Abstract

Fundo

O fator PAX6 transcrição é expresso principalmente em embriões . PAX6 também é expressa em vários tumores e desempenha um papel oncogénica. No entanto, pouco se sabe sobre o papel do PAX6 no câncer de pulmão.

Métodos

A função do PAX6 em células de câncer de pulmão foi avaliada pela pequena depleção mediada por RNA de interferência da proteína seguido por análises da proliferação de células, crescimento independente de ancoragem, e a paragem do ciclo celular. As alterações de ciclina D1, pRB, ERK1 /2, a expressão de p38 causada pela inibição PAX6 foram detectados utilizando western-blotting. O nível de mRNA PAX6 em 52 pares de tumores e tecidos normais adjacentes correspondentes em doentes com cancro do pulmão de células não-pequenas e linhas celulares de cancro do pulmão correspondente foi detectado por PCR em tempo real.

Resultados

Supressão de PAX6 expressão inibiu o crescimento celular e formação de colónias em A549 e as células H1299. A percentagem de células em fase G1-expressão aumentada quando PAX6 foi inibida. O nível de proteína ciclina D1, bem como o nível de fosforilação de pRb, diminuída como resultado de PAX6 a sub-regulação. A actividade de ERK1 /2 e p38 também foi suprimida em células PAX6 knock-down. O mRNA PAX6 foi altamente expressa em tecido de cancro do pulmão e linhas celulares de cancro do pulmão. Na maioria dos pacientes (cerca de 65%), a proporção relativa de mRNA PAX6 em NSCLC primária contra tecidos adjacentes excedeu 100.

Conclusões

Nossos dados implicado que PAX6 acelera a progressão do ciclo celular através da activação do sinal MAPK via. níveis de mRNA PAX6 foram significativamente elevados em tecidos de câncer de pulmão primário em comparação com seus tecidos adjacentes combinados

Citation:. Zhao X, Yue W, Zhang L, Ma L, Jia W, Qian Z, et al. (2014) regulação negativa do PAX6 por shRNA inibe a proliferação e progressão do ciclo celular de linhagens de células humanas não-pequenas células do cancro do pulmão. PLoS ONE 9 (1): e85738. doi: 10.1371 /journal.pone.0085738

Autor: Christina Lynn Addison, Instituto de Pesquisa Hospital Ottawa, Canadá |

Recebido: 16 de julho de 2013; Aceito: 01 de dezembro de 2013; Publicação: 15 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela subvenção Beijing Programa Novel (No. 2006B34); Fundação Beijing de Investigação para excelentes talentos (No. 20061D03); Projeto Cultivo Pequim para Key Técnico e Medicina Produto (No. Z101100055610030); o Programa de Investigação Científica Comum de Beijing Comissão Municipal de Educação (No. KM201210025024). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Uma visão geral recente sobre estatísticas de câncer globais mostraram que o câncer de pulmão foi o mais comumente diagnosticado cancro, bem como a principal causa de morte por câncer [1]. A detecção precoce e terapia-alvo é um método potencial para a prevenção e terapia [2] câncer de pulmão. É importante descobrir quais vias ou proteínas são activas na progressão do tumor de pulmão [3]. Na base do “hipótese de células estaminais do cancro,” tumores são pensados ​​para originar através da expressão em células estaminais específico de tecido [4] – [6]; Em outras palavras, os tumores são atribuídos a factor de células estaminais sobre-expressão [3], [5], [7]. Emparelhado-box 6 (Pax6) é um fator de transcrição importante durante a embriogênese e um fator de células-tronco [3]. Assim, PAX6 pode desempenhar um importante papel na tumorigénese.

