Abstract

Fundo

A topoisomerase I (Top1) é alvo de quimioterapia inibidor Top1. O

TOP1

gene, localizado no 20q12-q13.1, é frequentemente detectada no número de cópias elevados no cancro colorectal (CRC). O presente estudo explora o mecanismo, frequência e impacto prognóstico da

TOP1

aberrações genéticas no estágio III CRC e como estes podem ser detectados por hibridização in situ fluorescente (FISH).

Métodos

Nove CRC linha celular metáfase foram analisados ​​por FISH com uma sonda

TOP1

em combinação com uma sonda de referência cobrindo tanto a região centromérica do cromossomo 20 (CEN-20) ou cromossoma 2 (CEN-2) . As secções de tecido a partir de 154 fase III pacientes CRC quimioterapia pela primeira vez, previamente estudadas com

TOP1 /Tablet CEN-20, foram analisados ​​com o

TOP1 /Tablet CEN-2. Relações entre o estado de biomarcadores e sobrevida global (OS), tempo de recorrência (TTR) em CRC e tempo de recorrência local (LR, só câncer retal). Foram determinados

Resultados

TOP1

aberrações foram observados em quatro metáfases linha celular. Em todas as linhas de células CEN-2 foi encontrado para refletir níveis de ploidia cromossômicas e, portanto, o

TOP1

/CEN-2 combinação sonda foi selecionado para identificar

ganhos TOP1

gene

(TOP1 /

CEN-2≥1.5). Cento e três pacientes (68,2%) tiveram

TOP1

ganho, dos quais 15 pacientes (14,6%) abrigou uma amplificação (

TOP1 /Tablet CEN-20≥2.0).

TOP1

ganho gene não tem qualquer associação com parâmetros clínicos, enquanto que

TOP1

amplificação mostrou uma tendência não significativa para mais TTR (multivariada HR: 0,50, p = 0,08). casos, uma vez amplificados foram separados dos outros casos de ganho de gene, aumenta gene não amplificados (

TOP1

/CEN-2≥1.5 e TOP1 /CEN-20 2,0) mostrou uma tendência de menor TTR (HR univariada: 1,57, p = 0,07).

Conclusões

TOP1

de cópias do gene aumento número ocorre freqüentemente em estágio III CRC em um mecanismo que muitas vezes inclui CEN-20. Usando CEN-2 como uma medida para níveis de ploidia do tumor, que foram capazes de discriminar entre os diferentes mecanismos de ganho de gene, que apareceu a diferir em impacto prognóstico.

TOP1

diretrizes PEIXES foram atualizados

Citation:. Smith DH, Christensen IJ, Jensen NF, Markussen B, Rømer MU, Nygård SB, et al. (2013) Mecanismos de topoisomerase I (

TOP1

) Aumento gene de cópia Número de câncer colorretal Cohort Fase III do Paciente. PLoS ONE 8 (4): e60613. doi: 10.1371 /journal.pone.0060613

editor: Anthony WI. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 19 de dezembro de 2012; Aceito: 28 de fevereiro de 2013; Publicação: 05 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Smith et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela Agência dinamarquesa para a Ciência, Tecnologia e Inovação, através do programa PhD industrial. Nils Brünner e Hans Jørgen Nielsen foram apoiados pelo Conselho Dinamarquês para a Investigação Estratégica, Simon Fougner Fundação Hartmanns Família, IMK Almene Foundation, Kathrine og Fundação Vigo Skovgaards, Tømrermester Johannes Nevoeiro Foundation, Fabrikant Einar Willumsens Memorial Trust, Danish Cancer Society, The Medical Danish Research Council, The Nielsen Fundação Hede, Director Ib Henriksens Foundation, Serraria proprietário Jeppe Juhl e esposa Ovita Juhl Foundation, O Fundo Kornerup, The Aase e Fundo Danielsen Ejnar e The Aage e Johanne Louis-Hansen Fund. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. David Hersi Smith, Sven Müller e Kirsten Vang Nielsen são empregados na Dako A /S . Nils Brünner é conselheiro médico para Dako A /S. Ib Jarle Christensen é um consultor externo para Dako A /S. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de morte por câncer em todo o mundo. Em 2011, a CRC foi responsável por um número estimado de nove por cento dos novos casos de cancro, bem como nove por cento das mortes por câncer em os EUA [1]. Para o tratamento de CRC avançado (fase IV), duas opções disponíveis quimioterapêuticos são: 5-fluorouracilo (5-FU, capecitabina) em combinação com o irinotecano (Folfiri) ou oxaliplatina (FOLFOX) mais agentes biológicos. Vários estudos relatam taxas de resposta semelhantes entre os dois regimes, em primeira linha de tratamento de doença avançada [2] – [4], com um único estudo relatando uma taxa de resposta significativamente maior com FOLFOX [5]. Curiosamente, um destes estudos relataram uma segunda linha 6% de resposta objectiva para tratamento Folfiri seguinte FOLFOX falhou e uma resposta de 21% objectivo para a segunda linha de tratamento FOLFOX seguinte Folfiri falhou, indicativa de uma resistência cruzada não-completa entre oxaliplatina irinotecano e [4]. Esta constatação levanta a questão de saber se um subgrupo de pacientes que receberam FOLFOX como tratamento de primeira linha teria beneficiado de FOLFIRI como tratamento de primeira linha, ou vice-versa. Consideramos, portanto, que os esforços dirigidos à descoberta de um perfil biomarcador preditivo para o resultado do tratamento FOLFOX /FOLFIRI são garantidos.

