Abstract

Fundo

O objetivo deste estudo foi examinar a expressão BRF2 em pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) e explorar a relação de proteína BRF2 com fatores clínico-patológicas, angiogénese tumoral e prognóstico.

Métodos

Ambos proteína BRF2 e microvasos intratumorais foram examinadas por coloração imuno-histoquímica em 107 pacientes com câncer de pulmão de células não-pequenas. Intratumoral densidade m icrovessel (MVD) foi medida por contagem de CD-34 de células endoteliais positivas imunocoradas. Western blot e RT-PCR análises foram utilizados para investigar o estado de expressão BRF2 em tecidos

Resultados

A notavelmente maior nível de expressão BRF2 foi encontrada em tecidos NSCLC em níveis de proteína. Além disso, a análise uni e multivariada demonstrou que a proteína BRF2 sobre-expressão e de alta MVD foram significativamente associados com a recidiva do tumor. Embora BRF2 superexpressão e alta MVD indicou sobrevida global em 5 anos pobres (p = 0,004 e p = 0,019, respectivamente), a análise multivariada demonstrou que apenas BRF2 superexpressão foi um fator prognóstico independente para sobrevida global desfavorável (P = 0,021).

Conclusões

BRF2 é um promissor biomarcador para identificar indivíduos com baixo potencial de prognóstico e um possível alvo para a terapia anti-angiogênico para pacientes com NSCLC em estágio inicial

Citation:. Lu M, Tian H, Yue W, Li G, Li S, Qi L, et ai. (2014)-TFIIB relacionadas Fator 2 sobre-expressão é um marcador prognóstico para o Early-Stage não-pequenas células do câncer pulmonar correlacionado com Tumor Angiogenesis. PLoS ONE 9 (2): e88032. doi: 10.1371 /journal.pone.0088032

editor: Kapil Mehta, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de Agosto de 2013; Aceito: 02 de janeiro de 2014; Publicação: 11 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Projeto apoiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 30571844), e da Fundação de Ciência e Tecnologia de Desenvolvimento da Província de Shandong (No. 2009GG10002007) e da National Science Foundation Natural da província de Shandong (No. ZR2009CM090), eo Wu Jie Ping Foundation (No. 320.6750.12393). Patrocinadores não teve nenhuma participação no desenho do estudo, na coleta, análise e interpretação dos dados; na redação do manuscrito; e na decisão de enviar o manuscrito para publicação. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro do pulmão é a causa mais comum de morte por câncer em homens e mulheres em todo o mundo. Todos os anos, há 1,35 milhão de novos casos de câncer de pulmão no mundo [1]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por aproximadamente 75-80% dos casos de câncer de pulmão [2] – [3]. Apesar dos avanços na detecção precoce, a operação cura radical e modalidades terapêuticas multimodais nas últimas décadas, a taxa de sobrevida em 5 anos global de câncer de pulmão é de apenas 15% [4]. 30-40% de fase I pacientes recaída após a ressecção cirúrgica [5]. Além disso, os dados prospectivos randomizados mostrou que a quimioterapia adjuvante no estádio IB não atingiu um benefício significativo a sobrevivência e até mesmo um efeito negativo foi observado em estágio IA [6]. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar novos biomarcadores que ajudarão a selecionar os pacientes com alto risco de recorrência do câncer de pulmão e proporcionar um melhor prognóstico e tratamento individualização.

RNA polimerase (pol) III é responsável pela transcrição de pequena, menos de 300 nucleótidos, RNAs não traduzidas, incluindo microARNs (miARNs) [7] – [8]. Desde a sua descoberta, miARNs têm sido implicados na patogénese de vários cancros humanos, e expressão de miARN perfis de tumores humanos tem assinaturas específicas associadas com o diagnóstico, estadiamento, progressão, prognóstico e resposta ao tratamento [9]. transcrição exata de RNA pol III requer TFIIIB, enquanto BRF2 (TFIIB relacionadas com o fator 2) é um componente do TFIIIB. A regulamentação da pol III é essencial para as funções de RB, P53 e c-Myc e atividade TFIIIB para controlar o crescimento é estritamente regulado por Maf1, agentes quimiopreventivos, oncogenes e supressores de tumor [10] – [15]. BRF2 tem sido mostrado para ser altamente sobre-expresso numa variedade de cancros incluindo cancros gástricos, renais e melanoma [16] – [17]. Recentemente, Lockwood et ai. relataram que a sobre-expressão de BRF2 poderia conduzir a expressão de transcritos de ARN pol III, contribuindo para a tumorigénese carcinoma de células escamosas, e BRF2 foi identificado como um novo oncogene de linhagem específica em carcinoma de células escamosas do pulmão [18]. No entanto, a nosso conhecimento, a expressão de BRF2 e sua correlação com fatores clínico-patológicas e prognóstico no CPNPC ressecado cirurgicamente não foram investigados.

