Abstract

Fundo

fator de necrose tumoral alfa (TNF) é capaz de matar as células cancerosas através de morte celular mediada pelo receptor exigindo trifosfato de adenosina (ATP). o uso clínico de TNF até agora é em grande parte limitada pela sua profunda hepatotoxicidade. Recentemente, foi encontrado no sistema murino que a protecção específica de hepatócitos contra os efeitos prejudiciais do TNF pode ser conseguida por depleção de ATP mediada por frutose nele. Antes de utilizar este princípio selecção bastante atraente em um primeiro ensaio clínico, nós aqui exaustivamente investigada a interdependência entre a depleção de ATP e TNF hepatotoxicidade em ambos

in vitro

e

ex vivo

experimentos com base no uso de primário materiais de tecido do paciente.

Métodos

hepatócitos primários humanos, e fatias de tecido de fígado primário derivado do paciente, tanto não-tumorais e tumorais foram utilizadas para elucidar depleção de ATP induzida por frutose e citotoxicidade induzida por TNF.

resultados

PHH, bem como cortes de tecidos preparados a partir de amostras de fígado humano não-malignas submetidos a uma depleção de ATP mediada por frutose foram ambos demonstraram a ser protegida contra a morte celular induzida pelo TNF. Em contrapartida, devido à sobre-expressão específica do tumor de hexoquinase II, que impõe um profundo desvio no catabolismo frutose-específica hepatocítica, este não foi o caso de tecidos do fígado tumorais humanas.

Conclusão

normal tecidos de fígado humano pode ser protegido temporariamente contra a morte celular induzida por TNF por pré-tratamento sistémico com frutose usado em concentrações fisiológicas /não-tóxicos. Selective TNF-alvo de tumores primários e secundários do fígado por depleção transitória e específica de ATP hepatocítica abre uma nova avenida clínico para o tratamento à base de TNF dos cânceres de fígado

Citation:. Weiland T, Klein K, Zimmermann H, Speicher t, Venturelli S, Berger, A. et al. (2012) proteção seletiva de tecido hepático humano em TNF-Segmentação de cancros do fígado por Transient Esgotamento de trifosfato de adenosina. PLoS ONE 7 (12): e52496. doi: 10.1371 /journal.pone.0052496

editor: Johannes Haybaeck, Médico da Universidade de Graz, Áustria

Recebido: 09 de agosto de 2012; Aceito: 19 de novembro de 2012; Publicação: 18 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Weiland et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela subvenção ICEPHA 2009-09, o Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB /TRR77), o Ministério Federal de Educação e Pesquisa (BMBF, # 0315755) e da Fundação Robert Bosch, Stuttgart, Alemanha. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o uso sistêmico do altamente potente fator de necrose tumoral citocina antineoplásica (TNF) é altamente limitado

devido à constatação de que as funções pleiotrópicas do TNF induzem graves efeitos colaterais sistêmicos

, em particular toxicidade hepática alto grau [ ,,,0],1], [2]. Portanto, a administração sistémica de TNF foi substituído em entidades tumorais seleccionadas com sucesso por regimes única empregando perfusões locais de extremidades com TNF [3], [4]. No entanto, estas estratégias permanecido elusivos para perfusão hepática isolado (IHP) utilizado para o tratamento de neoplasias malignas do fígado [5] – [8].

Recentemente, a apoptose induzida por TNF hepatocítica foi reconhecida como altamente ATP processo dependente num modelo murino [9]. Além disso, há evidências de que a frutose conduz à depleção de ATP exclusivamente em hepatócitos. Como consequência funcional, hepatócitos (em contraste com os seus homólogos malignas) exibem protecção no sentido de apoptose induzida por TNF [9], [10]. Esta diferença biológica entre os hepatócitos e células malignas foi atribuída a um sobre-expressão relacionada com a transformação da hexoquinase II (HKII) que conduz a um desvio do catabolismo frutose-hepatocítica específica [10]. Na presença de frutose, as enzimas críticas específicas do fígado ketohexokinase (KHK) e aldolase B (AldoB) estabelecer, uma armadilha ATP-específica hepatocítica reversível [11]. Superexpressão de HKII ignora esse coletor

para que

frutose é convertida preferencialmente em frutose-6-fosfato e metabolizados via “músculo do tipo” glicólise sem afetar os níveis de ATP celular (descrito em detalhes na Figura 1).