PAX6 pertence à família de genes PAX, que codifica um grupo de nove factores de transcrio de caixa emparelhada com papéis importantes no desenvolvimento da doença e [3]. PAX6 é um factor de transcrição importante no desenvolvimento dos olhos, do pâncreas, do sistema nervoso central e [3], [8]. expressão PAX6 foi recentemente encontrado em tumores, sugerindo um papel oncogênico [9]. PAX6 é frequentemente expressa em retinoblastoma, tumores pancreáticos, e tumores intestinais [6], [10], [11]. PAX6 também é altamente expresso em linhas celulares de cancro da mama e do cérebro [9]. Em linhas celulares de carcinoma pancreático, a inibição da expressão PAX6 leva a uma diminuição no crescimento celular e sobrevivência [12]. PAX6 é também um regulador da expressão do receptor MET de tirosina quinase, em linhas celulares de carcinoma pancreático [12]. MET é um potencial biomarcador e alvo terapêutico para tumores, o que confirma o papel oncogênico dos PAX6 na tumorigênese [13].

Foi relatado anteriormente que PAX8 e PAX5 são altamente expressos no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC ) e linhas celulares de cancro do pulmão de células pequenas, respectivamente [14]; mas pouco se sabe sobre a expressão PAX6 e função no câncer de pulmão. Neste estudo, investigou-se a proliferação celular PAX6 regulada de NSCLC. Nossos resultados mostram que PAX6 promove a progressão G1-S pela ativação da via de sinal MAPK. mRNA PAX6 foi frequentemente expresso em tecido de câncer de pulmão em comparação com correspondente tecido não neoplásico adjacente. Isto sugere que PAX6 é um novo alvo potencial no cancro do pulmão.

Materiais e Métodos

RPMI 1640, soro fetal de bovino (FBS), e Reagente Trizol foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA) ; M-MLV de transcrição reversa, ensaio de proliferação celular CellTiter 96® aquosa não-radioactivos, oligo-dT, e dNTP foram obtidos a partir de Promega (Madison, WI); SYBR® verde PCR Mistura Mestre era de Applied Biosystems (Carlsbad, CA); anticorpos anti-Pax6 foram adquiridos a Abnova (Taibei, Taiwan), anti-PRB, -ERK1 /2, p38, -pERK, -pp38, -cyclin D1, e -pRB (S780) de fosforilação de anticorpos foram obtidos a partir de Abcam (Cambridge, Inglaterra, Reino Unido); e quimioluminescência aumentada (ECL) de reagente foi obtido de Pierce (Rockford, IL). iodeto de propídio (PI), RNase A, e cocktail de inibidores de protease foram adquiridos de Sigma (St. Louis, MO).

Amostras

Cinquenta e dois espécimes NSCLC foram obtidos a partir de pacientes submetidos a ressecção cirúrgica em Beijing Chest Hospital. foram utilizadas amostras de câncer de pulmão primário e combinados, tecidos normais adjacentes.

O estudo e uso de amostras foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisa em Pequim Chest Hospital, Capital Medical University (Beijing, China). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. As características clínicas dos pacientes estão listadas na Tabela 1.

cultura celular

Pulmão humano adenocarcinoma linhas de células A549 e NCI-H1299, linhas de grandes células humanas de carcinoma do pulmão de células NCI-H460 , linha de células de câncer de pulmão de pequenas células NCI-H446, fibroblastos de pulmão de embrião humano (MRC-5) foram obtidas a partir da Plataforma Nacional de Recursos Experimental celular Sci-tech. linhas celulares de carcinoma humano do pulmão de células grandes, 95C, 95D e 801D foram obtidas do centro de tumor da Academia Chinesa de Ciências Médicas. linha de células de adenocarcinoma de pulmão humano A2 e linha de células de carcinoma de células escamosas L foram isolados e estabelecida por nosso laboratório. As linhas celulares de cancro de pulmão foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Gibco, Los Angeles, CA, EUA). MRC-5 foram mantidas em MEM-EBSS suplementado com FBS a 10%.

Construção de um vector lentiviral PAX6 shRNA e infecção em células

Quatro interferência de RNA (RNAi) sequências alvo candidatos foram concebidos com base

na sequência de mRNA e clonados no vector pGCSIL-GFP (GeneChem, Xangai, China) humana

PAX6. A sequência de RNAi GAGTAGCGACTCCAGAAGT foi o mais eficaz na supressão mRNA PAX6 em H1299 e células A549, e foi utilizado em experiências subsequentes para derrubar PAX6 endógeno. Nonsilencing (NS) -Pequena ARN interferente (shRNA) (TTCTCCGAACGTGTCACGT) também foi clonada no vector de pGCSIL-GFP e utilizado como um controlo (GeneChem). O vírus recombinante foi empacotado em células 293T utilizando um Sistema de Expressão Lentivector (GeneChem).