Neste estudo, utilizamos o método imuno-histoquímico para examinar a expressão da proteína BRF2 em amostras de NSCLC clínicos e analisamos as relações de expressão BRF2 com características clinicopatológicas variáveis ​​e prognóstico do paciente. Além disso, foram avaliados os fatores prognósticos independentes que afetam a sobrevivência a longo prazo de pacientes com NSCLC.

Declaração de Materiais e Métodos

Ética

O protocolo de estudo foi aprovado pelos Conselhos de Ética da Qilu Hospital, e aquisição espécime de tecido foi realizada de acordo com as orientações institucionais. Todos os sujeitos assinaram consentimento informado por escrito, e este processo de aprovação foi aprovado pelos Conselhos de Ética da Qilu Hospital.

Pacientes

As amostras foram obtidas de 107 pacientes que foram diagnosticados com NSCLC entre janeiro 2004 e outubro . 2006 no Departamento de Cirurgia Torácica, Qilu Hospital, e tratados com lobectomia pulmonar além de dissecção de linfonodos regionais.

Todos os pacientes não tiveram radioterapia pré-operatória ou quimioterapia, e não tinha metástases à distância. Os dados sobre as suas características clínico-patológicas e acompanhamento estavam completos. 46 casos de amostras de tecidos adjacentes foram tomadas a partir de cerca de 0,5 cm de distância da aresta exterior dos tecidos de tumor de pulmão, e os outros 32 casos foram necessários mais de 5 cm a partir da margem de tumor dos tecidos pulmonares normais como controlos negativos. Para RT-PCR e análise Western blot, 12 pares combinados de tumores de tecidos e amostras de tecidos não cancerosos adjacentes foram obtidos a partir de amostras lobectomia pulmonar de pacientes diagnosticados com NSCLC imediatamente após a cirurgia entre setembro 2013 e outubro de 2013, em nosso departamento, e armazenadas a -80 ° C.

Para todos os pacientes, tipo histológico e grau de diferenciação de células de câncer foram reavaliados e determinado pelo sistema de classificação da Organização Mundial da Saúde modificado em 2004, e estadiamento patológico pós-cirúrgico foi determinado com base no sistema de estadiamento internacional.

imunohistoquímica

Todos os espécimes foram coletados durante a cirurgia, fixado em 10% formalina e embebidos em parafina. Os tecidos foram cortados como 4 uM secções em série, e depois desparafinizadas utilizando xileno e re-hidratadas através de uma série de etanol para água. recuperação de antigénio de alta temperatura foi realizada em tampão citrato, durante 25 min num forno de microondas. Em seguida, a actividade enzimática da peroxidase endógena foi bloqueada utilizando 3% H

2O

2 em metanol durante 20 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram então incubadas com primário de coelho anticorpo anti-BRF2 policlonal (Abcam) e de coelho anti-CD34 anticorpo monoclonal (Santa Cruz Biotechnology) durante a noite a 4 ° C numa câmara de humidade elevada, seguido por incubação durante 30 min a 37 ° C com Os anticorpos secundários biotinilados e complexo de estreptavidina-peroxidase. Finalmente, foi adicionada uma solução de 3,30-diaminobenzidina, e as lâminas foram contrastadas com hematoxilina e montadas com bálsamo neutro. Para controlos negativos, as secções foram incubadas com PBS, em vez de os anticorpos primários.

Avaliação da expressão da proteína BRF2 e densidade microvascular

Para a coloração BRF2, a área dentro da área de diagnóstico foi marcado por três independentes observadores e um método semi-quantitativo reprodutível, que considerada tanto a intensidade da coloração (0, negativo; 1, fraco; 2, moderada e 3, forte) e a percentagem de células coradas positivamente (0, 0-5%; 1, 6-25 %; 2, 26-50%, 3, 51-75%, 4, 76%) foi adoptado [19]. Para a avaliação da coloração positiva de BRF2, pelo menos 3 secções ou áreas de cada uma das amostras deve ser marcado. pontuações conflitantes foram resolvidos, escolhendo o valor consistente entre dois observadores ou a média das pontuações.