o aumento da expressão de hexoquinase II (HKII) em células tumorais resulta num metabolismo do tipo muscular de frutose (parte inferior da figura) que não engloba qualquer esgotamento ou aprisionamento de ATP. Em contraste, os hepatócitos (parte superior da figura) utilizar as enzimas ketohexokinase (KHK) e aldolase B (aldoB) e, assim, um tipo de metabolismo hepático de frutose. Como resultado, há uma conversão dependente de ATP muito rápida de frutose por meio de KHK a frutose-1-fosfato de actuar como um dissipador de fosfato dramaticamente derrubar os níveis celulares de ATP.

Ao nível molecular,

este efeito protetor específico do hepatócito mediada por frutose em direção TNF

é mais provável alcançada por produtos de degradação da ADP, que se acumulam em forma de adenosina. Recentemente,

foi demonstrado que a adenosina provoca uma adenosina autócrino 3 ‘, 5’-monofosfato cíclico de resposta

, afectando negativamente a actividade induzida por TNF da quinase c-Jun N-terminal (JNK) em uma proteína quinase A forma dependente [12].

Em nosso estudo, nós investigamos a possibilidade de transferir essa abordagem a partir de dados de murino para o sistema humano no que diz respeito ao esgotamento ATP transitória mediada por frutose e efetuando assim o desarmamento seletiva do TNF é destrutivo Propriedades hepatocíticas. Para este fim, nós utilizados (i) cultivadas hepatócitos primários humanos (PHH) e, (ii) fatias de corte de precisão de tecidos hepáticos humanos saudáveis ​​

contra

tecidos hepáticos humanos malignos derivados de resectates fígado dos pacientes em uma translação e

x vivo

abordagem. Além de experimentação murino realizado anteriormente, w

e agora eram capazes de traduzir conhecimentos adquiridos sobre a protecção hepática mediada por frutose no contexto fisiológico humano que forneçam a base para a futura fase I /II estudos clínicos

.

Materiais e Métodos

declaração ética

cultivadas, hepatócitos primários humanos (PHH) são transformados a partir de amostras de fígado recém-tomadas obtidos em cirurgia hepática. Por conseguinte, PHH não constituem uma linha celular; PHH são células primárias. PHH de pacientes dadores diferentes foram fornecidos por T.S. Weiss com consentimento informado do doente em relação à colheita das amostras de acordo com as orientações do e aprovado pela caridade Tissue Cell Research Foundation, HTCR (para informação directa visite: https://www.htcr.de/english/supply.html)., E por A. Königsrainer e M. Schenk (Dpt do general, Visceral Cirurgia de Transplante , Hospital Universitário, Tuebingen, Alemanha) com o consentimento informado do paciente em relação à colheita das amostras aprovadas pelo Comitê de Ética local (Ethik-Kommission an der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Universitätsklinikum Tübingen /Comissão de Ética da Faculdade de Medicina da o Eberhard-Karls-University e da University Clinic Hospital Tuebingen). Os participantes não forneceu o seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo. O comitê de ética Tuebingen aprovou este processo de aprovação e o comité de ética Tuebingen não levantar objecções contra este estudo. resectates fígado e tumores de fígado humano foram obtidos com o consentimento informado do paciente a partir do Dpt. do general, Visceral Cirurgia de Transplante do Hospital Universitário, Tuebingen, Alemanha, de acordo com as orientações do Comitê de Ética local. Os participantes não forneceu o seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo (isto é, doação de peça cirúrgica do tumor Tuebingen e banco de tecidos normal). Este processo foi documentado pela assinatura do respectivo informações do paciente. O comitê de ética Tuebingen aprovou este processo de aprovação e o comité de ética Tuebingen não levantar objecções contra este estudo (Ethik-Kommission an der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Universitätsklinikum Tübingen /Comissão de Ética da Faculdade de Medicina da Eberhard- Karls-University e do Hospital Universitário Tuebingen). Nenhuma pesquisa foi realizada fora do nosso país de residência.