Para a infecção celular, as células H1299 e A549 foram subcultivadas a 5000 células /poço em placas de cultura de 96 alvéolos e infectadas com lentivírus mediada PAX6-shRNA ou NS-shRNA. O nível de expressão de GFP foi detectado através de microscopia de fluorescência (Nikon, Tokyo, Japão) para determinar a eficiência de infecção.

isolamento de RNA e PCR em tempo real

O ARN total a partir de tecido e células foi isolado com Reagente Trizol de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração de ARN total foi calculado medindo a OD

260 e as amostras foram armazenadas a -80 ° C.

O ARN total (2 ug) foi sujeitos a transcrição reversa usando um Kit de M-MLV de acordo com Transcriptase Reversa com o protocolo do fabricante. O ADNc (20 ng) foi misturada com SYBR® verde Master Mix, e os genes foram amplificados com iniciadores adequados, utilizando um sistema de detecção por PCR em tempo real (ABI7500; Life Technologies, Carlsbad, CA). Os níveis de expressão relativa de ARNm PAX6 foram calculadas por normalização ao nível do mRNA β-actina. Os iniciadores de PCR utilizados foram como se segue: PAX6 para a frente, 5′-TTCAGCACCAGTGTCTACCA-3 ‘; PAX6 reverso, 5’-GCTGTAGGTGTTTGTGAGGG-3 ‘; β-actina para a frente, 5’-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3 ‘; e β-actina reverso, 5’-GCTGTCACCTTCACCGTTC -. 3 ‘

proliferação celular ensaio

Um ensaio de proliferação foi efectuado usando células não-radioactiva Ensaio de Proliferação de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 5000 células /poço foram semeadas em placas de cultura de 96 poços em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS. As células foram cultivadas durante 5 dias, em seguida, 3- (tiazol-2-il-4,5-dimetil) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS) foi adicionado 20 uL de a cada poço e as células foram incubadas a 37 ° C durante 3 h, a cada 24 h. A absorvância foi registada a 490 nm com um leitor de microplacas universal (Bio-Rad, Hercules, CA). Todas as experiências foram repetidas três vezes. Os dados são apresentados como médias ± SEM.

Colónia ensaio de formação de

As células foram semeadas em triplicado a 300 células /poço numa placa de 6 poços. Após 7 dias de cultura, as células foram lavadas duas vezes com NaCl (0,9%), coradas com violeta de genciana 2% durante 20 min, lavou-se com água, e seco ao ar. Focos foram contadas por microscopia. Os experimentos foram repetidos três vezes e os dados são apresentados como médias ± SEM.

Soft-agar ensaio

As células (1.000) foram semeadas em placas de 6 poços em 2 ml de meio de crescimento contendo 0,3 % de agar e utilizado para sobrepor 1,4 mL camadas de meio de crescimento contendo 0,6% de agar. Após 21 dias de cultura, as colónias foram contadas. Todas as experiências foram repetidas três vezes. Os dados são apresentados como médias ± SEM.

análise do ciclo celular

As células foram colhidas, lavadas duas vezes com PBS frio e fixadas em etanol a 70% a -20 ° C durante a noite. As células foram, então, centrifugadas (1500 rpm, 10 min) e lavou-se duas vezes, utilizando solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em seguida, as células foram ressuspensas em 0,5 ml de PBS contendo 50 ug /ml de RNase A durante 1 h a 37 ° C. As células foram, em seguida, carregado com 65 ug /mL de PI durante 30 min no escuro a 4 ° C. A percentagem de células em diferentes fases do ciclo celular foi medido por citometria de fluxo (Pequim Determinação do Instituto de Pesquisa de Medicina Tradicional Chinesa). As experiências foram repetidas três vezes. Os dados são apresentados como médias ± SEM.

