Abstract

O derivado de tumor anticorpo IgM monoclonal PAT-SM6 mata especificamente células malignas por um mecanismo de apoptose ligada à absorção excessiva de lipídios plasmáticos. O mecanismo é postulada a ocorrer através da ligação multi-ponto de PAT-SM6 ao regulador desdobrado resposta proteína GRP78, localizada na superfície de células tumorais, acoplada à ligação simultânea de plasma de lipoproteínas de baixa densidade (LDL). Nós preparados e caracterizados LDL e LDL oxidado usando velocidade de sedimentação e análise de SAXS (SAXS). técnicas de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) indicou as constantes de dissociação aparente de aproximadamente 20 nM para a ligação de LDL ou LDL oxidada para pat-SM6. experiências de ELISA mostraram competição cruzada com LDL inibir PAT-SM6 ligação a GRP78 imobilizada, enquanto que, na experiência inversa, GRP78 inibida PAT-SM6 ligação a LDL imobilizada. Em contraste com os resultados das experiências de ELISA, ensaios de velocidade de sedimentação indicam interacções relativamente fracas entre LDL e PAT-SM6, sugerindo imunoabsorvência para a placa de microtitulação é accionado por um mecanismo de ligação à base de avidez. A importância da avidez e do apego multiponto de antígenos para PAT-SM6 foi investigado usando esferas de poliestireno revestidas com antigénio. Absorção de GRP78 LDL ou a microesferas de poliestireno levou a um aumento da inibição da ligação PAT-SM6 a placas de microtitulação revestidas com GRP78 ou LDL, respectivamente. Estes resultados suportam a hipótese de que a acção biológica de PAT-SM6 na apoptose de células de tumor depende da natureza multivalente de PAT-SM6 e a capacidade de interagir simultaneamente com LDL e várias moléculas de GRP78 agrupados na superfície da célula tumoral.

Citação: Rosenes Z, Mok YF, Yang S, Griffin MDW, Mulhern TD, Hatters DM, et al. (2013) ligação simultânea do Anti-Cancer IgM anticorpo monoclonal PAT-SM6 de lipoproteínas de baixa densidade e GRP78. PLoS ONE 8 (4): e61239. doi: 10.1371 /journal.pone.0061239

editor: Gunnar F. Kaufmann, O Instituto Scripps Research e Sorrento Therapeutics, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 03 de janeiro de 2013; Aceito: 06 de março de 2013; Publicação: 19 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Rosenes et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é suportado por uma concessão ARC ligação (LP100100392) e pela Patrys Ltd, uma empresa atualmente conduzindo testes clínicos de PAT-SM6 como um potencial tratamento anti-câncer. FH é o director executivo da Patrys, GmbH. O anticorpo PAT-SM6 é propriedade da Patrys Limited e a empresa concorda em fazer para tornar disponível livremente quaisquer materiais e informações descritas na sua publicação que podem ser razoavelmente solicitados para fins de investigação académica e não-comercial. Devido à natureza proprietária das partes de anticorpos terá de entrar em um acordo de transferência de material. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:. Este trabalho é apoiado por uma bolsa ARC ligação (LP100100392) e pela Patrys Ltd, uma empresa a realizar ensaios clínicos de PAT-SM6 como um potencial tratamento anti-câncer. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. FH é o director executivo da Patrys, GmbH. O anticorpo PAT-SM6 é propriedade da Patrys Limited e a empresa concorda em fazer para tornar disponível livremente quaisquer materiais e informações descritas na sua publicação que podem ser razoavelmente solicitados para fins de investigação académica e não-comercial. Devido à natureza proprietária das partes de anticorpos terá de entrar em um acordo de transferência de material.

