 23 com ataxia cerebelar e anticorpos descarboxilase do ácido glutâmico.

cultura de células primária e in vivo imunocitoquímica

neurónios do hipocampo foram obtidos a partir de embriões de ratos Wistar E18. As células foram enzimaticamente e mecanicamente interrompidos e ressuspensas em meio Neurobasal suplementado com B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) [9]. culturas de células granulares de cerebelo foram preparadas a partir dissecadas de ratos Wistar de 8 dias de idade e processados ​​igualmente como neurónios do hipocampo, mas utilizando-se um meio Neurobasal que contém 25 mM de KCl e suplementado com B27 [10]. As células foram plaqueadas em poli-L-lisina P24 placas pré-revestidas e 10 uM citosina -D-arabinofuranósido (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi adicionado às culturas 20 horas após o plaqueamento, para prevenir a proliferação de não células neuronais.

Nas experiências imunocitoquímica, as amostras (01:05 diluição CSF ​​e diluição do soro 1:200) foram incubadas em neurónios vivos durante 1 hora, depois fixadas com paraformaldeído a 4% e permeabilizadas com 0,3% de Triton TX -100. A coloração com anticorpo anti-MAP2 foi realizada a fim de confirmar a especificidade neuronal das células positivas. anticorpos secundários fluorescentes apropriadas foram aplicadas e as lamelas foram montadas com Vectashield com meios de montagem de DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) e visualizadas com um microscópio axio Imager M2 ZEISS.

rastreio de bibliotecas de expressão de ADNc

bibliotecas Uni-ZAP XR de cerebelo humano e do cérebro fetal humano (Stratagene, La Jolla, CA) foram imunologicamente com soros SCLC 10 PCD (4 pacientes com SOX1-ab e VGCC-ab, 4 soronegativa, 1 com VGCC- ab e 1 com SOX1-ab), utilizando técnicas anteriormente relatados [4]. Resumidamente, imunopesquisa da biblioteca de ADNc com soro (diluição 1:1000) foi realizada para chegar isoladas placas positivas. Os clones de fagos foram subclonados no plasmídeo pBluescript in vivo usando o protocolo de excisão de resgate do fago em (Stratagene, La Jolla, CA). O DNA de plasmídeo foi purificado com o kit miniprep da rotação QIAprep (Qiagen, Santa Clarita, CA) e sequenciados com o sequenciador de ADN ABI 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando o Big Dye Terminator pré-misturado (Applied Biosystems). Os clones positivos foram sequenciados em ambas as cadeias. O programa BLAST genoma humano (NCBI, NIH, Bethesda, MD) foi usado para procurar homologias.

Análise Estatística

A correlação entre SOX1-ab e VGCC-ab foram analisados ​​em uma contingência mesa e o teste exato de Fisher bicaudal foi aplicado.

Resultados

os pacientes

foram identificados 39 pacientes com PCD e SCLC. A idade média dos pacientes era de 64 anos (intervalo: 47 a 85 anos) e 34 eram do sexo masculino. PCD antecederam o diagnóstico de CPPC em 36 pacientes com um tempo médio de 2 meses (variação: 0,5 a 42 meses). No momento do diagnóstico PCD 10 pacientes tiveram LEMS e 13 não (confirmado por potenciais de pelo menos normais de ação muscular composto em eletromiografia (EMG) estudos [11]). O resto dos 16 pacientes não referem sintomas de LEMS mas há estudos EMG foram feito. Vinte e sete doentes receberam, pelo menos, um ciclo completo (imunoglobulinas intravenosas ou esteróides, ou ambos) de imunoterapia (6 pacientes), quimioterapia (14) ou ambos (7). Nenhuma melhoria ou estabilização com disfunção cerebelar moderada a grave (pontuação Rankin 3) ocorreu em 13 dos 21 pacientes (62%) que tiveram um seguimento adequado. Três pacientes melhoraram e 5 permaneceram estáveis, com uma pontuação Rankin de 3 ou menos