cultura celular

hepatócitos primários humanos foram cultivadas em DMEM suplementado com 100 U /ml de penicilina /estreptomicina (Serva, Heidelberg, Alemanha), 18,8 ug /ml de hidrocortisona (Merck, Darmstadt, Alemanha) e 1,68 mU /ml de insulina (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dinamarca). linhas de células de tumor foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de vitelo. Todas as células foram cultivadas numa incubadora humidificada com 37 ° C e 5% de CO

2. HepG2 foram obtidas a partir de ATCC, Hep3B e PLC /PRF /5 foram obtidas a partir de ECACC e Huh7 foram obtidos a partir de Riken Gene Bank. identidades de células foram testadas por tipagem de ADN (DSMZ, Braunschweig, Alemanha). Todas as células foram testadas para ser negativo para contaminação por micoplasma.

precisão de corte de tecido corte

O fatiamento de amostras de tecido iniciada dentro de uma hora de ressecção em um vibratome VT1200S (Leica, Wetzlar, Alemanha) em tampão gelado saturada de oxigénio de Krebs-Henseleit (KHB) contendo 25 mmol /l de glucose (Merck, Darmstadt, Alemanha), 25 mmol /l de NaHCO

3 e 10 mmol /L de HEPES (Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha) depois armazenamento em Custodiol® (Franz Köhler Chemie, Alsbach, Alemanha) [21]. As fatias foram incubadas em meio contendo oxigenado 25 mmol /l de glucose de William E e 50 ug /ml de gentamicina (Lonza Bioscience, Verviers, Bélgica), numa atmosfera oxigenada (80% de oxigénio, 5% de CO

2).

Substâncias

TNF alfa humano recombinante foi comprado de Innogenetics (Ghent, Bélgica). A frutose e ActinomycinD (ActD) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Alemanha).

O tratamento de células e tecidos humanos fatias

As células e os cortes foram pré-tratados com frutose a 50 mM durante 30 min e com 1 ug /ml ActD 15 min antes da administração de 100 ng /ml de TNF. ensaios de caspase foram realizadas após 8 horas, liberação LDH e citoqueratina ensaios de 18 de clivagem foram realizadas 24 horas após o tratamento TNF.

Os ensaios de citotoxicidade

A percentagem de lactato desidrogenase release (LDH) foi determinada utilizando o ensaio de Mono-P LDH (ANALYTICON, Lichtenfels, Alemanha), calculado como a razão sobrenadante /(+ sobrenadante de lisado). Em fatias de tecido, a quantidade de LDH libertada para ser sobrenadante foi determinada e normalizada para o conteúdo de proteína das fatias individuais. actividades de caspase foi determinada por incubação com 50 ^ M de substrato

N

-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-aminometilcumarina (Ac-DEVD-AMC; Biomol, Hamburgo, Alemanha) em tampão de ensaio (50 mM de HEPES , pH 7,4, 1% de sacarose, 0,1% de CHAPS, DTT 10 mM). A clivagem do substrato foi medida cineticamente por espectrofluorimetria. actividade de caspase foi determinada como a inclinação das regressões lineares resultantes e expressa em unidades de fluorescência arbitrárias por minuto. Citoqueratina 18 de clivagem foi determinado no sobrenadante de fatias de tecido utilizando o kit de ELISA CytoDeath M30 (Peviva, Bromma, Suécia) de acordo com as instruções do fabricante.

ATP determinação

teor de ATP foi medida usando o celular CellTiter-Glo Luminescent Viabilidade Assay (Promega, Mannheim, Alemanha).

Quantitative PCR em tempo real

alta qualidade RNA total (0,5 ug) foi transcrição reversa usando kit de transcrição reversa e aleatório hexâmeros (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. a expressão de ARNm foi medido utilizando TaqMan 7500 ou 7900HT de Applied Biosystems utilizando ensaios predeveloped específicos para aldolase B (Hs01554887_m1), hexoquinase II (Hs00606086_m1) e ketohexokinase (Hs00240827_m1) versus curvas padrão de vectores pCMV6-XL contendo cDNAs dos genes correspondentes (adquirido a partir de Origene, Rockville, EUA). 18S RNA (4.308.329, Applied Biosystems) foi utilizado para normalização.