Introdução

O anticorpo humano IgM monoclonal, PAT-SM6, derivados de tecidos de tumor humano [1] , é um potencial agente anti-cancro capaz de induzir apoptose de células de tumor em modelos pré-clínicos de cancro humano [2]. Embora o mecanismo preciso da morte celular induzida PAT-SM6 não é conhecida, o processo é acompanhado pela acumulação intracelular de lípidos que conduz à hipótese de que PAT-SM6 facilita a absorção de lípidos no plasma. Consistente com esta proposta é a observação de que ambas as lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e LDL oxidado interagir com PAT-SM6 e aumentar a apoptose induzida por PAT-SM6 [2]. PAT-SM6 também se liga ao regulador de resposta proteína desdobrada GRP78, que é sobre-expresso externamente na superfície celular de células de tumor [3]. GRP78, também conhecido como (proteína de ligação de imunoglobulina de cadeia pesada) BiP, é um membro da proteína de choque térmico 70 (HSP70) de família que previne a apoptose induzida pelo stress. Os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), utilizando diferentes concentrações de revestimento de GRP78, previamente estabelecido uma interacção de elevada avidez entre PAT-SM6 e GRP78 mediada pela ligação multi-ponto de PAT-SM6 para GRP78 agrupado na superfície do tabuleiro de microtitulação [4]. No presente estudo, foi investigada a avidez das interações de PAT-SM6 com LDL e LDL oxidado e a natureza competitiva da ligação de LDL e GRP78 para PAT-SM6. O papel da multivalência nas interações de PAT-SM6 com antigénios alvo foi investigado utilizando esferas de poliestireno revestidas com antigénio. Os resultados demonstram a importância do agrupamento antigénio na geração de altas avidezes que caracterizam as interacções antigénio-PAT SM6. A capacidade de PAT-SM6 de se ligar tanto GRP78 e de LDL é consistente com a proposta de que PAT-SM6 mata células, fornecendo excesso de lípidos na forma de LDL em tumores através da ligação simultânea de GRP78 presente na superfície das células tumorais [2].

Procedimentos experimentais

Materiais

O anticorpo monoclonal humano PAT-SM6 foram expressos e purificados a partir de culturas em suspensão estável de uma linha de células humanas em meio isento de soro [5], [6]. controlo do isotipo IgM foi obtido a partir de Jackson ImmunoResearch Labs, Inc., West Grove, PA. PAT-SM6 foi marcado com fluoresceína usando isotiocianato de fluoresceína (Sigma-Aldrich) de acordo com as instruções do fabricante. GRP78 humano maduro contendo uma foi expressa C-terminal 6 × His-tag e purificada a partir de

E. coli

como descrito anteriormente [4].

Ética Declaração

amostras de sangue humano fresco foram obtidos do Hospital St. Vincent, Melbourne usando protocolos aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital St Vincent Melbourne Pesquisa em Seres Humanos . consentimento informado por escrito dos participantes foi obtida para o trabalho humano original que produziu as amostras de sangue para o isolamento de LDL. A LDL foi isolada por fraccionamento de densidade de ultracentrifugação preparativa utilizando KBr [7]. LDL oxidada foi preparado pela adição de 20 uM de CuSO

4-200 ug /ml de LDL e de incubação à temperatura ambiente durante 16 [8] horas. A oxidação foi monitorizada através da medição da absorvância a 234 nm e por tioflavina T (ThT) a fluorescência. TT foi adicionada a LDL para uma concentração final de 8 uM e a fluorescência medida utilizando um

F

max

leitor de placas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) equipados com filtros de 444/485 nm de excitação /emissão. A oxidação foi parada pela adição de EDTA para uma concentração final de 1 mM. LDL oxidada e LDL foram dialisadas em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS, fosfato de sódio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) contendo EDTA 1 mM e 0,1% de NaN

3 e armazenada a 4 ° C. A concentração de proteínas de LDL foi determinada a partir da absorvância a 280 nm corrigida para a dispersão de luz [9] e utilizando um coeficiente de extinção de cm

2 g calculada a partir da composição de aminoácidos da apolipoproteína B. A concentração de 844 /molar de LDL foi calculado assumindo um valor de 2,2 × 10

6 para o peso molecular médio de LDL humana [10].

