da arte abstracta
Apesar do recente avanço na medicina, quase 50% dos pacientes com câncer mostram recorrência colorectal de a doença. Embora as razões para a alta recaída não são totalmente compreendidas, a presença de células por quimioterapia e radioterapia do cancro resistente a haste /tronco-like, onde muitas oncomirs como microARN-21 (miR-21) são regulados positivamente, poderia ser um dos subjacente causas. miR-21 regula os processos de invasão e metástase de tumores por regulação negativa múltiplos /genes supressores metastáticos incluindo PTEN (fosfatase e homólogo tensina). proteína supressora de tumor PTEN controla a auto-renovação das células estaminais. Com efeito, os nossos dados actuais demonstram uma regulação negativa acentuada de PTEN em xenoenxertos de ratinhos SCID de miR-21 sobre-expressando células HCT116 do cancro do cólon. Colonospheres que são altamente enriquecidos em tronco cancerígenas /haste como células revelam o aumento miR-21 expressão e diminuiu PTEN. curcumina Difluorinated (CDF), um novo análogo da curcumina ingrediente dietético, a qual foi mostrada para inibir o crescimento de células cancerígenas do cólon resistente a 5-fluorouracilo + Oxaliplatina, regulada negativamente miR-21 em HCT116 do cancro do cólon quimio-resistentes e células HT-29 e restaurou os níveis de PTEN com conseqüente redução na fosforilação de Akt. Resultados semelhantes foram também observados em células de cancro do cólon SW620 metastático. Desde PTEN-Akt confere resistência a drogas a diferentes doenças malignas incluindo cancro colo-rectal, a nossa observação de normalização da via de miR-21-PTEN-Akt por CDF sugere que o composto pode ser um agente terapêutico potencial para o cancro colorrectal resistentes a quimioterapia.
Citation: Roy S, Yu Y, Padhye SB, Sarkar FH, Majumdar AP (2013) Difluorinated-curcumina (CDF) Restaura Expressão PTEN em células cancerígenas do cólon pela regulação negativa miR-21. PLoS ONE 8 (7): e68543. doi: 10.1371 /journal.pone.0068543
editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 28 Março, 2013; Aceito: 30 de maio de 2013; Publicação: 24 de julho de 2013
Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios ao Dr. Majumdar dos Institutos Nacionais de /Instituto Nacional de Saúde sobre o Envelhecimento (AG014343) e do Departamento de Assuntos de veteranos (VA Mérito revisão). Os financiadores desta investigação não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o desafio emergente no tratamento de câncer colorretal (CRC), o terceiro câncer mais comum, é a recidiva da doença. Quase 50% dos pacientes de CRC mostrar a recorrência da doença. A presença de-radioterapia quimioterapia e de haste do cancro resistente /células estaminais-like (CSCs /CSLCs) poderia ser uma das causas subjacentes [1]. Estas células são pequena população de células de tumor indiferenciado de iniciação possuindo capacidade de auto-renovação infinita e, portanto, são referidas como células tumorais iniciar [2]. PTEN (fosfatase e homólogo tensina), um gene supressor de tumor, foi reportado que desempenham um papel em células estaminais auto-renovação [3]. PTEN actua como uma fosfatase lípido para desfosforilar fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3), antagonizando a via de PI3-K /Akt. Regulação negativa de PTEN em diferentes tumores humanos foi mostrado resultar na resistência à terapia convencional e recorrência de cancro após tratamento inicial [4]. A via PTEN-Akt confere resistência a drogas a diferentes doenças malignas incluindo cancro colo-rectal [5], [6], [7], [8].
PTEN é uma das proteínas alvo do miR-21, que é regulada em muitos tumores, incluindo o câncer colorretal [9]. microARNs regular negativamente a expressão de genes alvo por clivagem de mRNA ou através da repressão tradução [10]. miR-21 não só regula o crescimento do tumor, mas também invasão e metástase alvejando múltiplos /genes supressores tumorais metastáticas, tais como PTEN [11]. Nós relataram que resistentes células HCT116 do cancro do cólon e HT29 [(CR) de quimio-resistentes] 5-fluorouracil e oxaliplatina (FU-Ox) exibem enriquecimento de CSCs /CSLCs e níveis elevados de madura miR-21 e que o miR-21 induzem stemness no cancro do cólon células [12]. Estas observações levaram-nos a procurar agente (s) que modulam eventos celulares que estão associados com o miR-21-indução de stemness em células cancerígenas do cólon.