Estatísticas

Os experimentos foram realizados de acordo com a disponibilidade de espécimes e reproduzida pelo menos 5 vezes. Todos os dados estão representados como a mudança de dobragem com o controlo, o qual é definido como 1. As barras de erro indicam a média ± SEM. As diferenças estatísticas foram determinadas por um teste t não emparelhado. Todas as estatísticas foram calculadas usando o programa GraphPad Prism 4.01 (GraphPad Software Inc.) e um valor de p . 0,05 foi considerado como sendo significativo

Resultados e Discussão

depleção transitória de ATP celular alcançado em hepatócitos humanos primários usando concentrações fisiológicas de frutose

Quando comparados com controlos não tratados, a concentração de ATP de PHH

foi encontrada a redução de uma forma dependente da concentração

após 30 min de incubação com frutose , exibem uma redução média de 30% do controlo a uma concentração de 50 mM (Figura 2A, ponto de dados mais à direita; compilação de seis dadores humanos). Cineticamente, ATP foi encontrado para ser esvaziado dentro de 5 min (Figura 2B) a uma mínima, média, de ~ 40% em comparação com controlos não tratados. Este esgotamento ATP foi reversíveis espontaneamente como visto pelo aumento do teor de ATP a 120 min e em seguida (Figura 2B, compilação de oito dadores humanos). Assim, as lojas de energia celular de hepatócitos passou por uma recuperação constante durante o próximo par de horas deixando uma janela de depleção transitória. É importante ressaltar que durante a depleção transitória mediada por frutose do ATP celular, não encontramos qualquer influência sobre a viabilidade hepatocítica como indicado pela ausência de qualquer aumento significativo na liberação de LDH antes e depois do início do tratamento frutose (Figura 2C, compilação de dados de quatro doadores humanos ). De nota, qualquer cultura de PHHs além do nosso tempo de observação de 1,440 min (isto é, 24 horas) foi mostrado para provocar um aumento significativo da libertação de LDH em sobrenadantes de cultura de células (os nossos resultados não publicados), o que indica uma percentagem profunda da PHHs desintegrados além o limiar de 24 horas. Portanto, “a longo prazo” resultados em matéria de viabilidade PHH além de 24 horas não são viáveis ​​neste contexto. Ao mesmo tempo, a caracterização adicional de base das culturas PHH também mostrou que o conteúdo de ATP destas células primárias diminuir lentamente já dentro das primeiras 24 horas de teste. Portanto, não é possível manter os mesmos níveis de ATP (100%; medidos no início /início destas experiências) ao longo de 24 horas de cultura PHH. No entanto, a recuperação documentada de até 60% do nível de ATP inicial sem qualquer libertação significativa de LDH indicam que o impacto de frutose sobre os níveis de ATP são altamente reversíveis e que os hepatócitos são capazes de lidar com esta diminuição transitória do ATP celular dentro de uma limitada intervalo de tempo de cultura (isto é, dentro do intervalo de tempo de 24 horas).

(a-C) PHH de dadores humanos foram tratadas com concentrações crescentes de frutose (a) ou tratadas com uma concentração fixa de 50 mM de frutose (B); teor de ATP foi determinada após 30 min (A) ou em diferentes pontos de tempo, tal como indicado (B); libertação de LDH de PHH após incubação com 50 mM de frutose foi determinada após os pontos de tempo indicados (C). Os dados são apresentados como média ± SEM.

Assim, a introdução de proteção hepática no sentido de TNF na perfusão hepática isolada (IHP) parece ser viável do ponto de vista clínico. Em um estudo de Cortez-Pinto

et

al

., Voluntários saudáveis, bem como pacientes com esteatohepatite não alcoólica (NASH) foram bolus-injetados com frutose. Subsequentemente, a depleção de ATP foi continuamente monitorizada por espectroscopia de RMN para até 60 minutos. Ambos voluntários saudáveis, bem como pacientes NASH foram encontrados para exibir uma rápida (em 12 minutos após a injecção de frutose) e diminuição transitória do ATP celular (restauração das reservas de ATP hepáticas sendo detectada aos 60 min após a injecção de frutose) [13]. Portanto, este trabalho de Cortez-Pinto

et

al

. irá ser útil no controlo, tanto o decurso de tempo e o grau de depleção de ATP na futura fase I /II de ensaios clínicos para ser realizada em pacientes que exibem os cancros primários e secundários do fígado.