Small-Angle X-Ray Scattering (SAXS)

Synchrotron SAXS com in-line cromatografia de exclusão de tamanho (SEC-SAXS) de LDL e LDL oxidada foi realizada na linha de luz australiano Synchrotron SAXS /WAXS. As amostras foram sujeitas a SEC em uma coluna com um tamanho de poro de 500 A (WTC-050N5, Wyatt Tecnologia, Santa Barbara, CA), dando uma gama de separação de proteínas eficaz MW de 15.000 a 5.000.000 Da. A coluna foi equilibrada em tampão contendo PBS a uma taxa de fluxo de 0,4 mL /min. As injecções foram de 20 mL com uma concentração de proteína de 3 mg /ml. O tamanho do feixe para a amostra foi de 250 uM horizontal x 150 fim vertical (FWHM). imagens detector Pilatus 1M foram analisados ​​como médias de dez sequenciais 2 s exposições e convertido para indivíduo

I

(

q

) perfis de SAXS usando o software Scatterbrain (Synchrotron australiano).

I

(

Q

) é a intensidade de raios X dispersos, como uma função da grandeza do vector de transferência de momento

Q =

(4πsinθ) /λ, onde o ângulo de espalhamento é 2θ e o comprimento de onda de raios-X é λ (1,12713 Å). Os dados foram coletados a 298 K usando um comprimento câmera de 3,3 m, o que permitiu intensidades ser recolhidos ao longo de um

q-

gama de 0,00429-0,24575 A

-1. perfis de SAXS foram analisados ​​utilizando o ATSAS (versão 2.4) conjunto de programas [11].

Sedimentação Análise Velocity

sedimentação experimentos de velocidade usando óptica de absorção foram realizados utilizando uma ultracentrífuga analítica XL-I (Beckman Coulter, Fullerton, CA) equipado com um rotor Ti An-60 a 20 ° C. As amostras de proteína foram adicionados a peças centrais cheios de EPON-sector duplo com PBS no compartimento de referência. os dados de absorvância radiais foram adquiridas a uma velocidade de rotor de 28000 rpm, utilizando um comprimento de onda de 280 nm, e com incrementos radiais de 0,003 cm no modo de varrimento contínuo. experiências de velocidade de sedimentação também foram realizadas utilizando um XL-A ultracentrífuga analítica equipado com um sistema de detecção de fluorescência (FDS; Aviv Biomedical) para controlar a sedimentação de marcado com fluoresceína PAT-SM6 e KBPA-101. Os limites de sedimentação foram ajustados a um modelo assumindo uma distribuição de coeficientes de sedimentação para as espécies não interactuantes, C (S), utilizando o programa SEDFIT [12]. Os dados foram ajustados utilizando máxima regularização entropia, um valor de P de 0,95 e uma razão de atrito de 1,9 [4]. coeficientes de sedimentação foram corrigidos para os efeitos de LDL sobre a densidade da solução e a viscosidade, assumindo que os valores de 0,967 ml /g e 3,4 mL /g para o volume específico parcial e viscosidade intrínseca de LDL, respectivamente [10].

Enzima Ensaio Imunossorvente Ligado (ELISA)

antígenos foram revestidos em placas de microtitulação de 96 cavidades (Nunc Maxisorp) por incubação durante a noite a 4 ° C. As placas foram então lavadas 3 vezes em PBS, 3 vezes em PBS + 0,1% de Tween 20, 3 vezes em PBS e bloqueadas com 5% (w /v) de BSA em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente, depois lavou-se novamente como acima. Todas as preparações de anticorpos foram feitas em 5% (w /v) de BSA em PBS. Para as experiências de ELISA indirecto, os anticorpos foram aplicados directamente para a placa e incubou-se durante 1 hora. Para os testes ELISA competitivos, os anticorpos foram incubados em solução com diferentes quantidades de antigénio antes da aplicação à placa de microtitulação. Depois de se lavar outra vez como anteriormente, foi aplicada peroxidase conjugada com anticorpo secundio IgM de coelho anti-humano (Dako) à placa e incubou-se durante 1 hora de acordo com as instruções do fabricante. Após uma lavagem final, a ligação do anticorpo foi determinada utilizando 100 uL por poço de 3,3 ‘, 5,5’-solução de substrato de tetrametilbenzidina (Sigma) e medição da alteração de cor a 655 nm. O curso de tempo para o desenvolvimento da cor foi essencialmente linear na faixa de densidade óptica 0-3. As medições foram feitas 15 minutos depois da adição de substrato. Em experiências de controlo, que envolve o revestimento directo das placas com PAT-SM6, no intervalo de concentração 0-2,5 ug /ml, observou-se um aumento sistemático do sinal de ELISA com o aumento da concentração de revestimento, o que implica uma correlação directa entre o sinal de ELISA eo quantidade de anticorpo ligado à placa. dados de ELISA para a titulação de anticorpo primário de ligação ao LDL imobilizada foi analisada assumindo uma isotérmica de ligação de Langmuir simples descrita por a relação Y = K

A /(1-K

a) em que Y é a magnitude do sinal de ELISA e K

a é a constante de ligação aparente, assumindo uma única classe de sítios de ligação.