O irinotecano, um pró-fármaco do SN-38, funções através da inibição da enzima topoisomerase I (TOP1) [6]. Top1 desempenha um papel essencial para aliviar as tensões topológicos que surgem durante a replicação do ADN e a transcrição por entalhamento, relaxante e re-ligando a estrutura de ADN de cadeia dupla. SN-38 liga-se e estabiliza Top1 os complexos de ADN-Top1 intermédios. Subsequente re-ligação é inibida, o que acaba resultando na morte celular devido a danos no DNA durante a replicação do DNA ou transcrição [6], [7]. Top1 foi devido ao seu papel como um alvo para SN-38 foi proposta como um possível biomarcador preditivo para o resultado do tratamento FOLFIRI. Em câncer colorretal avançado, dois grandes estudos retrospectivos que investigam a relação entre os níveis de proteína Top1 e resultado do tratamento irinotecan produzir resultados conflitantes [8], [9]. Embora estes esforços têm sido direcionados a estudar os níveis de proteína Top1, a investigação sobre alterações cromossômicas envolvendo o gene topoisomerase I (símbolo:

TOP1

) são limitadas. Localizado no 20q12-q13.1, parte do 20q região freqüentemente ganhou implicado em adenoma à progressão do carcinoma [10] – [13],

TOP1

é encontrado em números de cópias elevadas em uma grande fração de fase III CRC amostras, quando detectado por Fluorescent Hibridização In Situ (FISH) [14], [15],

em nosso estudo de

TOP1

, já anteriormente demonstrado que, em uma fase III CRC quimioterapia pela primeira vez coorte de pacientes (n = 154), o aumento da

TOP1

número de cópias do gene foi significativamente associada com maior sobrevida (OS) [15]. Curiosamente, estima-se que 71% dos pacientes abrigava um

TOP1

aumento de cópias do gene, enquanto que apenas 10% dos pacientes abrigava um

TOP1

amplificação [

TOP1

/CEN-20 ( centrómero 20) Rácio ≥2.0] [15], indicando que a amplificação do gene não é o mecanismo mais comum para a geração de cópias adicionais de

TOP1

. A forte correlação entre o

TOP1 Comprar e CEN-20 foi encontrado, revelando uma associação entre

TOP1 Comprar e CEN-20 número de cópias aumenta. Isto sugere que os mecanismos de ganho gene que envolvem tanto o

TOP1

lócus e cromossomo 20 região centromérica também ocorrem, possivelmente, pelo ganho de todo o braço 20q por exemplo formação isochromosome ou toda cromossomo 20 ganho (aneusomy). Este tipo de aumento de número de cópias do gene ocorre por mecanismos relacionados com a segregação errada dos cromossomas e não a amplificação do gene. Medindo alterações no número de cópias do gene por FISH, tradicionalmente, assenta na utilização de uma sonda de referência mesmo cromossoma, por exemplo utilizando CEN-20 para medição de genes no cromossomo 20, que, portanto, começou a desenvolver um ensaio de FISH romance de distinguir amostras tumorais com