Western blot

As células foram digeridas com tripsina e centrifugado. O sedimento celular foi lavado duas vezes com PBS. Em seguida, as células foram rompidas em tampão de lise (Tris-HCl a 10, pH 7,4, EDTA 1 mM, 0,1% de Triton X-100, 0,1% de SDS e um cocktail × inibidor de proteases) em gelo durante 15 min e centrifugada a 12000 rpm durante 20 min. O material insolúvel foi removido e as concentrações de proteína foram determinadas usando um kit de ácido bicinconínico. Para a análise de transferência de Western, os lisados ​​celulares (30 ug /poço) foram sujeitos a SDS-PAGE e transferidos para membranas de filtro de nitrocelulose. As membranas foram incubadas com anticorpos primários (anti-PAX6, -ERK1 /2, p38, -pERK, -pp38, -cyclin D1, -RB, ou -RB S780 fosforilação) durante a noite a 4 ° C. anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano foram usadas posteriormente. Os sinais foram detectadas utilizando ECL e expostos a uma película Kodak X-OMAT. Os resultados foram escaneados e analisados ​​utilizando Alpha Ver Analysis Tools.

A análise estatística

Todos os valores são expressos como a média ± SEM. Através tempo real RT-PCR, ensaio MTS, a formação de colónias, ensaios de agar macio, análise do ciclo celular e ensaio Western-blot, para comparação entre as médias de 2 grupos, diferenças estatísticas foram testadas com Student não pareado

t

-Testes. A significância estatística foi testada usando SPSS Statistics, versão 13.0. P 0,05 (*) foi considerado diferente; P 0,01 (**) foi considerada significativamente diferente

Resultados

expressão de ARNm PAX6 foi inibida em células infectadas com o vector lentiviral PAX6 shRNA

PAX6 expressão de ARNm foi determinada. neste estudo. Como mostrado na Figura 1A, PAX6 foi altamente expressa na maioria das linhas celulares de cancro de pulmão. Em contraste, células MRC-5, uma linha celular de fibroblastos de pulmão fetal humano normal, não expressaram PAX6 (Figura 1A).

A, em tempo real A análise de PCR para o nível de expressão de mRNA em PAX6 H460, A2, 95C , 95D, H1299, H446, A549, 801 D, e linhas de cancro de pulmão L, bem como na linha de feto humano normal de fibroblastos de pulmão de células MRC-5. B, -C, Confirmação de ARNm PAX6 knockdown por em tempo real Os ensaios de RT-PCR efectuada em ARN total isolado a partir de A549 (B) e H1299 (C) de células infectadas com PAX6-shRNA, ou um shRNA aleatória. Os níveis de expressão de mRNA em PAX6 A549 e células H1299 foram medidos por quantitativo em tempo real de RT-PCR. O eixo y representa o ARNm normalizada PAX6 expressão relativa para células H1299 (C) A549 (B) ou. ** P 0,01. D, os níveis de proteína de PAX6 foram determinados por Western-blot e nível de expressão de GAPDH foi usada como um controlo. A quantificação foi feita por determinação do nível de cinza de proteína PAX6, que foi normalizado em relação aos níveis de GAPDH. Os dados são expressos como média ± SEM de experiências independentes (tempos das experiências estão listadas acima dos histogramas). expressão PAX6 foi obviamente enfraquecido em células KD A549 PAX6 e H1299 PAX6 KD.

Para elucidar se a expressão PAX6 tem qualquer efeito sobre o crescimento de células de câncer de pulmão, RNAi foi usado para gerar PAX6 knock-down ( PAX6 KD) linhas celulares. Foram selecionados linhas celulares de dois-alvo: H1299, que mostraram níveis elevados de expressão PAX6 e A549, que mostrou baixos níveis de expressão. No presente estudo, pGCSIL-PAX6 shRNA-GFP foi infectado em células H1299 e A549. As células também foram infectadas com pGCSIL-NS shRNA-GFP (PAX6 NS) como um controlo negativo (CN). Para determinar a função do PAX6, H1299, H1299NC, A549 ou células A549NC foram utilizados como controle em todos os ensaios.