curcumina Difluorinated (CDF), um análogo não tóxico da dietética curcumina ingrediente com uma biodisponibilidade muito maior do que o composto progenitor [13], [14], é um desses compostos. CDF foi mostrado para modular a expressão de miR-21 e PTEN no cancro pancreático [15], [16], [17], [18] e para inibir o crescimento de células cancerosas CR cólon, e induz a desintegração de colonospheres que sejam altamente enriquecido em CSCs /CSLCs [19]. Além disso, encontramos CDF para regular a expressão de miR-34 [20], o que é relatado para ser regulada negativamente em cancro do cólon [21]. Para determinar se a inibição CDF mediada do crescimento do cancro do cólon CR pode ser parcialmente atribuído a restauração de miR-21-PTEN-Akt eixo, examinámos (a) a relação entre o miR-21 e PTEN e (b) o efeito de CDF sobre a expressão de miR-21, PTEN e ativação do eixo Akt em diferentes células cancerígenas do cólon.
Materiais e Métodos
linhas de células e condições de cultura
o cólon humano células cancerosas HCT-116 (p53 tipo selvagem;
K-ras mutante
), HCT-116 (p53 nulo;
K-ras mutante
), HT-29 (mutante p53;
K-ras
em peso) e SW620 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). (CR) de células cancerígenas do cólon quimio-resistentes foram gerados no nosso laboratório, como descrito anteriormente [12]. Resumidamente, as células HCT116 e HT29 foram incubadas com uma dose clinicamente relevante de Ox-FU (25? M de 5-FU e 0,625 pM de oxaliplatina) durante 72 horas. O meio foi removido e as células aderentes, que sobreviveram ao insulto FU-boi, foram cultivadas em DMEM contendo FBS a 10% sem os fármacos durante 3 a 4 dias. O add-remove ciclo FU-Ox foi repetido 12 vezes. As células sobreviventes foram então passadas e expostos a doses mais elevadas de combinação de Ox-FU (100 uM de 5-FU + 2,5 pM de oxaliplatina) durante 2-3 semanas. Finalmente, as células quimio-resistentes foram mantidas em meio de cultura normal contendo 50 uM de 5-FU + 1,25 uM oxaliplatina. A linha celular de cancro do cólon SW620 foi mantida em meio RPMI, suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS)
Colonospheres foram gerados a partir de linhas de células HCT116 e HT29 parentais utilizando DMEM /F12. (1: 1) meio suplementado com B27 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), como relatado anteriormente [12] [22]. Resumidamente, as células foram deixadas a crescer em (meio de células-tronco) não-diferenciação da condição em placas de ultra-baixo de fixação (Corning Inc., Lowell, MA) durante 10-14 dias. O meio para mastócitos foi suplementado com B27 ,, 20 ng /ml de EGF (Sigma, St Louis, MO), 10 ng de factor de crescimento de fibroblastos /mL (Sigma), e antibiótico /antimicótico. Ao fim de 5 dias, as células estaminais apenas o tipo foram capazes de sobreviver em condições de não-aderentes, enquanto a não-haste como as células morreram. meios de células estaminais fresco foi fornecida para as células sobreviventes a cada 5 dias. Os esferóides formados foram fotografadas em 10 × ampliação. As células foram passadas utilizando 0,05% de tripsina-EDTA (Invitrogen) quando confluentes.
O tratamento de linhas celulares de cancro do cólon
CDF foi dissolvido em DMSO. Se for caso disso, CR HCT116, HT29 CR ou células SW620 foram tratadas com 100 nM de CDF durante 72 horas. As células de controlo recebeu 0,05% de DMSO. Após 72 h, as células foram submetidas a DNA, RNA e proteína isolada.
amostras de tecido Xenoenxerto
O protocolo de pesquisa animal foi aprovado pela Universidade Estadual Wayne Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) . Xenoenxerto derivado a partir de células HCT116, estavelmente transfectadas quer com o miR-21 ou o vector (pCMV), foram gerados em ratinhos SCID como descrito anteriormente [12]. (FFPE) tecidos de xenoenxerto embebidas em parafina fixadas com formalina foram usadas para ARN isolado utilizando o kit miRNeasy FFPE (Qiagen) tal como descrito anteriormente ARN [20].