TOP1

copiar número aumenta devido à amplificações daqueles com os acréscimos devidos a 20q ganho ou aneusomy por aplicação de uma sonda de referência dirigido a um cromossomo independentes.

o objetivo do presente estudo é determinar a frequência de

TOP1

alterações, mapear quaisquer efeitos prognósticos destas aberrações genéticas, identificar pontos de corte que refletem os mecanismos genéticos subjacentes de

TOP1

copiar alterações numéricas e diretrizes FISH pontuação de atualização para reduzir observador carga de trabalho. Para atingir estes objetivos, o mecanismo de

TOP1

ganho de cópias do gene foi investigada em um painel de linhas celulares de CRC com o objectivo de identificar uma sonda de referência que realmente reflete níveis de ploidia, de modo que

TOP1

número de cópias aumenta deve ser detectada em relação ao número total de cromossomas (nível de ploidia) e este é o melhor feito através da utilização de um gene de centrómero proporção. A nova combinação de sonda, que consiste em

TOP1

e uma específica 2 centrômero (CEN-2) da sonda, foi então aplicado para a fase III amostras de pacientes CRC previamente testados para discriminar entre doentes portadores do

TOP1

número de cópias aumenta causadas por mecanismos que envolvem a segregação errada dos cromossomas e aqueles causados ​​por amplificação do gene. A relação entre os diferentes mecanismos de

TOP1

copiar aumento número eo prognóstico do paciente foi investigada. Além disso, com base em todos os dados de peixe, nós poderíamos atualizar o

TOP1

diretrizes FISH de pontuação.

Materiais e Métodos

2.1 Pacientes e material clínico

One e cinqüenta e quatro pacientes com CCR com histologicamente verificada estágio adenocarcinomas III e amostras obtidas tumorais FFPE foram selecionados como descrito anteriormente (ver Fig. 1) [15]. Todos os pacientes tiveram ressecções cirúrgicas de sua CRC e não recebeu radioterapia adjuvante e /ou quimioterapia, já que esta não era parte do tratamento CRC padrão na Dinamarca no momento (Abril de 1991 a agosto 1993). Os pacientes foram randomizados para receber ranitidina ou placebo por até cinco anos, com nenhum efeito de ranitidina na sobrevivência relatados [16]. Os participantes forneceram consentimento informado por escrito eo estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinki II com a aprovação do Conselho Dinamarquês Nacional de Saúde (2760-419-1989), Agência de Protecção de Dados (1991-1110-751) e Comissão de Ética Nacional Central ( KF 01-2045 /91). A aprovação incluiu recolha de amostras de tecido para posterior análise de marcadores biológicos (KF 01-078 /93)

2.2 Preparação de metafases Não truncado Interphase Núcleos

linhas celulares CRC Colo-205, HCC-2998, HCT-15, HCT-116, HT-29, KM12, e SW620 foram obtidos a partir do Programa Therapeutics NCI /Desenvolvimento, enquanto DLD -1, LoVo, e LS-174T foram obtidas a partir da American Tissue Culture Collection. As linhas de células foram mantidas a 37 ° C, 5% de CO

2 em meio RPMI 1640 crescimento GlutaMAX ™ (Invitrogen, Carlsbad, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (Invitrogen). Uma vez que as culturas atingiram uma confluência de -70%, foi adicionada colcemida (Invitrogen) e as culturas foram incubadas durante 2 h a 37 ° C. Subsequentemente, as células foram colhidas e um tratamento hipotónico foi realizada (0,075 M de KCl) durante 10 min. A fixação foi realizada (fixador: 03:01 v /v metanol absoluto e ácido acético glacial). E esta suspensão foi gotejada em lâminas de vidro

2.3 TOP1 /CEN-2 Probe Mistura

O

TOP1

sonda gene já havia sido descrito em outros lugares [14]. Um CEN-2 sonda específica (Dako, Glostrup, Dinamarca), que consiste em vários monómeros de PNA marcado com FITC dirigido a sequências α-satélite repetitivas, foi combinada com a sonda de DNA do gene de Texas Red-etiquetadas em tampão de IQFISH [17] (Dako). O

TOP1

/CEN-20 combinação sonda foi previamente descrito [14].