O nível de mRNA PAX6 em H1299 PAX6 KD e células KD A549 PAX6 foi determinada por PCR em tempo real para confirmar se a expressão PAX6 foi especificamente inibida através de RNAi em A549 e as células H1299. Como mostrado na Figura 1B, a expressão em células PAX6 KD Pax6 A549 foi inibida por 80-90% em comparação com células infectadas com lentivírus mediada por NS-shRNA. Encontramos resultados similares em células H1299 PAX6 KD. a expressão de ARNm PAX6 nestas células foi também inibida em 90-95%, em comparação com células NC (*

* P

0,01; Figura 1C).

PAX6 expressão da proteína nestas células era detectado por Western blotting. Tal como mostrado na Figura 1D, a proteína PAX6 em H1299 PAX6 KD KD e células A549 Pax6 não foi detectado prontamente, enquanto que uma banda de proteína PAX6 clara foi evidente nas culas de controlo.

A inibição da expressão PAX6 conduz a um declínio na proliferação celular

PAX6 é um factor de transcrição essencial que desempenha um papel importante na regulação da proliferação e diferenciação durante o desenvolvimento embrionário humano [3]. Um ensaio de proliferação celular foi realizado para determinar se PAX6 desempenha um papel no crescimento celular. A549 PAX6 KD, H1299 PAX6 KD, e de controle as células foram semeadas em placas de 96 poços e actividade de proliferação celular foi medida utilizando um kit de ensaio de proliferação celular. A549 e crescimento celular H1299 foi suprimida quando, obviamente expressão PAX6 foi inibida por RNAi (Figura 2A e B). Como mostrado na Figura 2A e B, a diminuição no crescimento celular causada pela inibição da expressão PAX6 em H1299 foi muito mais forte do que em células A549. Estes resultados diferentes podem ser atribuídos aos diferentes níveis de expressão PAX6 entre as células H1299 e A549 apresentadas na Figura 1A e D.

, -B, KD A549 PAX6, células H1299 PAX6 KD e células de controlo A foram semeadas em placas de 96 cavidades e um ensaio MTS foi realizado. A absorvância a 490 nm (eixo y) foi medido a intervalos de 24 horas, até 120 h. C, D, Colony eficiência formação em KD A549 PAX6, as células H1299 PAX6 KD, e as células controle. O eixo y representa a taxa de formação de colónias normalizada em relação a A549 (C) ou células H1299 (D). E, -F, um ensaio -agar mole foi realizado para investigar os efeitos de PAX6 na tumorigénese in vitro. O eixo y representa o normalizado macio -agar taxa de formação de colónias em relação ao A549 (E) ou células H1299 (F). Os dados são expressos como a média ± SEM de três experiências separadas. Tempos dos experimentos são listadas acima do gráfico * P . 0,05, ** P . 0,01

Redução de formação de colónias e formação de colônias soft-agar em células PAX6 KD

a formação de colónias representa uma perda de inibição de contacto, ou a capacidade de manter o crescimento de células e movimento, apesar de contacto com as células vizinhas. Para esclarecer se PAX6 poderia conferir uma perda de inibição de contacto, as células infectadas com pGCSIL-PAX6 shRNA-GFP, bem como as suas células de controlo foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas durante 7 dias. Após coloração com genciana violeta a 2%, as colónias contendo mais do que 50 células foram contadas sob um microscópio de luz. Como apresentado na Figura 2C e D, a inibição da expressão PAX6 em células A549 e H1299 levaram a uma redução óbvia do número de focos gerado em comparação com as células de controlo (*

* P

0,01).

para estudar ainda mais a função de PAX6, a formação de colónias soft-agar foi analisado para determinar se PAX6 contribuiu para a formação de colónias independente de ancoragem em células de câncer de pulmão. A taxa de formação de colónia soft-agar diminuiu em KD A549 PAX6 e as células H1299 PAX6 KD comparação com células NC (*

* P Art 0,01,

* P Art 0,05; Figura 2E e F).