Antigen-revestimento de poliestireno microesferas

Suspensões de 1 mícron de diâmetro microesferas de poliestireno (Polysciences, Inc) a uma concentração de 2,5% (w /v) foram lavadas por repetida peletização (3 ×) numa microcentrífuga e ressuspensão em PBS, PBS-0,1% de Tween 20, e depois uma última vez com PBS. As microesferas lavadas foram então sedimentadas e ressuspensas em 2 mg /ml de antigénio (LDL ou GRP78) ou 5% (w /v) de BSA (solução de bloqueio) a uma concentração final de 2,5 microesfera% (w /v). Os tubos de mistura microesfera /antigénio foram incubadas durante a noite numa plataforma rotativa, a 4 ° C. Para determinar o grau de ligação ao antigénio, as microesferas foram sedimentadas, e a absorvância medida no sobrenadante a 280 nm e comparada com a absorvância da solução de antigénio inicial. As microsferas revestidas foram então lavadas como acima e, em seguida, bloqueadas com 5% de BSA e armazenadas a 4 ° C até que esteja pronto para uso.

Resultados

A oxidação de LDL

O Cu

2+ oxidação de LDL induzida foi monitorizada através da medição da absorvância de luz a 234 nm (Figura 1A). O aumento de absorvência a 234 nm se aproxima de um máximo depois de 24 horas e é atribuível à formação de dienos conjugados [13]. a oxidação de LDL foi também monitorizada por um ensaio de ThT contínuo [8]. Os resultados mostram que a fluorescência de ThT de LDL incubada com 20 mM de CuSO

4 aumenta ao longo do mesmo período de tempo atingindo um patamar após 16 horas com nenhuma alteração correspondentes observados para as incubações de LDL ou TT de controlo sozinho. A caracterização adicional de LDL oxidada foi levada a cabo utilizando análise de velocidade de sedimentação. distribuições coeficiente de sedimentação (Figura 1c) mostrou um pico único simétrico para LDL com um coeficiente de sedimentação modal de cerca de 4,5 S, enquanto que a distribuição obtida para LDL oxidada foi bi-modal com o pico principal sedimente com um coeficiente de sedimentação modal de cerca de 8 S. este aumento na taxa de sedimentação é atribuível a uma mudança na densidade das partículas, devido a uma perda significativa de lípido a seguir à oxidação [8].

(a) variação da absorvância a 234 nm como uma função do tempo de incubação. (B) Curso de tempo para a mudança de TT de fluorescência de LDL (linha sólida), LDL incubada com CuSO 20 mM

4 (linha tracejada) ou PBS sozinho (linha pontilhada). (C) Sedimentação distribuição coeficiente obtido a partir de análise de velocidade de sedimentação de LDL (linha a tracejado) e LDL oxidado (linha a cheio).

SAXS (SAXS) Análise de LDL e LDL oxidada

análise de SAXS tem sido amplamente utilizado para caracterizar LDL e Cu

2 + tenha sido tratada com LDL oxidada [14], [15], [16]. Esta técnica fornece informações sobre o tamanho total ea forma das partículas de lipoproteínas de parâmetros como o raio de rotação (

R

g) e a dimensão máxima (

D

max), assim como a informação sobre a estrutura interna das partículas a partir da função de distribuição de distâncias par

P

(

R

). Aqui, LDL e LDL oxidada foram submetidas a cromatografia de SAXS de exclusão de tamanho sincrotrão (SEC-SAXS) [4]. Este método melhora a qualidade dos dados de SAXS, fornecendo o tamanho fraccionado a amostra directamente para o raio, e assim separa a dispersão de partícula de interesse a partir de a de quaisquer agregados, mas também proporcionar um próximo jogo tampão perfeito para subtração na redução dos dados processo.

a eluição de LDL e LDL oxidada a partir da coluna foi monitorizada por absorvância a 280 nm e a intensidade de SAXS em zero de ângulo (

I

(0)) como uma função do volume. Os perfis de SAXS das espécies dos picos são mostrados na Figura 2A. Para cada espécie,

R

g foi calculado a partir da inclinação de suas respectivas parcelas Guinier (ln [

I

(

q

)] vs.

q

2) (Figura 2B). Para LDL a trama Guinier foi linear ao longo de um

q

.