VGCC e anticorpos onconeural:. Associação com anticorpos SOX1

Setenta e dois por cento dos pacientes tiveram pelo menos uma das indicadas anticorpos. As frequências individuais dos anticorpos foram: 49% SOX1-ab, 44% VGCC-ab, 31% Hu-ab, e 13% ZIC4-ab. Vinte e oito soros apresentaram, pelo menos, um anticorpo, e 11 foram negativas (Figura 1). Houve uma correlação clara entre SOX1-ab e VGCC-ab. SOX1-AB foram encontrados em 76,5% dos pacientes com VGCC-AB, mas em apenas 27,3% das pessoas sem VGCC-AB (teste de Fisher exacto p = 0,0036) (Figura 2). Positivo VGCC-ab foram encontrados em 9 (90%) dos 10 pacientes com LEMS e em 7 (54%) dos 13 sem evidência clínica ou EMG da SMLE. Da mesma forma, SOX1 AB-se presentes em 80% dos pacientes com LEMS e 38% daqueles sem LEMS. Não foram observadas associações entre VGCC-ab ou SOX1-ab e Hu-ab. Nenhum dos pacientes eram positivos para anticorpos onconeural, excepto Hu, ou com anticorpos anti-neuropil bem caracterizados. SOX1-ab não foram detectados na série de 73 pacientes com PCD e diferentes tipos de cancros que não SCLC, 32 pacientes com ataxia cerebelar esporádica de início tardio, e 23 com ataxia cerebelar e anticorpos descarboxilase do ácido glutâmico.

Distribuição de SOX1-, VGCC-, Hu- e ZIC4-ab em nosso grupo de pacientes. Cada linha representa um paciente e, quando positiva a célula está cheio de cor. Representação

Gráfico de barras da correlação entre SOX1-ab e VGCC-ab. (Fisher teste exato de p = 0,0036).

Identificação de novos anticorpos

Um soro com SOX1-ab também mostraram imuno robusta contra o segmento inicial do axônio dos neurônios em estudos de imuno-histoquímica de rotina ( Figura 3A). O rastreio de uma biblioteca de expressão de cDNA de cerebelo humano com este soro falhou para identificar o antigénio putativo. Outro novo anticorpo foi identificado durante a pesquisa de bibliotecas de cDNA com um soro com VGCC-AB. A proteína alvo, chamado ELKS1, é altamente abundante no cerebelo. Foi realizado um ensaio de rastreio fago específico para a detecção de ELKS1 mas não conseguimos encontrar outro soros positivos. PCD soros também não apresentou imunorreatividade com células HEK293 transfectadas com o β4 ou y2 subunidades auxiliares de VGCC. Cinco pacientes (12,8%) tinham anticorpos contra antígenos de superfície celular expressos em vivo neurônios, não-permeabilizadas hipocampo (Figura 3B), mas apenas um deles reagiu com neurônios granulares do cerebelo.

A. Os anticorpos contra o morro dos neurônios do cerebelo de rato. A imuno-histoquímica em secções de ratos cerebelo sagital. Nota a forte reactividade atípica de um soro PCD SCLC contra o axônio outeiro dos neurônios, principalmente nas células de Purkinje. Os núcleos são contrastadas com hematoxilina. B. imunofluorescência em neurónios do hipocampo ao vivo. neurônios do hipocampo incubadas com CSF 1/5 diluída de um paciente PCD SCLC. Reactividade do paciente contra a membrana do neurónio é visto na coloração verde e MAP2 no vermelho para assegurar a linhagem neuronal. Núcleos são vistos azul com DAPI. (Óleo 100x objetivo)

Discussão

No estudo atual queríamos determinar se pacientes com PCD e SCLC tinha outros do que VGCC-ab anticorpos que poderiam explicar a ataxia cerebelar ou pelo menos para ajudar no diagnóstico da PCD. A determinação isolada de VGCC-ab em um paciente com ataxia cerebelar com ou sem LEMS quase sempre confirma a origem paraneoplastic porque a associação clínica de ataxia cerebelar e LEMS muito raramente ocorrem na ausência de câncer [12], [13]. Além disso, se a ataxia cerebelar é paraneoplastic e o paciente tem VGCC-AB do tumor subjacente é sempre um SCLC [14].