2.4 FISH Procedimento

reagentes peixes foram do Kit Citologia FISH Acessório (K5499) e Histologia FISH Acessório Kit (K5799) (Dako). metafase espécimes foram fixados em formaldeído a 3,7%, lavadas, desidratadas (em 70%, 85%, série de etanol a 96%) e seca-se ao ar. sonda FISH foi carregado slide, desnaturado a 82 ° C (

TOP1

/CEN-02:05 min,

TOP1

/CEN-20:10 min) e hibridizadas (

TOP1 Twitter /CEN-02:01 h,

TOP1

/CEN-20: o pernoite). sonda em excesso foi removido por lavagem em tampão de rigor (

TOP1

/CEN-2:63 ° C,

TOP1

/CEN-20:65 ° C). As lâminas foram lavadas, desidratadas, secas ao ar e montadas.

TOP1

/CEN-2 hibridação FISH de amostras FFPE (espessura: 3 mm) foi realizada de acordo com as recomendações do fabricante (Dako). Resumidamente, as lâminas foram pré-tratadas de calor (em forno de microondas) e pepsina digerido a 37 ° C. As lâminas foram subsequentemente desnaturadas a 66 ° C durante 10 minutos e depois hibridizou a 45 ° C durante 2/1 h e em seguida tratada tal como descrito acima.

2.4.1 Pontuação.

sinais de FISH foram inicialmente pontuados como previamente descrito [14]. Resumidamente, os sinais foram contados em 60 núcleos não sobrepostos relevantes se os sinais foram, no mínimo, visível na ampliação de × 200 no filtro apropriado. O escore foi realizado em 1000 × ampliação na Red /duplo filtro FITC Texas. contagens de sinais foram digitados diretamente em uma folha de pontuação eletrônica (gentilmente cedido por A. Schonau, Dako, Glostrup, Dinamarca). Inicialmente, 60 núcleos foram marcados para cada espécime seguintes

TOP2A

diretrizes FISH pharmDx ™ (Código K5333, bulas, 1

edição st, 2008/01/18), onde núcleos albergando ambos os sinais, bem como núcleos guarida apenas sinais de referência foram marcados, o que facilita a detecção de deleções de genes. Para melhorar a sensibilidade do ensaio, única núcleos abrigar sinais tanto gene- e de referência foram incluídos para análise posterior.

Para determinar o mecanismo de

TOP1

copiar aumento número de linhas celulares, locais de sinal e números eram notado por 50 metáfases para cada linha de células. O número total de cromossomos para cada linha celular foi determinado tendo em imagens digitais de três metáfases para cada linha celular e contagem do número total de cromossomos manualmente.

Para determinar a haplóide, diplóide, triplóide e faixas tetraplóides para o CEN -2, 60 núcleos foram contadas no epitélio afectada adjacente ao tecido do tumor. A gama diplóide foi definida como a seguir 2n – (N /2) [min] ≤2n 2n + (n /2) [max], onde 2n igual a média CEN-2 contagens por núcleo na (diplóide) epitélio afectado. O triplóides e tetraplóides faixas foram encontrados usando 3n ou 4n vez de 2n, respectivamente. As gamas de nível de ploidia haplóides e elevados foram definidos como abaixo da gama diplóides e tetraplóides acima das gamas, respectivamente. Definição de intervalos de ploidia foi previamente descrito [18].

2.5 Métodos Estatísticos

Todos descritiva e sobrevivência análises foram realizadas através da utilização de SAS 9.2 (SAS Institute, Cary, EUA). R versão 2.15.1 foi utilizado na otimização de método de pontuação. Métodos

2.5.1 pontuação.

Gene para centrômero rácios foram calculados pela incluindo tanto os primeiros 10 ou 20 núcleos, determinando

TOP1

status e comparando este com o estado após a inclusão de todos os núcleos relevantes. Concordância foi calculada pela utilização de Kendall tau [tau = (concordo-discordo) /(+ concordam discordar)]. intervalos limítrofes próximos dos valores de corte, onde os núcleos adicionais devem ser incluídos (por 10 núcleos, um adicional de 10 núcleos tinham que ser marcado, durante 20 núcleos, um adicional de 20 núcleos tinham de ser marcados) foram definidos como maior do que ou igual a 1,35 (min) e menos do que 1,65 (max) quando aplicado de corte foi de 1,5. Usando HER2 /CEN-17 orientações, o intervalo limítrofe cobrindo o cut-off de 2,0 foi definido como maior ou igual a 1,8 (min) e inferior a 2.2 (máximo) [19]. Concordância eo número médio de núcleos marcados foram calculados com e sem intervalos limítrofes