R

g gama de 0,8-2,4, dando um

R

valor g de 134 ± 1 Å. O

R

g das espécies pico de LDL medidos aqui é em boa concordância com o valor médio publicada de 139 Å da gama 121-160 Å observado por 17 preparações de LDL a partir de 12 doadores [16]. Para LDL oxidada a trama Guinier foi linear ao longo de um

q

.

R

g gama de 0,8-1,6 dando um

R

valor g de 112 ± 3 Å. raios-X e espalhamento de nêutrons estudos anteriores sobre a oxidação do LDL empregadas amostras estáticas, que mostrou dependente do tempo e [Cu

2 +] – aumentos dependentes em aparente

R

g, até ~160 Â, devido a formação de agregados [16], [17]. A SEC-SAXS derivado

R

valor g relatado aqui é a primeira medição de partículas de LDL oxidados isolados na ausência de agregados. Para cada SAXS o perfil do

P

(

r

) função foi estimado pela Fourier indireta de transformação (Figura 2C). A análise

P

(

r

) indicou que LDL e LDL oxidada teve semelhante

D

max valores de -250 A, que é consistente com as medições anteriores [ ,,,0],16]. A análise

R

valor g de LDL de

P

(

r

) foi de 131 ± 2 A e para a LDL oxidada foi de 109 ± 3 A, que são em boa concordância com os valores da análise de Guinier. Cu

2 + oxidação mediada por causa alterações características da organização interna da partícula de LDL, com tem sido atribuída a uma perda de éster de colesterol e estrutura ordenada triacyglycerol [16].

P

(

r

) análise é diagnóstico desta mudança, como a curva de

P

(

r

) de LDL apresenta um forte pico negativo na

r

= 135 A, que é completamente perdido após oxidação (Figura 2C). Propôs-se que este pico negativo é devido ao contraste negativo das cadeias de hidrocarbonetos ordenada na monocamada externa da LDL, que têm uma menor densidade de electrões do que o solvente circundante. A oxidação é pensado para resultar na adição de oxigénio para as cadeias acilo insaturadas, tornando-os mais electrões denso que a água e resultando em contraste positivo [16], [17].

. Os dados de SAXS são mostrados como média intensidade

I

(

q

) ± 1 desvio padrão, em função da transferência de momento

q Compra de LDL (círculos sólidos) e oxidado LDL (círculos abertos). parcelas (B) Guinier de os dados de SAXS em baixo

Q Compra de LDL (círculos a cheio) e LDL oxidado (círculos abertos). O

q inferior e superior

.

R

limites g para o Guinier análises são indicadas. função (C) distribuição distância Pair

P

(

r

) como uma função da distância radial

r Compra de LDL (círculos fechados) e LDL oxidada (círculos abertos).

immunosorbent ensaios de PAT-SM6 Interações com LDL e

LDL oxidada ligado a enzima

experiências de ELISA foram realizados usando uma gama de concentrações e placas PAT-SM6 revestido com diferentes concentrações de ambos os LDL, ou LDL oxidada (Figura 3). Os resultados mostram um aumento sistemático do sinal de ELISA como uma função da concentração de PAT-SM6 com a ligação mais extensiva observada em concentrações mais elevadas de antigénio de revestimento. Os dados foram ajustados a uma isotérmica de ligação de Langmuir simples de se obter as constantes de ligação aparente (K

a) como uma função da concentração de revestimento de LDL (Figura 3C). Os resultados demonstram que a interacção de PAT-SM6 com LDL oxidada, ou LDL é semelhante e relativamente independente das concentrações de revestimento com aparente K

a valores de cerca de 50 uM

-1, correspondendo a constantes de dissociação de 20 nM. Estes valores indicam que a interacção entre PAT-SM6 e LDL é mais fraca que a interacção entre PAT-SM6 e GRP78, onde os estudos de ELISA produziram as constantes de dissociação aparente de aproximadamente 4 nM de [4].