Para intratumoral densidade microvascular (MVD), microvasos foram registrados pela contagem CD34 células endoteliais coradas positivamente como descripted anteriormente [20]. A contagem de microvasos (MVC) foi determinada de forma independente por dois patologistas em cada caso. Três áreas representativas de neovascularização densa foram selecionados sob baixa potência microscópio (× 10 lente objetiva e × 10 lente ocular) e depois embarcações foram contadas em maior ampliação (× 20 lente objetiva e × 20 lente ocular). A média das contagens em três campos foi gravado. Grandes vasos com paredes espessas, musculares foram excluídos.

O valor de corte para alta e baixa expressão foi determinado com base em um valor heterogeneidade medido através de análise estatística log-rank em relação à sobrevida global [21]. A pontuação do índice de coloração 4 foi escolhido como ponto de corte para discriminação entre BRF2 expressão baixa e alta. E o score≥4 índice de coloração tumores com expressão alta BRF2 definido, ea pontuação do índice de coloração 4 indicaram baixa expressão BRF2. Tumores com microvasos ≥42 foram classificados como de alto MVD, enquanto os tumores com microvasos 42 foram classificados como de baixo MVD

PCR em tempo real (RT-PCR)

Os espécimes cirúrgicos foram processadas imediatamente. após a operação. Os ARNs totais foram extraídos a partir de tecidos utilizando Trizol reagente (Invitrogen, Carlsbad, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante e tratou-se com ADNase RQ1 isenta de RNase (Promega) de ADNc foi sintetizada. As expressões de BRF2 e HIF-1α foram quantificados por reacção em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) utilizando um sistema de tempo real de PCR da Bio-Rad com IQ5 EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Hercules, EUA) de acordo com o manual de instruções. O iniciador para GAPDH e BRF2 são como se segue: GAPDH, forward,5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,reverse,5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′;BRF2,forward,5′-GTGAAGCTCCTGGGACTGGAT-3′,reverse, 5′-GTATTTGGCTGGCACAGAAGG-3 ‘; Os resultados são a média ± erro padrão da média (SEM) de 3 experiências de repetição e de GAPDH foi usada como um transcrito de referência.

análise de transferência de Western

Os tecidos frescos foram lavadas três vezes com fosfato arrefecido com gelo -buffered solução salina (PBS) e lisadas em gelo em RIPA (ensaio de imunoprecipitação de rádio) tampão (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) contendo mistura de inibidores de protease completo (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha). A proteína a partir de tecidos ou células foram separadas através de SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF (GE Healthcare, EUA). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite livre de gordura em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20 (TBST) durante 1,5 h à temperatura ambiente, as membranas foram então incubadas durante a noite a 4 ° C com anti-BRF2 (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, EUA), ou anti-GADPH (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, EUA) anticorpos. Seguido por anti-peroxidase de coelho conjugado IgG, um kit ECL (saúde GE, EUA) foi utilizado para a detecção.

A análise estatística

O teste do qui-quadrado foi utilizado para testar a correlação entre BRF2 expressão e MVD e as associações entre a expressão BRF2 ou MVD e fatores clínico-patológicos. método de Kaplan-Meier foi utilizado para calcular as curvas de sobrevivência e teste log-rank foi utilizado para comparar a diferença entre as sobrevivências de subgrupos de pacientes. A análise de regressão multivariada de Cox foi utilizado para identificar fatores prognósticos independentes significativos. As diferenças entre grupos foram consideradas significativas para o valor de P 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas com SPSS 13.0 software estatístico (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

Resultados

expressão BRF2 em NSCLC

Detectamos a expressão de BRF2 proteína nos tecidos normais do pulmão, tecidos não tumorais adjacentes e tecidos de tumores por imuno-histoquímica. Como mostrado na Fig. 1 A, foi observada uma coloração nuclear de proteína difusa BRF2 em várias intensidades em células cancerosas, mas BRF2 mal foi detectado em tecidos de pulmão normal. Além disso, alguma coloração foi observada no citoplasma das células cancerosas. No entanto, não observamos correlação estatisticamente significativa entre a expressão da proteína BRF2 e quaisquer características clinicopatológicas de tecidos NSCLC (P 0,05, Tabela 1). O valor médio da expressão BRF2 em 107 NSCLC tecidos era 55,14%, significativamente mais elevada do que nos tecidos adjacentes e os tecidos pulmonares normais (36,96% e 34,38%, respectivamente, P = 0,034 Tabela 2).