2.5.2 Sobrevivência análise

Foram considerados três desfechos:.. Sobrevida global (OS, o tempo até a morte por qualquer causa) , tempo de recorrência (TTR, tempo para qualquer evento relacionado com cancro colo-rectal) e tempo de recorrência local em cancro rectal (LR) (descrito em detalhe em [15]). As estimativas de Kaplan-Meier de probabilidades de sobrevivência são apresentados para as variáveis ​​binárias e algumas combinações. A análise multivariada foi feito o ajuste para sexo, (diferença por 10 anos na idade) idade e localização do tumor (RC contra CC). A análise de regressão de Cox foi utilizado para as análises. Os modelos foram validados, avaliando a hipótese de proporcionalidade e linearidade para co-variáveis ​​contínuas empregam Schönfeld e Martingale resíduos.

TOP1 Comprar e CEN-2 número de cópias, quando analisado como variável contínua foram log transformados (base 2) e, portanto, refletiu uma diferença de duas vezes para essas variates. Os resultados são apresentados por razões de risco (HR) com intervalos de confiança de 95% (CI) e valores de p. Todos os valores p calculados foram de dois lados e considerado significativo em 0,05.

Resultados

3.1 Mecanismos de TOP1 Gene Copiar aumentam em linha celular Painel

Para determinar o mecanismo subjacente (s) de

TOP1

aumento do número de cópias do gene, os spreads metáfase foram preparados a partir de um painel de dez linhas celulares de CRC. preparação da metafase foi bem-sucedida para todas menos uma das linhas celulares (LS-174T). Após a hibridação subsequente com o

TOP1

/CEN-20 sonda, metáfase foram analisadas em relação ao número total de cromossomas, o número de gene- e de centrómero-sinais, bem como a localização de sinal, cujos resultados pode ser visto na Tabela 1 e Figura 2.

foram observados TOP1

genes número de cópias aumenta em quatro das nove linhas de células. Em ambos Colo-205 e SW620, o ganho do gene parece estar ligado ao cromossoma 20 aneusomy (Fig. 2A e 2D, respectivamente). Em HT-29 (Fig. 2B),

TOP1

ganho gene ocorreu de uma forma sugestiva de 20q formação isochromosome. Em KM12,

TOP1

ganho ocorreu independentemente da CEN-20 (Fig. 2C). Não

foram observados

TOP1 amplificações. Como mostrado na Tabela 1, apenas a

TOP1

ganhos de genes que não envolvem CEN-20 (de uma forma 01:01) são reflectidos no

TOP1

/rácio CEN-20.

A: Colo-205, B: HT-29 (canto inferior direito: isochromosome digitalmente ampliada), C: KM12, D: SW620. Nota:. Devido à existência de duas cromátides de cada cromossomo metaphase, o número observado de sinais de genes é o dobro do que é observado em um núcleo interfásico

3.2 Identificação de uma nova referência Probe

para identificar um marcador relevante para a ploidia celular, ou seja, o número total de cromossomos, o NCI e SKY do NCBI /M-FISH e CGH banco de dados (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/céu /skyweb.cgi) foi exibido. Cromossoma 2 pareceu ser o menos afetado por aberrações numéricas independentes, como ganho de cromossomo inteiro, e, portanto, foi seleccionado para posterior análise no painel metaphase a linha celular. Como mostrado na Tabela 1, as linhas celulares triplóides (Colo-205 e HT-29) foram encontrados para produzir três CEN-2 sinais, enquanto que as linhas de células diplóides produzido apenas dois. Todos

TOP1

gene cópia aumentos reflectiram-se no

TOP1

/CEN-2 escala com um valor de corte de 1,5, o que representa uma situação de 03:02 entre o gene e centrômero e refletindo um adicional

TOP1

copiar em uma célula diplóide.