expressão PAX6 aumento do crescimento de células, promovendo a progressão mais rápida na fase S do ciclo celular

Para detectar o efeito de PAX6 na progressão do ciclo celular, a progressão do ciclo celular de A549 PAX6 KD, H1299 PAX6 KD, A549 PAX6 NC, H1299 PAX6 NC, A549, H1299 e as células foram analisadas por citometria de fluxo. Como apresentado na Figura 3A, a percentagem de células que entram na fase S foi diminuída na linha celular A549 PAX6 KD juntamente com um aumento na população de células em fase G0-G1. Resultado semelhante foi observado em H1299 PAX6 KD, H1299 PAX6 NC, e as células H1299 (Figura 3B). Nestas experiências, a expressão PAX6 levou a um crescimento celular através da indução de progressão do ciclo celular.

A, B, análise do ciclo celular. As células foram coradas com iodeto de propídio (PI) e analisados ​​para a distribuição de fases do ciclo celular. O histograma foram os dados estatísticos dos três repetições experimentais independentes. * P 0,05, ** P . 0,01

Neste estudo, o nível de ciclina D1, uma ciclina relevante que regulamente a progressão G1-S [15] expressão, [16], foi detectados em A549 células PAX6 KD e H1299 PAX6 KD. Tal como indicado na Figura 4A, a expressão da ciclina D1 foi diminuída em linhas de células A549 PAX6 KD em comparação com células de controlo. Encontramos um resultado semelhante no H1299 PAX6 KD células (Figura 4A). Outra ciclina relevante regulação progressão G1 /S é a ciclina E [17]. Nós também determinar se a ciclina E foi regulamentada pela expressão PAX6. Como um resultado, a expressão da ciclina E não foi afectada pela estável knockdown shRNA-mediada de PAX6 em células de cancro de pulmão (dados não mostrados). Isto demonstra que PAX6 pode promover o crescimento celular através da indução da expressão da ciclina D1.

A, B, A expressão de ciclina D1, pRB e a pRb fosforilada em A549 KD PAX6, NC A549, células A549, bem como H1299 PAX6KD , H1299NC, H1299 células foi determinada por Western blotting. β-actina nível de expressão de GAPDH e foi medido como controlo de carregamento internos, respectivamente. níveis de ciclina D1 e pRB foram medidos pelo nível de cinza e foram normalizadas por controles de carregamento internos. Os dados são expressos como média ± SEM. Tempos das experiências estão listados acima dos histogramas. * P 0,05, ** P . 0,01

O principal substrato de ciclina D1-CDK4 /6 complexos é a proteína do retinoblastoma (PRB) [18]. Assim, a fosforilação da proteína pRB S780 também foi detectado por Western blotting (Figura 4B). A fosforilação de pRb S780 foi diminuída quando a expressão PAX6 foi inibida em células A549. Um resultado similar foi obtido quando as células H1299 PAX6 KD foram usadas (Figura 4B).

via de sinalização MAPK foi suprimida pela inibição da PAX6

O MAPK (mitogen proteína quinase ativada) via tem sido implicado na regulação do G1 transições /S e mitose celular [19]. No nosso estudo, algumas moléculas reguladoras central da via de MAPK foram examinadas utilizando análise de Western blot. Como mostrado na Figura 5, os níveis de fosforilação de ERK1 /2 e p38 foram diminuídos tanto em KD PAX6 A549 e células H1299 PAX6 kD. Ele indicou que o sinal MAPK foi enfraquecida resultou da interferência RNAi de PAX6.

análise de Western-blot de A549, A549 NC, KD A549 PAX6, H1299, H1299NC, H1299 PAX6 KD com anticorpos contra ERK1 /2 ( a), p38 (B) e as suas formas fosforiladas foram mostradas na figura. GAPDH e β-actina foi utilizado como controlo de carregamento internos, respectivamente. níveis de ERK1 /2 e p38 foram normalizados por GAPDH e β-actina, respectivamente. Os dados são expressos como média ± SEM. Todas as experiências foram repetidas três vezes. * P 0,05, ** P . 0,01

