Sumário
O realçador de duas proteínas (EZH2) Zeste tem sido relatado para estimular o crescimento celular em alguns cancros e, portanto, é considerado para representar um novo alvo interessante para a intervenção terapêutica. Aqui, nós investigamos um possível papel de EZH2 para o controlo do crescimento de células cancerígenas do cólon. RNA de interferência (RNAi) mediada por depleção EZH2 intracelular levou a paragem do ciclo celular de células de carcinoma do cólon, na transição G1 /S. Isto foi associado com uma redução do número de células após a transfecção transiente de sintético
EZH2
-targeting siRNAs e com a inibição da sua capacidade de formação de colónias após expressão estável de siRNAs transmitidas por vectores. Nós ainda testado se EZH2 pode reprimir a
p27
gene inibidor do crescimento, como relatado para o câncer de pâncreas. No entanto, a expressão análises de linhas celulares de cancro do cólon e biópsias de câncer de cólon não revelou uma correlação consistente entre EZH2 e os níveis de p27. Além disso, o esgotamento EZH2 não re-induzir
p27
expressão em células cancerígenas do cólon, o que indica que
p27
repressão EZH2 pode ser cell- ou específica de tecido. transcriptoma genoma inteiro analisa genes celulares identificados afetados pela depleção EZH2 em linhas celulares de cancro do cólon. Eles incluíram vários genes associados ao câncer relacionados com a proliferação celular ou invasão, tais como
DAG1
,
MageD1
,
sdc1
,
TIMP2
, e
Tob1
. Em conclusão, os nossos resultados demonstram que os blocos de depleção de EZH2 o crescimento de células cancerígenas do cólon. Estas descobertas podem proporcionar benefícios para o tratamento de câncer de cólon
Citation:. Fussbroich B, Wagener N, Macher-Goeppinger S, Benner A, Fälth M, Sültmann H, et al. (2011) EZH2 de depleção Bloqueia a proliferação de células de cancro do cólon. PLoS ONE 6 (7): e21651. doi: 10.1371 /journal.pone.0021651
editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 02 de fevereiro de 2011; Aceito: 4 de junho de 2011; Publicação: 13 de julho de 2011
Direitos de autor: © 2011 Fussbroich et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O Enhancer de Zeste homólogo 2 (EZH2) proteína é um componente central do Polycomb repressiva Complex2 (PRC2) e modifica a transcrição ao nível epigenético, afetando histonas e metilação de DNA [1]. EZH2 é abundante em várias malignidades, incluindo as principais cancros humanos, tais como câncer de próstata, câncer de mama, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, ou câncer cervical [2] – [6].
Há evidências experimentais de que
EZH2
pode contribuir diretamente para a carcinogênese, agindo como um
bona fide
oncogene. Especificamente, para determinadas entidades de cancro, tem sido relatado que EZH2 estimula a proliferação das células, bloqueia a apoptose, promove a invasão de células e metástase, activa a angiogénese tumoral, e induz tumores em modelos de ratinho [2] – [11]. Estes resultados sugerem que a inibição EZH2 pode representar uma nova estratégia atractiva para a terapia do cancro epigenética [1], [12].
Mais recentemente, no entanto, também há dados que sugerem que EZH2 poderia actuar como uma proteína supressora de tumor em certos tecidos [13]. inactivação homozigótica
EZH2
mutações foram detectadas em uma porção de malignidades mielóides [14], [15], levantando a possibilidade de que qualquer um EZH2 pode exercer actividades pro- ou anti-oncogénicas, de uma maneira tipo célula-dependente [ ,,,0],16]. Outro nível de complexidade é adicionado pela detecção de
EZH2
mutações heterozigóticas de uma porção de linfomas de origem germinal no centro da [13]. Neste caso, a proteína mutante parece aumentar o nível de metilação H3K27, um alvo a jusante crítica de EZH2, actuando em conjunto com a proteína de tipo selvagem expressa a partir do alelo mutado [17].