3.3 Fase III CRC paciente material

TOP1

/CEN-2 hibridação e avaliação FISH foi bem sucedido para 151 de 154 amostras tumorais FFPE pacientes (98%) (ver Fig. 1). A distribuição de sinais

TOP1 Comprar e CEN-2 foi homogênea em amostras tumorais. Para melhorar a sensibilidade para detectar espécimes abrigar cópias adicionais do

TOP1

, única núcleos abrigar tanto

sinais TOP1 Comprar e CEN-2 foram incluídos na análise subsequente, o que resultou em uma média de 58 núcleos marcados para cada amostra de tumor (intervalo: 47-60). Em 50 amostras selecionadas aleatoriamente, CEN-2 sinais foram contadas na mucosa do cólon afetado para determinar sinais contagens médias (média: 1,37, mediana: 1,38, intervalo: 1,20-1,62). Estas contagens foram usadas para definir o intervalo diplóide (ver secção 2.4.1).

No material do tumor, CEN-2 variou 1,19-2,52 com mediana de 1,70. Ao comparar médias CEN-2 sinais contagens a partir dos núcleos do tumor para os núcleos não-tumorais, a maioria (97,4%) de amostras de tumor pode ser classificado como albergando duas cópias (disomic) ou três (trisomic) do cromossoma 2 (Tabela 2) . Nas amostras de tumor,

TOP1

sinais variou 1,33-6,72 por núcleo com uma mediana de 3,17 sinais enquanto o

TOP1

/CEN-2 proporção variou 1,01-3,39 com mediana de 1,92 . Não deleções (

TOP1

/CEN-2 0.8) foram observados.

3.3.1 Determinando

TOP1

status.

Para identificar amostras abrigando um

TOP1

gene aumento do número de cópias, um

TOP1

/CEN-2 rácio de corte de 1,5 foi aplicado. Como mostrado na Fig. 3, as amostras que produzem índices iguais ou superiores a este corte recebeu o

TOP1

status de ‘Gain’, enquanto que os que estão abaixo foram denominados ‘

TOP1

Normal’. Inicialmente, 103 pacientes (68,2%) foram classificados como ‘Gain’ usando este corte.

linha vermelha indica

TOP1

sinal do gene e ponto verde indica sinal centromérica. Exemplos são baseados em resultados de CRC linha de células em metafase – trissomia (SW620), pentasomy (Colo-205), 20q formação isochromosome (HT-29) e 20q ganho (KM12)

Uma vez que as amostras tumorais abrigar. uma cópia adicional do

TOP1

foram identificados, os dados sobre

TOP1

/CEN-20 foi usado para elucidar o mecanismo de

TOP1

aumento de cópias do gene. Através da aplicação de um

TOP1

/CEN-20 rácio de corte de 2,0 para distinguir entre as amostras em que

TOP1

ganho de gene ocorre independentemente da CEN-20 (

TOP1

/CEN -20≥2.0) daqueles em que o ganho de gene ocorre devido à aneusomies ou 20q formação isochromosome (

TOP1

/CEN-20 2.0), as amostras com um

ganho TOP1

poderia ser ainda mais dicotomizados em amplificado e subgrupos não amplificado. Portanto, amostras de produção de um

TOP1

/CEN-2 relação de igual ou superior a 1,5 e uma

TOP1

/CEN-20 rácio acima ou igual a 2,0 foram denominados ‘

TOP1

Amplificação ‘, enquanto que para aqueles abaixo de 2,0 foi dada uma’

TOP1

não amplificados estatuto Gain “(ver Fig. 3). Como mostrado na Tabela 3, a maioria (58,4%) de amostras de tumor receberam um

TOP1

Não amplificados estado de ganho. Todas as amostras classificadas como

TOP1

Amplification também foram encontrados produzir um

TOP1

/CEN-2 proporção de acima de 2,0 (ver Tabela 3).

Para verificar a categorização das amostras em subgrupos, significa CEN-2 e CEN-20 sinais em núcleos de tumor foram comparados com os respectivos meios em mucosa do cólon afetado, cujos resultados são apresentados na Tabela 2. as amostras com média CEN-2 e CEN-20 em a gama diplóide pertencia em 21/34 (61,8%) casos a

TOP1

categoria normal. Near-triploid e CEN-20 casos aneusomic foram mais freqüentemente encontrados nas amostras classificadas como

TOP1 Gain

Não amplificados. CEN-2 aneusomy foi observada em 19 (12,6%) casos.