em tempo real de RT-PCR
foi isolado a partir de tecidos FFPE utilizando o kit miRNeasy FFPE (Qiagen) e a partir de células em cultura utilizando o kit miREasy (Qiagen). Vinte nanogramas de ARN total foram transcrito reversamente em ADNc utilizando Universal cDNA Synthesis Kit (Exiqon, Woburn, MA) de acordo com o protocolo do fabricante. Para estimar os níveis relativos de ARNm de PTEN-, 500 ng de ARN foram transcritas inversa em ADNc utilizando o kit Gene Amp PCR ouro ARN (Applied Biosystems). PCR em tempo real foi realizada usando iniciadores específicos para o miR-21 (Exiqon) e PTEN [23] juntamente com SYBR
® verdes reagentes de PCR (Applied Biosystems). A quantidade relativa de miR-21 e PTEN-ARNm foram normalizados para RNU1α (Exiqon) e o gene β-actina humana, respectivamente.
análise Western blot
análise de Western blot foi realizada de acordo com o nosso padrão Protocolo [22]. Em resumo, as células foram lisadas; a concentração de proteína foi determinada pelo kit de ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad). Os lisados foram sujeitos a electroforese através de SDS-PAGE e as proteínas transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore) seguida de bloqueamento com BSA, à temperatura ambiente durante 1 h. Eles foram, em seguida, incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, subsequentemente lavadas e incubadas com anticorpos secundários compatíveis. As bandas de proteína foram visualizadas por ECL reagente privilegiada western blot detecção (GE Healthcare Biosciences). As membranas foram retirados conforme necessário para sondar ainda mais.
Luciferase Assay
células HCT116-CR foram transfectadas quer com anti-sense miR-21 ou um controlo negativo [NC] (Ambion), juntamente com o plasmídeo repórter luciferase ter sequência PTEN 3’UTR semente para miR-21 [11] e DNA plasmídeo controle de b-gal PMIR-REPORT (Applied Biosystems) usando Lipofectamine
TM 2000, de acordo com o protocolo do manufaturer. Seis horas após a transfecção, o meio foi mudado e as células transfectadas com NC foram incubadas com 100 nM de CDF durante 24 h. A actividade de luciferase foi determinada utilizando o kit de luciferase da Promega, seguindo o protocolo do Manufaturer. β-galactosidase foram realizados ensaios para normalizar a variabilidade transfecção. Os dados foram apresentados como atividade de luciferase relativo por proteína microgramas.
A análise estatística
Os resultados foram expressos em média ± SD. As comparações das variáveis contínuas entre dois grupos independentes foram calculados utilizando o teste t de Student bilateral. O valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
expressão de PTEN foi regulada negativamente em miR-21 sobre- expressando
xenoenxerto
PTEN é alvo de. oncomir miR-21. Para examinar a relação entre o miR-21 e PTEN, xenoenxertos de ratinhos SCID derivados de miR-21 sobre-expressando células HCT116 (MIR-21) e as células de controlo transfectadas com vector (pCMV) foram analisados para a expressão de miR-21 e PTEN . Como esperado, os dados de análise de qRT-PCR revelou que os níveis relativos de miR-21 foram significativamente mais elevados nos xenoenxertos de miR-21 sobre-expressando células HCT-116, em comparação com os controlos (Fig. 1a). Em contraste, os níveis de ARNm de PTEN em xenoenxertos de miR-21 sobre-expressando células foram significativamente diminuídos em comparação com os controlos (Fig. 1B). Tomados em conjunto, os resultados mostram uma relação inversa entre o miR-21 e PTEN. Esta observação é semelhante ao que foi observado anteriormente para os níveis de proteínas PTEN em 21-miR cancro do cólon HCT-116 hyperexpressing células (12).
quantitativo em tempo real de RT PCR foi realizada com ARN isolado a partir fixadas com formalina embebido em parafina xenotransplantes.
via PTEN-Akt é ativada em colonosphere
Colonospheres, considerados tumores substitutos, são altamente enriquecido em CSCs /CSLCs [22]. Para determinar se o miR-21 e sua PTEN proteína alvo estão envolvidos na regulação das propriedades funcionais de colonospheres, expressões de miR-21, PTEN e Akt, os efectores a jusante de PTEN foram analisados em colonospheres gerados a partir de HCT116 e HT29. Ambas as linhas de células HCT116 e HT29 formado esferóides bem arredondadas (Figs 2A . B; painel superior). Expressão de miR-21, como determinado por qRT-PCR, verificou-se ser 4-5 vezes superior em colonospheres, formado por ambas as linhas celulares, em comparação com as suas células parentais correspondentes (Figuras 2A . 2B; painel do meio). Por outro lado, a análise de Western-blot revelaram a diminuição da expressão de PTEN em colonospheres, em comparação com as células parentais correspondentes (Figuras 2A . 2B; painel inferior). Como esperado, a redução em PTEN em colonospheres foi associado com o aumento da activação de Akt, tal como demonstrado pelos aumentos marcados em concentrações relativas de P-Akt quando comparada com as células parentais correspondentes (Figuras 2A .. 2B painel inferior). Tomados em conjunto, os resultados sugerem que um aumento de miR-21 em colonospheres que leva à redução das PTEN activa via de sinalização de Akt, que pode desempenhar um papel na regulação das propriedades tumorigénicas das colonospheres que são enriquecidos em CSCs /CSLCs.