Cancro colorectal é a quarta forma de câncer mais comum em humanos. A cada ano, mais de 1.200.000 indivíduos irão desenvolver a doença e mais de 600.000 morrerão da doença [18]. Apesar da importância biomédica alta deste tumor, investigações sobre o status EZH2 e função em células cancerígenas do cólon são escassos e em parte contraditórias. Por exemplo, enquanto EZH2 foi consistentemente relataram a ser sobre-expresso em cancros do cólon, os níveis de expressão EZH2 correlacionou positivamente [19], de forma negativa [20], [21], ou não em todos [22], com a sobrevivência de pacientes com câncer de cólon. Além disso, a nosso conhecimento, somente um estudo funcional investigou o papel da EZH2 para o crescimento de células cancerígenas do cólon, mas não conseguiu ver um efeito sobre
EZH2
gene silenciamento [22]. Este resultado está em forte contraste com o papel de promoção do crescimento de EZH2 relatado por várias outras entidades câncer [2] – [6]. No presente trabalho, abordou esta questão através da análise de expressão de EZH2 em células de cancro do cólon
in vitro
e
in vivo
, e investigando a contribuição de EZH2 para o crescimento de linhas celulares de cancro colorectal .
resultados
a expressão de EZH2 em células cancerígenas do cólon
in vitro Comprar e RNA-interferência mediada
EZH2
repressão
a fim para investigar a expressão de EZH2 em células cancerígenas do cólon
in vitro
, analisamos um painel de doze cólon linhas celulares de cancro derivadas de tumores por immunoblotting e qRT-PCR. Todas as linhas celulares testadas expressaram quantidades facilmente detectáveis de proteína EZH2 (Figura 1A) e
EZH2
ARNm (Figura 1B). Por subsequente interferência de RNA (RNAi) analisa, geramos três siRNAs sintéticos destinados a diferentes regiões do
EZH2
transcrição. Todos os três siRNAs bloqueou eficientemente a expressão EZH2 (Figura 1C). Desde potenciais efeitos fora do alvo de siRNAs individuais podem ser reduzidos pelo siRNA pooling [23], [24], que também testou um conjunto constituído por todos os três
EZH2
-targeting siRNAs. Esta piscina siRNA também bloqueou eficientemente expressão EZH2 (Figura 1C) e foi usado para análises funcionais adicionais.
A análise de imunotransferência da expressão da proteína EZH2. A tubulina, o carregamento de controlo. analisa B qRT-PCR de
EZH2
expressão de mRNA. Os dados são apresentados como diferenças vezes na expressão do gene, normalizados para um índice de gene de manutenção. Os desvios padrão de duas repetições de transcrição reversa são indicados. C modulação da expressão da proteína EZH2 por RNAi. EZH2 expressão foi determinado por análise de imunotransf erência de 48 horas após a transfecção com
EZH2
-targeting ARNsi de controlo ou ARNsi, como indicado. siEZH2pool: pool
EZH2
-targeting siRNAs. Tubulina, carregar controle.
EZH2
resultados repressão na prisão G1 e inibição do crescimento de células de câncer de cólon
Em seguida, testamos o efeito do RNAi mediada
EZH2
repressão sobre o crescimento de células de câncer colorretal HCT116, LoVo e DLD1. siRNA-tratamento resultou numa forte redução dos níveis de EZH2 em todas as linhas celulares do carcinoma do cólon e testados, como descrito anteriormente para outras células [7], em uma diminuição concomitante de expressão da ciclina D1 (Figura 2A).
A análises de imunotransferência de células HCT116, DLD1 e LoVo regulação baixa expressão eficiente de EZH2 por RNAi. níveis de ciclina D1 são indicados. A tubulina, o carregamento de controlo. ciclo celular B análises por FACS. As células foram tratadas com dois siRNAs controle ou com
EZH2
-targeting siRNAs. As percentagens de células em G1, S ou G2 /M fases do ciclo celular são indicados. C Compilação de análises do ciclo celular de três experiências independentes. Os desvios padrão são indicados. Asteriscos igual p≤0.05, dois asteriscos igual p≤0.01, n.s. não significativa. analisa
ciclo celular por células activadas por fluorescência (FACS) foram realizados em paralelo. Eles revelaram um aumento estatisticamente significativo nas populações G1 e uma diminuição concomitante nas populações em fase S, mediante
EZH2
repressão. As curvas de FACS típicos são mostrados na Figura 2B, uma compilação dos resultados de três experiências independentes está representado na Figura 2C. Estes resultados indicam que
EZH2
repressão induz a paragem do ciclo celular na G1 /S limite e, portanto, pode agir antiproliferativa nas células do câncer de cólon.