3.3.2 Associação com a evolução de pacientes.

A relação entre estado biomarcador e desfecho do paciente foi explorada em ambos os modelos uni e multivariada . Neste grupo de pacientes, houve 112 mortes de todas as causas e 88 recorrências incluindo mortes específicos do cancro dentro de cinco anos [15].

TOP1

copiar o número, por si só, não foi significativamente associada com o OS, TTR ou LR (ver Tabela 4). Mais elevados CEN-2 número de cópias foram associados com melhor prognóstico com o OS como desfecho clínico na análise multivariada (HR: CI 0,38, 95%: 0,15-0,98, p = 0,04), enquanto que apenas uma tendência foi observada na análise univariada (HR : 0,49, ver Tabela 4)

Inicialmente, os pacientes abrigando

TOP1

aumentos (

TOP1

Gain, ver figura 3) foram comparados com aqueles sem (..

TOP1

normal). Ganho de

TOP1

não foi significativamente associada com o sistema operacional ou TTR tanto na análise univariada e multivariada (ver Tabela 4). Os pacientes com

TOP1

amplificações (

TOP1

/CEN-20≥2.0) foram inicialmente comparado aos casos não-amplificados (

TOP1

normal e

TOP1

não amplificados subgrupos de ganho combinado). A amplificação do

TOP1

não foi significativamente associada com o sistema operacional ou TTR, embora se aproximou de significado para a TTR na análise multivariada (HR: 0,50, 95% CI: 0,23-1,09, p = 0,08). Análise do

TOP1 amplificações em relação ao LR falhou devido a um número muito limitado de eventos. pontos de corte adicionais para ambas as combinações de sonda foram investigadas e os resultados estão listados na Tabela 4.

Após a análise primária dos dados, as amostras foram estratificados em subgrupos dependendo da presença e tipo de

TOP1

aumento (ver a Fig. 3, listados na Tabela 3). Como mostrado na Tabela 5, não foi observada diferença significativa entre o

TOP1

Normal,

TOP1

Não amplificados Ganho e

TOP1

subgrupos de amplificação com OS como endpoint, tanto no uni e multivariada análise. Com TTR como desfecho clínico,

TOP1

ganhos não amplificado mostrou uma tendência para menor TTR (HR: CI 1,57, 95%: 0,97-2,55, p = 0,07) na análise univariada, e uma similar, mas mais fraco, tendência observada na análise multivariada (HR: 1.49).

TOP1

amplificações não apresentaram qualquer relação significativa com a TTR quando comparado com o

TOP1

subgrupo Linha de base normal. Um gráfico de Kaplan-Meier para essas relações pode ser visto na Fig. 4B

A (esquerda):. OS, B (direita):. TTR

3.4 Scoring Diretrizes TOP1

A possibilidade de marcar menos núcleos na determinação do

TOP1

estatuto apresenta uma oportunidade para diminuir a carga de trabalho observador. Para determinar se isso era possível, o status de

TOP1

/CEN-2 e

TOP1

/CEN-20 foi determinada utilizando 10 ou 20 núcleos e comparados com o status rácio após a inclusão de todos núcleos relevantes. Como mostrado na Tabela 6, marcando um número reduzido de núcleos, como apenas 10 ou 20 núcleos para determinar

TOP1

/CEN-2 status (cut-off 1,5) amostras classificadas com concordância moderada (0,76 e 0,91, respectivamente), o que aumentou com a introdução de intervalos limítrofes, onde núcleos adicionais devem ser marcados (ver secção 2.5.1). Para a detecção de

TOP1 amplificações (cut-off: 2,0), a concordância foi relativamente alta (10 núcleos: 0.96, 20 núcleos: 0,99) e não foi melhorada com o uso de intervalos limítrofes. Além disso, cut-offs alternativas foram investigadas, cujos resultados são apresentados na Tabela 6.

Discussão

4.1 Mecanismos de TOP1 Copiar Número Aumente

Neste estudo, foram identificados quatro diferentes mecanismos de

TOP1

copiar aumento número. Na linha de células do painel mecanismos envolvendo

TOP1

e CEN-20 (Colo-205, HT29 e SW620), bem como um mecanismo em que

TOP1

foi adquirida independentemente do CEN-20 (KM12) , foram observadas. Em Colo-205 e SW620, foi observada cromossomo 20 aneusomy, de acordo com o NCI e SKY do NCBI /M-FISH e CGH banco de dados (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sky/skyweb.cgi). Este tipo de aumento transparece devido à segregação errada dos cromossomas durante a mitose, resultando em um número anormal de cromossomas; um estado cariotípica denominado “aneuploidia”.