Também outros grupos tais observado um rápido empobrecimento do efeito de ATP em 30 minutos quando uma dose de até 250 mg de frutose /kg de peso corporal foi aplicada em voluntários saudáveis. Consistente com nossos resultados experimentais, foram descritos sem efeitos prejudiciais sobre o fígado (por exemplo, no que respeita à elevação das transaminases) para tais procedimentos frutose-carregamento [13] – [17]

regulação positiva de hexoquinase II e revogar. metabolismo da frutose-hepática tipo em tecidos de tumor do fígado

recentemente foi demonstrado em linhas de células de tumores hepáticos que, durante o processo de transformação maligna uma profunda regulação positiva da hexoquinase II (HKII) ocorre o que poderia explicar

que o fisiológica fenômeno de aprisionamento ATP hepática é ignorada em células de tumor

[10]. Para examinar melhor esse mecanismo foi utilizado espécimes recém-ressecados de tecidos do fígado humano, isto é, células que não estão sujeitos a qualquer tipo de artefato potenciais associados com o processo de imortalização. Comparando-se os níveis de transcrição de HKII, AldoB, e KHK, o nível médio de HKII transcrição foi encontrado para ser um aumento de 7,6 vezes em tumores de fígado humano, em comparação com tecidos hepáticos humanos primários não-tumorais sendo normalizados para factor 1 (Tabela 1). Em contraste, AldoB e KHK foram encontrados para ser reduzida na maioria dos tecidos de tumor examinados e linhas de células de tumor (média dobrar alterações 1 em comparação com os tecidos do fígado humano primário não-tumorais sendo normalizados para factor 1) (Tabela 1). De acordo com a hipótese de Warburg sobre as alterações adquiridas no metabolismo durante a progressão de doenças malignas, também cancros do fígado humano pode acomodar a um ambiente caracterizado pela falta de nutrientes e oxigênio através de um equipamento metabólico alterado, em especial na sua não-oxidativo, ou seja, energia glicolítica metabolismo [18]. Portanto, a sobre-expressão de HKII e metabolismo da frutose assim alterado de cancros primários ou secundários do fígado pode servir como uma ferramenta para o estabelecimento de protecção hepática selectiva na terapia de tumores baseia-TNF por meio de uma administração de frutose adjuvante.

TNF-a citotoxicidade está desativado por depleção de ATP mediada por frutose em PHH

em seguida, consequências de depleção de ATP hepática foram avaliados no nível de citotoxicidade e ativação caspase em hepatócitos primários humanos. Tal como marcador substituto da integridade da membrana, as quantidades de libertação de LDH por exposição a 100 ng TNF /ml sozinho (100 ng /ml; -fruc representado como na figura 2A) ou a um pré-tratamento combinado de frutose (15 min; + fruc na Figura 2A ) /tratamento de TNF (50 mM de frutose; 100 ng /ml de TNF) foram determinados em amostras PHH derivadas de dador humano. Ao longo destas experiências, a sensibilização à morte celular induzida por TNF foi melhorada pela adição do inibidor da síntese de ARN actinomicina D (ActD; 1 ug /ml), que bloqueia a sobre-regulação de quaisquer genes de sobrevivência de protecção [19]. Por exame de PHH derivada a partir de amostras de fígado humano ressecados (Figura 3A), os níveis de libertação de LDH média induzida por TNF foram todos encontrados para ser atenuada marcadamente no decurso de frutose-carregamento. Em conformidade com esta constatação funcional, alterações morfológicas que são típicos para o modo de apoptose induzida por TNF da morte celular (por exemplo, a condensação nuclear arquétipo e vesiculação da membrana) também foram encontrados para ser substancialmente anulada pela frutose pré-tratamento (Figura 3B). Como exemplificado na PHH vários fenómenos apoptóticos, como (i) condensação de núcleos (Figura 3B, painel superior esquerdo; coloração Hoechst), bem como (ii) formação de bolhas de membranas de células de tumor (Figura 3B, painel inferior esquerdo; microscopia de contraste de fase) foram claramente detectados em resposta ao tratamento com TNF sozinho; No entanto, o pré-tratamento com frutose levou, por unanimidade, a revogação quase completa destes fenómenos induzidos por TNF (inferiores painéis à direita Figura 3B, superiores e). Em trabalhos anteriores, que já foi demonstrado que em hepatócitos activação mediada por TNF de NF-kappa B é anulada no decurso do nosso regime de emprego concomitante de ActD ou CPT, impondo uma inibição geral da transcrição hepática [20]. Desse modo, os hepatócitos submetidos a um tratamento combinatória com qualquer ActD /TNF ou CPT /TNF não têm qualquer possibilidade de expressar quantidades suficientes de proteínas anti-apoptóticos tais como cFLIP ou XIAP cuja expressão poderia ter sido desencadeada por induzida por TNF NF-kappa B sinalização mediada. Assim, os hepatócitos submetidos a depleção mediada por frutose de ATP na presença de uma das ActD /TNF ou CPT /TNF não são capazes de neutralizar a inibição da morte hepatocítica mediada pelo TNF, através da activação de vias efectoras pró-sobrevivência, tais como a activação de NF-kappa B sinalização [20].