CDF restaura a expressão de PTEN em células de cancro do cólon
Anteriormente, demonstramos que CR células cancerígenas do cólon não são apenas enriquecido em CSCs /CSLCs mas também expressam níveis significativamente mais elevados de miR-21 do que os seus homólogos dos pais [12]. Desde CDF foi anteriormente mostrado para inibir o crescimento das células do cancro do cólon HCT116 CR e HT29, levou-nos a determinar se a inibição do crescimento induzida por CDF de células cancerígenas do cólon CR poderia ser atribuído a restauração do eixo de miR-21-PTEN-Akt. Com efeito, a expressão de miR-21 em CR HCT116 e células HT29 foi marcadamente diminuída quando foram incubadas com 100 nM de CDF, em comparação com os controlos correspondentes DMSO (Figuras 3A . 3B; painel superior). Isto foi associado com o aumento da expressão de PTEN e redução de pAkt (forma activada) em CR HCT116 e células HT29 (Figs 3A . 3B; painéis inferiores); nenhuma alteração aparente na forma não fosforilada (total) de Akt em células HCT116 quer CR ou CR HT29 foi observada em resposta a CDF (figuras 3A e 3B;. painéis inferiores). O efeito da CDF em miR-21 expressão de PTEN induzida foi confirmada pelo ensaio de luciferase. células CR-HCT116 foram transfectadas com a construção repórter da luciferase contendo PTEN 3’UTR miR-21 sequência de semente e subsequentemente incubadas com 100 nM de CDF durante 24 h. CDF aumentou significativamente a actividade da luciferase, relativamente ao controlo (Fig. 3C). Para fins de comparação, as células RC-HCT116 foram transfectadas com anti-sentido-miR-21, que revelou um aumento na actividade de PTEN-luciferase (Fig. 3C). Colectivamente, os dados mostram que em células de cancro do cólon CR, CDF sub-regula o miR-21 resultando em sobre-regulação de PTEN que leva à diminuição da activação de Akt. Estas observações sugerem que CDF restaura o eixo de miR-21-PTEN e Akt em células cancerígenas do cólon quimio-resistentes (CR).
Os controlos foram incubadas com DMSO. Western-blot (painel inferior) mostraram alterações nas concentrações relativas de PTEN, pAkt e Akt total, em células HCT116 e HT29 quimio-resistentes em resposta a CDF ou DMSO. (C) CDF tratamento ou anti-miR-21 aumenta a actividade de transfecção de luciferase em células HCT116 de quimio-resistentes transfectadas com construção de pGL3-Luc possuindo uma sequência de semente de PTEN-miR21. NC = Controle Negativo
Para analisar se outros CDF afetaria a expressão de miR-21- PTEN -. Eixo Akt no câncer de cólon metastático, foi realizado o mesmo experimento com linha de células SW620 que foi gerada a partir de tecido de câncer de cólon metástase. Tal como foi observado para células HCT116 e Cr-HT29, CDF causou uma redução marcada na expressão de miR-21 em células SW620 (Fig. 4). Isto foi associado com o aumento dos níveis de PTEN e redução na forma fosforilada da Akt, quando comparados com os controles correspondentes (Fig. 4).
ocidentais-borrões (painel direito) mostram mudanças na expressão relativa de PTEN, PAKT e Akt total em células SW620 seguinte 72 h de incubação com CDF ou DMSO (controlo). Human β-actina serviu como o controle de carregamento.
Discussão
Apesar do recente avanço na medicina, quase 50% dos pacientes com recidiva CRC show de tumor. Embora as razões para este facto não são completamente compreendidos, pode, em parte, estar relacionado com a incapacidade para alvejar CSCs /CSLCs que expressam marcadores de células estaminais do cancro, reter o potencial ilimitado para regenerar e são resistentes a terapias convencionais [24], resultando em quimioterapia-refractário tumores. Isso explicaria por que é difícil de erradicar completamente o câncer e por reincidência é uma ameaça sempre presente.