Para superar esta limitação, analisou-se a presença de SOX1-AB, um marcador serológico de SCLC [15]. Em nossa série de PCD e SCLC descobrimos que SOX1-ab estavam presentes em quase 50% desses pacientes. Em contraste, SOX1-aB não foram encontrados no soro de pacientes com DCP e outros tipos de tumores, com ou sem anticorpos onconeural e em pacientes com ataxia cerebelar sem cancro. Nossos dados indicam que SOX1-ab são bons preditores de uma SCLC subjacente em pacientes com ataxia cerebelar. A frequência de SOX1-ab foi ainda maior (76,5%) em pacientes com CPPC PCD que também tinham VGCC-ab. Esta frequência é semelhante à relatada em pacientes com SCLC e LEMS (67%) [16]. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que em pacientes com PCD e SCLC, a co-ocorrência de VGCC-ab e SOX1-ab está fortemente associada, embora 41% dos pacientes de PCD com VGCC-ab da série atual não tem LEMS

estudos anteriores mostraram que todos os pacientes com LEMS e SCLC que tiveram Hu-ab também teve SOX1-ab [16]. Portanto, testes adicionais para Hu-ab não melhorou o diagnóstico de paraneoplásico LEMS [16]. No entanto, a conclusão do estudo atual tem implicações diferentes. Considerando SOX1-ab, ocorreu em 48,7% dos pacientes com PCD, um adicional de 20% dos pacientes tiveram Hu-ab ou VGCC-ab. Em geral, combinando o teste de todos os 3 anticorpos (todos disponíveis comercialmente) irá identificar quase 70% dos pacientes com SCLC e CPD. Alguns pacientes podem ter outros anticorpos onconeural como ZIC4, CV2 ou amphiphysin e todos, mas ZIC4 são rotineiramente rastreadas com os mesmos kits comumente usados ​​para detectar Hu-ab.

Nós não encontrar outros anticorpos potencialmente úteis desta série . O soro de um paciente mostrou reatividade com o segmento inicial do axônio de grandes neurônios. Este anticorpo foi previamente relatado em um paciente com encefalomielite e SCLC que desenvolveu convulsões e ataxia da marcha graves [17]. Nós já identificou este imunorreatividade em um paciente com SCLC sem sintomas neurológicos sugerindo o anticorpo pode ser um marcador da SCLC subjacente (não publicado). Outro paciente teve um anticorpo contra ELKS1, uma proteína predominantemente expresso em células de Purkinje [18]. Embora ELKS1 co-imunoprecipitados com a subunidade VGCC β4, não foi possível identificar anticorpos que reagem directamente com β4 ou γ2, que são subunidades VGCC que são altamente expressos no cerebelo [18], [19]. Nosso estudo não exclui a possibilidade de que os soros desses pacientes poderia ter anticorpos contra outras subunidades VGCC ou proteínas que interagem. Por exemplo, soros de pacientes com LEMS não paraneoplásicos reagir com mais frequência com o domínio IV do alfa1A de VGCC comparação com pacientes com LEMS e SCLC [20].

A recente descoberta de anticorpos contra antígenos de superfície neuronais tem alterou o conceito de que anticorpos no SNC síndromes paraneoplásicos são apenas marcadores substitutos do tumor subjacente. Enquanto em pacientes com encefalite límbica e SCLC cerca de 50% têm Hu-ab e os outros 50% têm anticorpos contra proteínas sinápticas (principalmente GABA

receptor B) [5], o nosso estudo mostra que, em pacientes com PCD e SCLC a ocorrência de anticorpos para célula diferente VGCC-ab proteínas de superfície, é raro.

a implicação prática do nosso estudo é que em pacientes com ataxia cerebelar, SOX1-ab são bons preditores de uma SCLC associado com uma especificidade de 100 % e uma sensibilidade de 49%. Além disso, a combinação de testes para SOX1-, VGCC-, e Hu-AB identifica quase 70% dos pacientes com SCLC e CPD. Dado que PCD se desenvolve normalmente antes do diagnóstico do tumor, este repertório de anticorpos é útil para estabelecer que a síndrome cerebelar é paraneoplásica, o tumor subjacente é SCLC, ea chance de recuperação neurológica é baixa.

Agradecimentos

Os autores agradecem Mercé Alba e Eva Caballero pela sua excelente suporte técnico. Os autores agradecem também Dr. Xavier Xifró para fornecer o protocolo de cultura de células granulares do cerebelo.