Cultured PHH de seis dadores diferentes foram tratadas com 400 ng /ml ActD sozinho ou em combinação com 100 ng /mL de TNF e de frutose a 50 mM, como indicado. A citotoxicidade foi determinada após 24 horas por ensaio de libertação de LDH descritos mudança dobra como significativo para o controlo não tratado, sendo definido como um (*: p 0,05, teste t não emparelhado). (B) Imagens da PHH foram tomadas 12 horas após o tratamento e ilustrar a condensação de apoptose induzida por TNF de núcleos na dependência de frutose-loading (+/- fruc) (painel superior: coloração Hoechst) e formação de bolhas de membrana (painel inferior: microscopia de contraste de fase ). barra branca indica 10? M.

Revogação da morte celular induzida por TNF em condições que destroem ATP em tecidos hepáticos humanos

A fim de aproximar a nossa pergunta em um ambiente paciente-individual para além isolado , células cultivadas e linhas celulares, o

ex vivo

precisão de corte tecnologia fatia de tecido foi adaptado para a nossa situação experimental [21]. fatias de tecidos humanos fígado com um diâmetro de 0,8 cm e uma espessura de 200-300 uM consistindo de 10-15, as camadas de células que abrigam -10

6 células do fígado em média, foram preparados a partir de tumores de fígado recém-ressecado e correspondente não- tecido de fígado maligna, incubadas em placas de 24 poços (Figura 4B). Amostras de tecidos do fígado humano não-tumorais e tecidos tumorais humanas eram de origens diferentes (ver tabela na Figura 4A), incluindo carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma colorectal (CRC), carcinoma do pâncreas (PC), e colangiocarcinoma (CC). Como controle viabilidade, fatias de precisão de corte de tecido hepático humano (A; coluna da esquerda) e tecido de tumor humano (A; coluna da direita) foram infectados por padrão com um gene GFP marcador que codifica adenoviral vector (Adv-GFP, MOI 1), uma hora após o corte de tecidos para determinar a vitalidade das fatias de tecido cultivado em placas de 24 poços. apenas as células viáveis, exibindo grandes áreas sendo positivo para a expressão do gene fabricante de GFP em ambos os tecidos do fígado humanas primárias tumorais e não tumorais prever a possibilidade de infecção e subsequente expressão de genes marcadores codificadas por vírus (nota: fatias de tecido representam pedaços da camada de células de multi dos tecidos ressecados cirurgicamente (a uma espessura de corte escolhido de 200-300 mm calculamos cerca de 10-15 camadas de células), portanto, não é tecnicamente possível para trazer todas as partes das respectivas fatias em foco (Figura 4B))