(A ): O padrão de expressão de BRF2 em tecidos de câncer de pulmão. (A) a expressão alta BRF2 no adenocarcinoma de pulmão. (B): expressão alta BRF2 no pulmão tecidos de carcinoma de células escamosas. (C): expressão BRF2 negativo no adenocarcinoma de pulmão. (D): expressão BRF2 negativo em tecidos pulmonares de carcinoma escamoso de células. (E): microvasos intratumorais foram coradas como Brown pelo anticorpo anti-CD34 monoclonal em tecidos de cancro de pulmão (ampliação de × 400). (B): As análises quantitativas-PCR em tempo real de ARNm BRF2 em doze pares de tecidos não cancerosos NSCLC e combinado com GAPDH como um controlo de carga em ambos os painéis. (C): Os níveis da proteína de expressão BRF2 foram avaliadas por western blot do tecido não canceroso emparelhados e NSCLC

Para investigar o status da expressão do gene BRF2 em NSCLC, usamos Real. -time PCR para medir a expressão de mRNA em 12 pares de tumores de câncer primário e espécimes não cancerosas adjacentes. Comparado com seus espécimes não cancerosas adjacentes, expressão 8 de 12 NSCLC tinha regulado para cima (Fig. 1B e Fig. 1 C). Consistentemente, western blot mostrou que os 8 casos também tiveram maior expressão da proteína BRF2 que os tecidos adjacentes.

Correlação entre MVD e fatores clínico-patológicas de NSCLC

intratumoral MVD foi quantificada pela contagem endotelial CD34-positivas células em tecidos de cancro (Fig. 1a), e a intensidade da coloração de MVD variou largamente entre 12 e 118 microvasos /200 × campo de ampliação. Descobrimos que MVD foi significativamente correlacionada com profundidade de invasão (P = 0,013), mas não com outros fatores clínico-patológicas de NSCLC (P 0,05; Tabela 1)

univariada e análise de sobrevida multivariada

. dos 107 pacientes, 53 (49,5%) casos morreram no prazo de 5 anos após a operação, e reincidência do tumor desenvolvido durante o follow-up em 57 (53,3%) pacientes. análises de Kaplan-Meier comparadas pelo teste de log-rank foram utilizados para calcular o efeito dos fatores clínico-patológicas sobre a sobrevida global ea sobrevida livre de doença. A análise univariada demonstrou que a alta MVD (40,0% vs. 63,8%; P = 0,019) e superexpressão da proteína BRF2 (39,0% vs.64.6%; P = 0,004) predisseram significativamente menor sobrevida global em 5 anos. Além disso, a alta MVD (65,0 vs 38,3%, P = 0,008) e superexpressão da proteína BRF2 (62,7% vs. 41,7%; P = 0,006) indicaram um maior risco de recorrência (Fig. 2); Além disso, a análise multivariada identificou BRF2 superexpressão (P = 0,036) e MVD (P = 0,034) como fatores prognósticos independentes para sobrevida livre de progressão. No entanto, apenas BRF2 superexpressão manteve a sua importância como fator prognóstico independente para geral, bem como a sobrevivência livre de progressão (P = 0,021, Tabela 3 e Tabela 4).

Para explorar a correlação de BRF2 superexpressão com MVD, examinamos ainda mais a sobrevivência diferenças de pacientes estratificados para baixo MVD e MVD alta de acordo com BRF2 status de expressão da proteína. Para pacientes sem BRF2 superexpressão, detectamos uma sobrevivência altamente significativa inferior global (SG) e sobrevida livre de doença (PFS), respectivamente, em pacientes com alta MVD em comparação com pacientes com baixa MVD (P = 0,003 para OS e P = 0,001 para PFS, Tabela 5). No entanto, não houve diferenças significativas na sobrevivência entre baixa e alta MVD grupo MVD-grupo de pacientes com BRF2 superexpressão (P 0,05, Tabela 5). E análise estatística demonstrou que não era significativamente mais MVD em tumores com expressão da proteína BRF2 elevada do que naqueles com proteína BRF2 expressão baixa (P 0,001, teste de Mann-Whitney U; a Fig. 3).