PAX6 foi altamente expresso no tecido do cancro do pulmão

Pax6 mRNA no tecido do cancro do pulmão, bem como combinado tecido adjacente, foi detectado para confirmar o papel do PAX6 no câncer de pulmão. As características clínicas dos 52 pacientes estão listados na Tabela 1. Tal como mostrado na Figura 6A, o mRNA PAX6 foi abundantemente expressa no tecido tumoral quando comparado com tecidos normais adjacentes. A expressão de PAX6 representada por uma proporção tecido de cancro-a-lado não tumoral para cada indivíduo foi indicada na Figura 5B. expressão PAX6 no tecido de câncer de pulmão foi maior do que em cada tecido normal adjacente combinado em todos, mas três casos (Figura 6B). Os resultados estatísticos foram listados no Quadro 2 e a relação de (tumor /tecido adjacente) de 65% dos pacientes (34 amostras) excedeu 100. Isto quer dizer que, na maioria dos casos, PAX6 foi expressa principalmente em tecidos de cancro do pulmão.

a, em tempo real a análise de PCR de nível PAX6 expressão em tecidos de cancro do pulmão, bem como os tecidos adjacentes correspondentes, a partir de 52 pacientes. O nível de mRNA PAX6 foi normalizada por nível de expressão β-actina. B, Cada coluna representa a relação relativa de mRNA PAX6 em NSCLC primária contra tecido pulmonar adjacente, e a linha através do gráfico representa o valor 1 e 10, respectivamente. Todas as experiências foram repetidas três vezes. ** P . 0,01

Discussão

Em nosso estudo, a função do PAX6 em células de câncer de pulmão foi investigada. A capacidade de crescimento da A549 e as células H1299 foi recusado quando a expressão PAX6 foi inibida por PAX6 específica shRNA. Sugerimos que PAX6 promove a progressão G1-S pela ativação da via de sinal MAPK. E PAX6 foi altamente expressa em tecidos de câncer de pulmão e linhas celulares de cancro do pulmão.

O PAX6 fator de transcrição desempenha papéis diferentes em diferentes tumores. É frequentemente expressos em células cancerosas e retinoblastoma pancreáticas, implicando uma função oncogénica, enquanto PAX6 é reconhecido como um supressor tumoral no cancro da próstata e gliomas [6], [10], [11], [20], [21] .PAX6 expressão é significativamente reduzida em glioblastomas e o nível de expressão está correlacionada com a sobrevivência do paciente já [22]. PAX6 suprime o crescimento do glioblastoma de células, crescimento independente de ancoragem e angiogénese glioma, bem como capacidade de invasão de células de glioblastoma, através da inibição da metaloproteinase-2 de expressão (MMP2) de matriz e vasculares factor de crescimento endotelial Uma expressão (VEGFA) [20], [23], [24]. No cancro da próstata, a expressão PAX6 foi menor em tecidos de cancro e linhas de células cancerosas do que as células epiteliais normais [21]. Superexpressão de PAX6 suprimiu a proliferação e colônia formação de células cancerosas da próstata [8].

Mas PAX6 desempenha um papel oncogênico em câncer de pâncreas e retinoblastoma [4], [22] .Em adenocarcinoma do pâncreas e linhas celulares de cancro do pâncreas , down-regulação da PAX6 por siRNA específico leva a um declínio no crescimento celular e apoptose celular [12]. Metilação do PAX6-promotores é aumentada no cancro da bexiga cedo e metilado PAX6-promotores pode ser um biomarcador representam para esta doença [25]. E a supressão da expressão de ARNm PAX6 resultou em uma inibição do crescimento e um aumento da apoptose de células de retinoblastoma humanas em cultura [26]. Nossos resultados também revelam que PAX6 implica uma função oncogénica no câncer de pulmão. Em nossos resultados, PAX6 mRNA foi altamente expresso em ambos os tecidos de câncer de pulmão e linhas celulares de cancro do pulmão. A549 e crescimento celular H1299 foi inibida por PAX6 específica shRNA. Supressão da expressão PAX6 levou a uma diminuição do crescimento celular e a formação de colónias, bem como a formação de colónias independentes de ancoragem. Mas os nossos resultados indicam que a apoptose de células não foi afectada pela inibição da PAX6 (dados não mostrados). E migração celular também não foi afetada pela supressão de mRNA PAX6 (dados não mostrados)