Tipos de amostras de tecido utilizadas para gerar os dados na Figura 4: carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma colo-rectal (CRC), carcinoma pancreático (PC), e colangiocarcinoma (CC) (a). Como exemplos, fatias de precisão de corte de tecido hepático humano (B; coluna da esquerda) e de tecidos humanos de tumor (B; coluna da direita) foram infectados com um gene GFP marcador que codifica vector adenoviral (Adv-GFP, MOI 1) uma hora após o corte de tecidos para determinar a vitalidade das fatias de tecido cultivado em placas de 24 poços. Fotos foram tiradas 24 horas após a infecção para determinar a expressão GFP viral que só pode ser obtida em regiões vitais das amostras de tecido (filtro de 2,5 x /488 nm; barras brancas equiparar 1000 um)

Como substituto. marcadores para a toxicidade celular, (i) a quantidade de LDH libertada para o tecido por mg de proteína, (ii) uma determinação baseada em ELISA de citoqueratina 18-clivagem correlacionando-se com a actividade da caspase e, (iii) a actividade de clivagem de DEVD induzida por caspase por mg proteína de tecido foram avaliadas.

os resultados obtidos a partir de fatias de tecido demonstrou o carácter selectivo de protecção mediada por frutose em direção TNF também para fígado e tecidos tumorais do fígado primários derivados de doentes. Em fatias de tecido de fígado humano não-malignas primárias, o efeito de hepatotoxicidade induzida por TNF em (i), a libertação de LDH (Figura 5A), (ii) a citoqueratina 18-clivagem (Figura 5B), e (iii) clivagem de DEVD (Figura 5C) , respectivamente, foi marcadamente diminuída na presença de frutose em quase todas as amostras. Em contraste, em fatias de tecido de tumor de fígado humanas primárias, mediante um processo de pré-tratamento idêntico com frutose, na maioria das amostras de pacientes sem protecção contra a citotoxicidade do TNF foi visto, se não mesmo a sensibilização à morte celular induzida por TNF, como demonstrado pelos níveis de (i) libertação de LDH (Figura 5D), (ii) a citoqueratina 18-clivagem (Figura 5E), e (iii) clivagem de DEVD (Figura 5F), respectivamente. Os resultados obtidos a partir de tecido humano se encaixa bem em resultados obtidos através da utilização de isolados hepatócitos primários de murino

in vitro Comprar e um modelo murino de lesão hepática induzida por TNF

in vivo

por Latta

et

al

. [9]. O TNF exerce um profundo apoptose e dano hepático fígado quantificada por clivagem de DEVD, bem como pela libertação de LDH e ALT no plasma, respectivamente. No entanto, hepatotoxicidade induzida por TNF agudas e lesões no fígado em hepatócitos de murino isolados primários e em ratinhos, respectivamente, foi totalmente inibida por depleção de ATP com frutose a 50 mM [9].

fatias de tecido derivado de fígados humanos (A- C) ou do fígado tecidos de tumor (D-F), respectivamente, foram tratados com 1 ug /ml ActD em combinação com 100 ng /mL de TNF e 50 mM de frutose como indicado. A citotoxicidade foi determinada por ensaio de libertação de LDH (A /C) e citoqueratina 18-clivagem (B /D), depois de 24 horas e por clivagem de DEVD, depois de oito horas (C /M). Os dados são representados como significa dobrar alterações para o controle sem tratamento, sendo definido como 1 (*: p 0,05, teste t não emparelhado)

Por isso, nós aqui mostrar pela primeira vez

ex. vivo

, expulsando artefatos de cultura celular e epifenómenos roedor, que a administração adjuvante de frutose protege seletivamente tecidos do fígado humanas primárias

ex vivo

. Em contraste, tecidos de tumores humanos primários derivados de metástases hepáticas praticamente não são protegidos

ex vivo

. No entanto, em níveis individuais, em algumas amostras de tecidos tumorais do doente derivados, frutose-carregamento não conseguiu proteger os hepatócitos. Ele tem que ser mantido em mente que as condições patológicas endógenos e desordens do fígado podem alterar o metabolismo de frutose e sensibilidade a TNF. Além disso, os doadores de tecidos terem recebido terapia neo-adjuvante pode conduzir a alterações na resposta do tumor antes do início putativo de qualquer regime terapêutico à base de TNF