Mann WhitneyUtest demonstrado que os tumores com BRF2 expressão da proteína mostrou significativamente maior MVD intratumoral do que os tumores com proteína BRF2 baixa expressão (P 0,001).

Foram analisados ​​ainda mais o significado prognóstico da proteína BRF2 na seletiva subgrupos de pacientes estratificados de acordo com tipo histológico de CPNPC. A análise univariada demonstrou que a taxa de sobrevida de 5 anos em geral de pacientes com alta expressão de proteína BRF2 foi significativamente menor do que a dos demais pacientes entre carcinoma de células escamosas, e encontramos também essa tendência no adenocarcinoma, apesar da análise estatística não faz sentido ; (P = 0,007 e P = 0,130, respectly; Fig. 4)

(a): carcinoma de células escamosas.. (B):. Adenocarcinoma

Discussão

A capacidade de proliferar descontroladamente é a característica dominante de muitos tipos de células cancerosas. Avaliação de fatores prognósticos moleculares é uma importante área de pesquisa do câncer. BRF2 proteína é codificada por um gene localizado no cromossoma 8p12 [22]. Vários estudos têm mostrado que BRF2 é sobre-expressa em vários tipos de cancro [23] e sugerem o papel oncogénica de BRF2. No entanto, poucos estudos investigaram a expressão ea importância dos BRF2 em NSCLC, especialmente para o prognóstico do NSCLC.

Neste estudo, os resultados mostraram que não houve correlação significativa entre a expressão BRF2 e as características clinicopatológicas de NSCLC (p 0,05). No entanto, a alta MVD foi significativamente associada com o estado T em NSCLC, mas não associada com a idade, sexo, tabagismo, histologia e diferenciação. Em certa medida, o estágio T é um processo crítico do desenvolvimento do tumor, e a diferença na correlação entre MVD e características clinicopatológicas poderá reflectir que a densidade de microvasos é um aspecto importante do desenvolvimento do tumor. No entanto, não foi encontrada diferença significativa na expressão BRF2 entre adenocarcinoma de pulmão e carcinoma de células escamosas do pulmão por coloração imuno-histoquímica.

Em particular, os nossos resultados mostraram que a superexpressão da proteína BRF2 era comum em tecidos primeiros NSCLC e significativamente associada com o aumento da atividade angiogênica medido como MVD intratumoral, o que sugere que desempenha BRF2 papel crucial na tumorigénese NSCLC pela indução e /ou promoção de angiogénese tumoral. Embora múltiplos factores de crescimento têm sido mostrados para regular a angiogénese e o desenvolvimento vascular, pouco se sabe sobre o mecanismo de regulação do complexo de expressão do gene e de tradução [24]. Nossos resultados destacam o papel potencial da BRF2 na angiogénese tumoral.

A nossa análise de sobrevivência demonstraram que a alta MVD e superexpressão da proteína BRF2 significativamente previu diminuição da sobrevida de 5 anos em geral e maior taxa de recorrência. Uma análise mais aprofundada, utilizando o modelo de regressão de Cox confirmou que a expressão BRF2 e MVD foram fatores independentes na previsão de sobrevida livre de progressão em pacientes com NSCLC, sugerindo que a proteína BRF2 e MVD podem ser potenciais fatores prognósticos para a recaída dos pacientes com NSCLC em estágio inicial. No entanto, na análise multivariada, apenas a expressão BRF2 poderia independente e significativamente prever a sobrevida global em 5 anos, apesar da constatação de que a alta MVD foi significativamente associada com recorrência do tumor. Nossos dados indicam que BRF2 superexpressão teve uma enorme influência sobre o sistema operacional e PFS, enquanto MVD mostrou um efeito significativo sobre o sistema operacional e PFS apenas nos pacientes sem BRF2 superexpressão.

Em conjunto, nossos dados suportam a hipótese de que proteína BRF2 sobre-expressão é comum em início de carreira NSCLC e significativamente correlacionada com a angiogênese do tumor e recaída. Além disso, BRF2 superexpressão é um fator prognóstico independente para pacientes com NSCLC.