Os ensaios foram realizados utilizando ( a) de LDL, ou (B) a LDL oxidada em concentrações de revestimento de 0 ug /ml (círculos abertos), 1 ug /ml (triângulos a cheio), 2 ug /ml (losangos abertos), 3 ug /mL (quadrados a cheio), 4 ug /ml (triângulos abertos invertidos), e 5 ug /ml (círculos fechados). (C) Os dados foram ajustados a uma isotérmica de ligação simples para obter constantes de ligação aparente (K

a) para a ligação PAT-SM6 como uma função da concentração de revestimento de LDL (círculos abertos) ou a LDL oxidada (círculos fechados). As barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% da montagem de os dados de ELISA para a curva de ligação de Langmuir.

A ligação simultânea de LDL e GRP78 para PAT-SM6

A capacidade de PAT-SM6 de interagir simultaneamente com GRP78 e LDL foi examinada usando concorrência experiências de ELISA. Os resultados foram realizadas usando baixas concentrações de revestimento de GRP78 ou LDL para permitir a inibição mais eficiente da PAT-SM6 de ligação pela adição de antigénio solúvel. A ligação foi observada resultados utilizando LDL solúvel como um concorrente indicaram que a inibição significativa de PAT-SM6 para placas revestidas com, quer LDL ou GRP78. Por outro lado, os resultados usando GRP78 como um concorrente revelou inibição significativa da PAT-SM6 ligação a GRP78 ou LDL imobilizado, confirmando a capacidade de GRP78 e LDL para competir uns com os outros para a ligação ao PAT-SM6. Uma outra observação a partir da Figura 4 é que as concentrações mais elevadas de LDL são necessárias para metade da inibição máxima, em comparação com GRP78, consistente com a maior afinidade de GRP78 para PAT-SM6 revelou a partir de experiências ELISA directo (figura 3 e [4]).

Os poços foram revestidas com 7,5 mg /mL GRP78 (círculos), 7,5 mg /mL de LDL (triângulos) ou foram deixados sem revestimento (quadrados). PAT-SM6 (5 mg /mL) foi incubado com várias concentrações de competidor antes da aplicação da microplaca.

Análise Sedimentação Velocity da PAT-SM6 e LDL

Os resultados na Figura 3 mostraram que a aparente K

a valores para a interacção de PAT-SM6 com LDL imobilizada ou LDL oxidada foi independente da concentração de revestimento de antigénio. Estas descobertas estão em contraste com os resultados obtidos com GRP78 [4], onde a forte dependência da PAT-SM6 vinculativo sobre a concentração de revestimento de GRP78 foi tomada como evidência de agrupamento antígeno como um dos principais determinantes da força de interacções de ligação PAT-SM6. Os resultados observados para LDL sugeriu que o LDL pode ser agrupado na placa de microtitulação, mesmo em baixas concentrações de revestimento, ou que PAT-SM6 podem ligar-se directamente a partículas de LDL individuais. Para examinar esta última possibilidade, as experiências de velocidade de sedimentação foram realizados para caracterizar a interacção entre LDL solúvel e PAT-SM6. Os resultados na Figura 5A mostram distribuições coeficiente de sedimentação de uma mistura de LDL e PAT-SM6. Dois dos principais picos são observados com coeficientes de sedimentação modais próximas aos valores observados para LDL sozinho e PAT-SM6 sozinho. Análise do coeficiente de sedimentação média do pico mais rápido, corrigindo para o pequeno efeito da LDL na densidade da solução e a viscosidade, não revelou nenhuma diferença significativa em comparação com o coeficiente de sedimentação média para sozinho PAT-SM6. A ausência de qualquer alteração detectável na taxa de sedimentação de PAT-SM6, na presença de LDL indica muito pouca interacção entre estas espécies, nestas condições, e está em contradição com as fortes interacções observadas em experiências de ELISA (Figuras 3 e 4). Uma possibilidade era considerado que o uso de 50 mg /mL de BSA, como um agente de bloqueio nas experiências de ELISA pode actuar como um agente de aglomeração macromolecular e aumentar a afinidade de ligao [18]. Para testar esta possibilidade sedimentação experiências de velocidade foram realizadas utilizando marcado fluorescentemente PAT-SM6 e o ​​sistema de detecção de fluorescência na ultracentrífuga analítica. Isto permitiu que a taxa de sedimentação de rotulado PAT-SM6 para ser monitorizada na presença e ausência de concentrações elevadas de BSA. Os resultados na Figura 5 mostram que a LDL tem muito pouco efeito sobre a taxa de sedimentação de marcado de forma fluorescente PAT-SM6 quer na presença ou na ausência de 50 mg /mL de BSA. Os resultados de velocidade de sedimentação em Figura 5 excluir uma interacção de elevada afinidade entre LDL solúvel e sítios individuais, PAT-SM6 e suportam a proposta de que a ligação de PAT-SM6 para LDL imobilizada em placas de microtitulação é accionado por um mecanismo de ligação à base de avidez de outra maneira interacções fracos (pelo menos gama alta uM).