PAX6 é dependente de câncer e tem diferentes vias de sinalização em diferentes tumores [13], [20] – [24]., [26]. Em células HeLa, PAX6 regula a progressão do ciclo celular por induzir a expressão de RFPL1 humana (hRFPL1), que regula negativamente a expressão de ciclina B1 e Cdc2 e leva à acumulação de células na fase G2-M [27]. Nós também se concentrou sobre o papel do PAX6 na regulação da progressão do ciclo celular em câncer de pulmão. Em nossa análise do ciclo celular, a ciclina D1 foi suprimida em KD A549 PAX6 e as células H1299 PAX6 KD. Ele indicou que a expressão PAX6 promovido progressão do ciclo celular através da transição células de G1 para a fase S. Consistente com estes resultados, a análise do ciclo celular mostraram uma redução significativa de prisão G0 /G1 e uma indução significativa de G2M prisão /em células de retinoblastoma humanas PAX6 superexpressão [28].

de ciclina D1-CDK4 e ciclina D1 complexos CDK6 no início de fosforilar fase mid-G1 e inativar pRB [29], [30]. Nossos achados deste estudo implicam que o nível de fosforilação pRB S780 foi enfraquecida quando a expressão PAX6 foi inibida. Assim, foi demonstrado que PAX6 aumentou a expressão de ciclina D1 e crescimento celular aumentada através da promoção da transição G1-S. sinalização de Ras induzida por mitogénio promove a transcrição do gene de ciclina D1 e depende da via de sinal MAPK [31]. Os nossos resultados indicam que a inibição da PAX6 diminui o nível de fosforilação de ERK1 /2 e p38. Estes estudos sugerem que PAX6 regula célula G1 /S progressão através de via de sinalização MAPK em células de câncer de pulmão.

No entanto, o mecanismo de regulação do PAX6 no câncer de pulmão ainda é incerto. Um estudo recente mostrou que PAX6 promove o crescimento celular através da activação do gene do receptor de tirosina-quinase de TEM em carcinoma pancreático [13]. Em células de cancro do pulmão, a ERK1 /2 via de sinal está envolvido na via de MET [32]. A nossa descoberta de que indicado de ERK1 /2 foi activada por expressão PAX6. De modo que nós supor que PAX6 activa a sinalização MAPK e promove a progressão do ciclo celular através de transcrição do gene MET no cancro do pulmão

PAX6 é expressa principalmente durante a embriogênese.; pouca ou nenhuma proteína PAX6 é detectada em tecidos adultos [3]. Como PAX6 é frequentemente expressa em tumores [9], determinou-se o nível PAX6 em tecidos de câncer de pulmão primários. O nível de expressão PAX6 em tecidos adjacentes correspondentes foi medida como um controlo. Semelhante a tumores pancreáticos, expressão PAX6 foi mais forte em tecidos de câncer de pulmão do que em tecidos adjacentes. Calculou-se a razão de tecido de cancro-a-lado não tumoral de expressão de ARNm de PAX6 para cada indivíduo. Apenas 3 proporções foram inferiores a 1 e a maioria dos índices eram muito mais do que 100. Todos estes resultados demonstraram que PAX6 funcionou como um fator oncogênico no câncer de pulmão.

Conclusões

Neste estudo, informamos que a expressão aumentada de PAX6 foi observada em tecidos de câncer de pulmão primários. PAX6 promoveu o crescimento das células através da activação de sinalização MAPK e acelerar a progressão do ciclo celular. Além disso, PAX6 regulada progressão G1-S por indução de expressão da ciclina D1 e fosforilação de pRb. Nossos dados sugerem que PAX6 é um novo alvo potencial no câncer de pulmão.

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer Meng Gu para assistência com coleta das amostras.