Em analogia, num conjunto de células tumorais hepáticas humanas -. HepG2 ; Hep3B; Huh7 e PCL /PRF /5- nem um efeito de empobrecimento de ATP foi induzida pelo pré-tratamento com frutose (Figura 6A), nem qualquer protecção mediada por frutose em direcção a apoptose induzida por TNF pode ser conseguida (Figura 6B). Apesar de a sensibilidade em relação a TNF determinada por meio de ensaio de libertação de LDH foi variável entre o tumor linhas de células HepG2 utilizada; HepB3; Huh7 e PLC /PRF 5, no mitigação da libertação de LDH na presença de frutose 50 mM foi cedido.

As linhas celulares de tumores hepáticos HepG2, Hep3B, HuH7 e PLC /PRF /5 foram tratados com concentrações crescentes de frutose (UMA). teor de ATP foi determinada após 30 min (A) ou em diferentes pontos de tempo, como indicado. Os dados são apresentados como média ± EPM (n = 15). As linhas de células de tumor hepático foram tratados com 1 ug /ml ActD em combinação com 100 ng /mL de TNF e de frutose a 50 mM, como indicado. A citotoxicidade foi determinada por ensaio de libertação de LDH após 24 horas (n = 15) (B). Os dados são representados como significa dobrar alterações para o controle sem tratamento, sendo definido como 1.

Comparando os níveis de transcrição de enzimas glicolíticas HKII, AldoB e KHK, o nível médio de HKII transcrição foi encontrada para ser aumentada em média, 34 vezes nas linhas celulares de tumor hepático humano HepG2, Hep3B, HuH7 e PLC /PRF /5 em comparação com os tecidos de fígado humano primário não-tumorais a ser normalizado para o factor 1. em contraste, as enzimas e AldoB KHK foram consideradas constante ou diminuída nas linhas de células de tumores examinadas (significar dobrar alterações 1 em comparação com os tecidos do fígado humano primário não-tumorais sendo normalizados para factor 1) tal como representado na tabela 1. o equipamento enzimático das células tumorais é altamente indicativo para o desvio HKII contornar o ATP afundar ativa em hepatócitos primários. Consequentemente, nenhuma depleção de ATP era evidente na presença de frutose de até 50 mm. É interessante de um ponto de vista mecanicista, em trabalhos anteriores que já foi demonstrado que os efeitos da frutose sobre a depleção de ATP e a morte de células tumorais induzida por TNF pode ser “artificialmente” revertida quando os hepatócitos de murino primários, sendo “naturalmente” deficiente para HKII como PHH, foram gene complementado com um vector que transporta o gene de murino HKII [10]. No estudo de Speicher

et

al

. verificou-se que a armadilha fisiológico frutose /ATP foi contornado (como em células de tumores do fígado); como resultado, o estado de proteção “, originalmente” alcançado em hepatócitos primários sob o carregamento de frutose agora estava perdido, a implementação de um grosseiramente maior sensibilidade /toxicidade dos hepatócitos primários em relação a apoptose induzida por TNF [10].

Conclusões

TNF constitui um fármaco altamente potente anti-neoplásico, que, no entanto, até agora não pode ser aplicada a doentes com tumores primários e secundários do fígado devido ao seu profundo hepatotoxicidade. Para ultrapassar este obstáculo, a utilização combinatória de frutose

que pode ser utilizada para explorar as diferenças metabólicas constituindo uma protecção selectiva dos hepatócitos saudáveis ​​em relação ao TNF

parece ser uma opção terapêutica interessante. Com base em nossos resultados, empregando hepatócitos primários unicamente humanos e fatias de corte de precisão de tecidos hepáticos humanos saudáveis ​​

contra

tecidos hepáticos humanos malignos, parece viável que a depleção induzida por frutose de ATP representa uma maneira geral de proteger o fígado humano da morte celular dependente de energia indesejada induzida por TNF na terapia do cancro local baseada-IHP no qual a sensibilidade de tumores hepáticos no sentido de terapias citotóxicas é mantida.

Reconhecimentos

os autores são gratos a Christine Geisler, Igor Liebermann, Andrea Schenk e Irina Smirnow para excelente assistência técnica.