Embora amplamente acredita-se que as células-tronco do câncer surgir a partir de células-tronco ou progenitoras normais após mutação [24], uma melhor compreensão das alterações moleculares e bioquímicos associados com cancro de células estaminais é essencial para o desenvolvimento de terapias específicas. Nós relataram que o Cr células cancerígenas do cólon, que são enriquecidas em CSCs /CSLCs, prontamente formar esferóides e exibem expressão aumentada de miR-21, que tem sido mostrado para ser regulada positivamente em muitos tumores malignos, incluindo o cancro do cólon [12], [25] . Expressão de miR-21 na mucosa do cólon, também foi encontrada para aumentar durante o envelhecimento, quando a incidência de cancro colorrectal aumenta acentuadamente [26]. Embora o papel preciso de miR-21 na progressão da carcinogénese do cólon não é totalmente compreendido, relatamos o miR-21 para induzir stemness em células de cancro de cólon por regulação negativa do receptor de TGFp-[26].
Os resultados da nossa actual investigação demonstram que os colonospheres, que estão altamente enriquecidas em CSCs /CSLCs com aumento da expressão de miR-21 [12], [22], exibem diminuição da expressão da proteína supressora de tumor PTEN, um alvo de miR-21. Nossos dados atuais mostram também uma relação inversa entre o miR-21 e PTEN e apoia a afirmação de que o miR-21 regula a expressão de PTEN. A perda de PTEN, observada em miR-21 sobre-expressando células de cancro do cólon, poderia em parte ser responsável pela activação de Akt, tal como evidenciado pelo aumento dos níveis de pAkt em colonospheres. activação aumentada de Akt sinalização poderia desempenhar um papel crucial na aceleração do crescimento de xenoenxertos de células de cancro do cólon de miR-21 que sobre-expressam em ratinhos SCID, que relatou anteriormente [12] e podem conferir resistência a drogas a diferentes condições malignas, incluindo o cancro colo-rectal [5 ], [6], [7], [8].
miR-21 o potencial “oncomir” nós invocados para procurar agente (s) que pode ser efetivamente usado para regular negativamente miR-21 no câncer de cólon células e, assim, reduzindo o seu potencial tumorigénico. Justificativa para a prossecução desta linha de investigação vem de nossa recente observação de que a regulação baixa de miR-21 em células cancerígenas do cólon quimio-resistentes provoca diferenciação e tornando-os suscetíveis a agentes anti-câncer, especificamente difluorinated curcumina (CDF), um análogo do ingrediente alimentar curcumina com uma maior biodisponibilidade do que o composto progenitor [13], [14], [27]. Estudos recentes deste laboratório também demonstraram que CDF inibe o crescimento de células cancerígenas do cólon CR e também regula positivamente a expressão de miR-34, que é regulada negativamente em tumores do cólon [20]. Além disso, estudos anteriores demonstraram que CDF para modular a expressão de miR-21 e PTEN no cancro pancreático [18]. Assim, CDF pode ser considerado como um potencial agente terapêutico para ambos os cancros colo-rectais e pancreáticas. Além disso, a nossa observação de que modula eixo CDF-miR-21-PTEN Akt em ambas as células de cancro do cólon de p53-positivos e p53-negativa sugere que CDF poderia ser terapeuticamente eficazes em tumores p53-positivos e negativos do cólon. Curiosamente CDF também é encontrado para ser eficaz em restaurar os níveis de PTEN na linha celular de cancro do cólon SW620 metastático. Tomados em conjunto, os resultados sugerem que CDF poderia ser um agente terapêutico eficaz para diferentes fases do cancro do cólon. Addtionally, o facto de CDF modulação do eixo de miR-21-PTEN-Akt poderia ser observada em células cancerígenas do cólon quimio-resistentes que estão altamente enriquecidas em CSCs /CSLCs sugere que este novo análogo de curcumina também pode ser terapeuticamente eficaz para o cancro recorrente, que é conhecido por ser resistente à quimioterapia convencional [14].
em conclusão os nossos dados actuais demonstram que o miR-21 e PTEN estão inversamente relacionadas em que um aumento da expressão de miR-21 resulta em redução de PTEN que conduz a activação da sinalização de Akt. Estes eventos podem desempenhar um papel central na progressão tumoral. Além disso, a nossa observação de que miR-21 sinalização PTEN-Akt mediada poderia ser normalizado pela CDF em células cancerígenas do cólon quimio-resistentes sugere que CDF pode ser um agente terapêutico potencial para o cancro do cólon recorrente.
Reconhecimentos
pGL3-Luc era uma espécie de presente de Prof Tushar Patel, Ohio State University e Professor Goutam Ghosh Choudhury, UTHSCSA.