(a) Sedimentação distribuições coeficiente obtido usando óptica de aborção a 280 nm para PAT-SM6 (0,3 uM, preto), LDL (1,8 uM, vermelho) e uma mistura de de PAT-SM6 e LDL (0,3 uM e 1,8 uM, respectivamente (verde). (distribuições B) coeficiente de sedimentação obtidos usando óptica de fluorescência para marcado com FITC PAT-SM6 (40 nM) na presença (linha a cheio) e ausência (quebrado linha) de LDL (1,8 uM). (distribuições C) Sedimentação coeficiente obtido na presença de BSA (50 mg /ml) usando a óptica de fluorescência para marcado com FITC PAT-SM6 (40 nM) na presença (linha a cheio) e ausência (linha tracejada) de LDL (1,8 M).

as interacções do PAT-SM6 com Antigen-revestidos de poliestireno microesferas

a evidência do PAT-SM6 interage por multi-ponto de fixação para antigénios agrupados sugeriram que a absorção de LDL GRP78 ou a microesferas de poliestireno pode aumentar a capacidade de estes antigénios para inibir interacções de ligação PAT-SM6. microesferas de poliestireno revestidas com antigénio foram preparados por incubação de microesferas de poliestireno com antigénios e monitorização da extensão de ligação utilizando um ensaio de centrífuga de granulação. Os resultados na Figura 6 mostram que GRP78 e LDL ligam-se rapidamente às pérolas de poliestireno. Os resultados mostram também a extensão da ligação de GRP78 aumenta como uma função da concentração de GRP78 e BSA que se liga às esferas de uma forma saturável (Figura 6).

(a) uma quantidade de proteína ligada por grama de microesferas como uma função de GRP78 (círculos a cheio) ou a concentração de BSA (círculos abertos). (B) timecourse de GRP78 (círculos a cheio) e de LDL (triângulos abertos) de ligação a microesferas de poliestireno.

experiências de ELISA para testar se GRP78 ou microesferas revestidas LDL inibir a ligação de PAT-SM6 ao antígeno placas de microtitulação revestidos foram realizados utilizando elevadas concentrações de antigénio de revestimento para maximizar o grau de aglomeração na placa. Os resultados na Figura 7 mostram que as microesferas revestidas GRP78 inibir PAT-SM6 se ligar a placas de microtitulação revestidas com um ou outro GRP78, enquanto, durante o mesmo intervalo de concentração e condições, GRP78 solúvel ou microesferas de controlo de BSA-revestidos não inibiu. Estes resultados indicam forte ligação do PAT-SM6 a esferas revestidas com grp78 através de fixação multivalente que sequestra PAT-SM6 e impede a ligação de PAT-SM6 a placas de microtitulação revestidas GRP78. Resultados semelhantes foram obtidos utilizando placas de microtitulação revestidas com LDL, embora, neste caso, ambas as esferas revestidas com GRP78 e GRP78 solúvel inibiu PAT-SM6 ligação às placas. Este resultado é consistente com a aparente mais elevada avidez de PAT-SM6 para GRP78 em comparação com LDL. Os resultados na Figura 8 mostram que as microesferas de LDL revestido inibir PAT-SM6 se ligar a placas de microtitulação revestidas com LDL, enquanto que sob a mesma gama de condições e de LDL solúvel ou microesferas de controlo de BSA-revestidos não inibem a concentração. Os resultados na Figura 8 mostram também as microsferas revestidas com LDL não inibiu a ligação de PAT-SM6 a placas revestidas GRP78, consistentes com uma avidez mais elevada de PAT-SM6 para GRP78 agrupado em comparação com LDL agrupado.