Para aprofundar esta questão, contagem de células análises de cancro do cólon As linhas celulares foram realizados. mediada por ARNi de inibição
EZH2
expressão conduziu a uma redução significativa do número de células, que era claramente visível de 48-72 horas após a transfecção de siRNAs sintéticos (Figura 3A), o que indica que
EZH2
silenciamento resulta na inibição do crescimento de células de câncer de cólon.
a contagem de células após a transfecção transitória com controle sintética siRNA (sicontr-1) ou
EZH2
-targeting siRNAs (piscina siEZH2). Os gráficos representam os números de células relativos, nos pontos de tempo indicados após a transfecção siRNA. o número de células em transfecção (ponto de tempo 0) foram definidos como 1.0. As experiências foram realizadas em triplicado, desvios padrão, estão indicados. Asteriscos igual p≤0.05, n.s. não significativa. B Colony ensaios de formação. HCT116, LoVo, as células DLD1 e RKO foram estavelmente transfectadas com plasmídeos que expressam dois shRNAs diferentes contra
EZH2
(pCEP-shEZH2-1, pCEP-shEZH2-2) ou duas shRNAs controle (pCEP-shluc ou pCEP- shcontr-1). Experimentos foram independentemente repetido pelo menos três vezes, com resultados consistentes.
Para validar o efeito antiproliferativo do
EZH2
inibição em células cancerígenas do cólon por um método independente, realizamos ensaios de formação de colónias. Dois diferentes
EZH2
siRNAs -targeting foram estavelmente expressos a partir de vectores de expressão de selecção em HCT116, células LoVo, DLD1 e RKO, para 13 a 15 dias. Ambos
EZH2
siRNAs -targeting levou a uma redução clara da capacidade de formação de colónias de todas as linhas celulares de cancro do cólon testados contra células tratadas com siRNA de controle (Figura 3B). Aspectos morfológicos, perfis de FACS, e desoxinucleotidilo terminal transferase dUTP nick rotulagem final (TUNEL) analisa não forneceu evidências para o aumento da apoptose de células cancerígenas do cólon sobre RNAi mediada por
repressão EZH2
(dados não mostrados).
Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a depleção de EZH2 induz a paragem do ciclo celular na fase G1 e inibe o crescimento de células cancerígenas do cólon.
tissue micro matriz de análise de expressão EZH2 em adenomas do cólon e cancros
estudos anteriores demonstraram que EZH2 é significativamente sobre-expresso em cancros do cólon quando comparado com o tecido normal do cólon [19] – [22]. No entanto, os dados comparando expressão EZH2 em adenomas do cólon benignos contra o cancro do cólon é, a nosso conhecimento, ainda não estão disponíveis. Por isso, realizamos análises de imuno-histoquímica utilizando um tissue microarray abrangendo 24 adenomas, 25 carcinomas G1, 24 carcinomas G2 e 24 carcinomas G3. Em comparação com os adenomas do cólon, a expressão EZH2 foi significativamente aumentada nos carcinomas do cólon (Figs. 4A e 4B). As análises dos cancros do cólon que representam diferentes graus de desdiferenciação histológico (aumentando de G1-G3) revelou uma tendência para um novo aumento de expressão EZH2 para cânceres menos diferenciados, que, no entanto, não foi estatisticamente significativa (Figura 4B).
analisa A imuno-histoquímica de adenomas do cólon e biópsias de câncer de cólon que representam graus crescentes de desdiferenciação histológico (G1-G3). Setas pretas: carcinoma; setas brancas: tecido conjuntivo. As barras de escala, 50