Em HT29,

TOP1

ganho ocorreu de uma forma sugestiva da formação de um isochromosome, em linha com outros resultados [20]. Este mecanismo de

TOP1

de cópias do gene aumento número ocorre devido a um misdivision do centrómero (ruptura transversal, em vez de longitudinal) durante a segregação cromossoma, resultando num cromossoma com dois braços idênticos. Em KM12, um adicional de

sinal de TOP1

foi observada em um cromossomo que não abrigam um sinal CEN-20. No NCI e SKY /M-FISH do NCBI e CGH banco de dados, esta linha celular parece abrigar um cromossomo fusão de 22q e uma cópia adicional do 20q, onde CEN-20 (ou pelo menos as sequências de alfa-satélite alvo do CEN 20 sonda) não foi obtida juntamente com o resto de 20q. Este tipo de ganho pode ser o produto do cromossoma 20 aneusomy seguido por um evento de translocação Robertsoniana.

enquanto que o aumento do número de cópias do gene pode ocorrer devido a eventos que envolvem regiões cromossómicas maiores, tais como o ganho de cromossomas inteiros ou braços cromossómicos , que também pode ocorrer devido a amplificação do gene. amplificação do gene foi proposto para ocorrer através de vários mecanismos, incluindo erros na replicação do DNA e ciclos de quebra-fusion-ponte repetida devido à quebra de DNA de fita dupla ou disfunção dos telômeros [21] – [23]. Uma região cromossómica preferencialmente obtido através de amplificação é denominado um “amplicão”, um fragmento de ADN de aproximadamente 0,5-10 Mb de comprimento, e, geralmente, engloba gene (s) envolvido na promoção do crescimento do tumor [24]. Note-se que o cromossomo inteiro ou braço cromossomo alterações geralmente ocorrem com mais frequência, mas em menor magnitude, do que alterações cromossômicas menores [25].

No presente estudo,

TOP1

amplificação do gene foi definido como

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/CEN-20 proporção igual ou superior a 2,0. Esta definição significa que

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existe em níveis dobro do seu cromossoma hospedeiro. Portanto, este tipo de aumento de cópias do gene é provavelmente devido ao aumento do número de cópias de um fragmento amplificado e não as regiões cromossómicas braço de comprimento, uma vez que o seu mecanismo de aumento do número de cópias é independente do CEN-20. Sem

TOP1

amplificações foram observados nas linhas celulares investigadas nove, mas foi detectada em 10% das amostras de tumor. Isto poderia sugerir que ou este mecanismo é paciente-específica ou que este mecanismo não estava presente em nosso número limitado de linhas celulares investigadas. Amplificação do

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gene também tem sido relatada em pacientes com melanoma [26] e câncer gástrico [27].

Enquanto cada um dos mecanismos acima mencionados da

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número de cópias do gene aumentam ocorrer como acontecimentos individuais em linhas de células, os nossos resultados indicam que podem ocorrer simultaneamente em amostras de tumor. Em 4/15 (26,7%) casos de amplificação (dados não mostrados), CEN-20 aneusomy foi detectado, indicativo de um mecanismo de amplificação, bem como um ou envolvendo aneusomy isocromossomo formação. Em amostras classificadas como

TOP1

Não amplificados ganho, é possível que ambos os 20Q isocromossomos e cópias adicionais do cromossomo 20 estão presentes. No entanto, só é possível classificar as amostras de acordo com o mecanismo predominante.

4.2 Papel da 20q

Ganho do cromossomo 20 ou 20q tem sido amplamente divulgado como uma anomalia cromossômica recorrente em câncer colorretal [11 ], [28] – [33], suportando a alta frequência de

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ganhos não-amplificados observados neste estudo. Em modelos in vitro sugerem que o ganho de 20q desempenha um papel causal na tumorigénese, bem como num aumento das taxas de proliferação celular [34]. No cancro colorectal, acredita 20q para desempenhar um papel no adenoma colorrectal para a progressão do carcinoma [10] – [13] e é frequentemente observada em tumores exibindo o microssatélite fenótipos estáveis ​​e /ou cromossómicas instabilidade [32], [35], [36 ].