PAT -SM6 (5 mg /ml) foi incubada com microesferas revestidas com GRP78 (círculos), solúveis GRP78 (triângulos) ou microesferas de ASB revestidas (quadrados) antes da adição às placas de microtitulação.

PAT- SM6 (5 mg /ml) foi incubada com microesferas revestidas com LDL (círculos), LDL solúvel (triângulos) ou microesferas de ASB revestidas (quadrados) antes da adição às placas de microtitulação.

Discussão

anticorpos naturais IgM formam parte da resposta imune inata em que eles estão envolvidos no reconhecimento de partículas estranhas incluindo, oxidados e proteínas e células transformadas [19] quimicamente modificado. Esta classe de anticorpo tipicamente apresentam baixa especificidade para o antigénio com a capacidade de se ligar mais do que um tipo de antigénio [20]. Esta capacidade de se ligar mais do que um tipo de antigénio é evidente no caso de PAT-SM6 onde os dados de ELISA indica interacções fortes com o GRP78 associada à membrana celular estruturalmente não relacionados em células tumorais [3] e com ambas as lipoproteínas de baixa densidade do plasma nativas e oxidadas [2]. Os estudos anteriores demonstram que a interacção de PAT-SM6 com GRP78 é mediada através de um mecanismo baseado em avidez com base no multivalência do anticorpo. Os resultados apresentados no presente estudo sugerem um mecanismo baseado em avidez similar opera para a ligação de PAT-SM6 com LDL. Várias observações apoiam esta conclusão. A interacção de PAT-SM6 com LDL analisados ​​por velocidade de sedimentação não revelou nenhuma mudança significativa na taxa de sedimentação de PAT-SM6, na presença de LDL. Em contraste, as fortes interacções entre imobilizada GRP78 e PAT-SM6 foram observadas em experiências de ELISA. Estes estudos sugerem interações relativamente fracos (na faixa de concentração micromolar) quando PAT-SM6 e LDL estão livres em solução, mas interações muito fortes com LDL agrupados na placa de microtítulo. O suporte para o papel de aglomeração é também fornecido pelos resultados das experiências que empregam microesferas de poliestireno revestidas com antigénio, que mostraram a inibição da ligação de PAT-SM6 a placas de microtitulação revestidas com antigénio melhoradas, em comparação com concentrações equivalentes de formas solúveis do antigénio. Uma diferença marcada com interacções PAT-SM6 com LDL em comparação com as interacções com GRP78 é aparente que a avidez para interacções PAT-SM6 com LDL não revelam uma dependência da concentração de revestimento de LDL. No caso de a aparente GRP78 avidez para PAT-SM6 aumenta com a concentração de revestimento, consistente com um efeito antigénio agrupamento [4]. Uma possível explicação para esta diferença é o grande tamanho de LDL e de ligação mais forte à placa de microtitulação levando a agrupamento, revestimento, mesmo em concentrações baixas.

Análise da ligação de PAT-SM6 para LDL e LDL oxidada indicado semelhante avidezes aparentes (K

d de aproximadamente 20 nM) e em geral, mais fraca ligação em comparação com a interacção com GRP78. Os estudos anteriores sobre a interacção de PAT-SM6 com LDL e LDL oxidada, realizada utilizando um único revestimento de antigénio e concentração PAT-SM6 produziu um sinal de ELISA mais baixa (65%) para a ligação a LDL em comparação com LDL oxidada [2], em contraste com os resultados apresentados na Figura 3, onde as curvas de ligação para PAT-SM6 para LDL e LDL oxidada foram muito semelhantes. Possíveis explicações para esta discrepância são variações nos métodos utilizados para a preparação de LDL oxidada.