Abstract

cancro do ovário

epitelial (EOC) é o mais mortal das doenças malignas ginecológicas, devido em parte à sua metástase clinicamente ocultos . Portanto, a compreensão dos mecanismos que regem EOC disseminação e invasão pode fornecer novos alvos para terapias antimetastáticos ou novos métodos para a detecção da doença metastática. A proteína-quinase dependente de AMPc (PKA) é frequentemente desreguladas em EOC. Além disso, a actividade de PKA e localização subcelular por A-quinase ancorar proteínas (AKAPs) são reguladores importantes da dinâmica do citoesqueleto e a migração celular. Assim, procurou-se estudar o papel da função de PKA e AKAP tanto a migração de células EOC e invasão. Usando o biossensor membrana plasmática-dirigida PKA, pmAKAR3, e um ensaio de migração /invasão melhorada, mostra-se que a PKA é activado na vanguarda da migração de células SKOV-3 células EOC, e que a inibição de blocos de actividade de PKA migração de células SKOV-3. Além disso, mostra-se que enquanto a actividade de PKA dentro do bordo de ataque destas células é mediada por ancoragem de tipo-II subunidades reguladoras da PKA (RII), a inibição da fixação de qualquer RI ou RII subunidades de PKA bloquear a migração de células. Importante, que também mostram – pela primeira vez – que a actividade de PKA é regulada para cima no bordo de ataque de SKOV-3 de células durante a invasão de uma matriz extracelular tridimensional e, como pode ser visto para a migração, a inibição de qualquer actividade de PKA ou AKAP mediada por PKA blocos de ancoragem invasão da matriz. Estes dados são os primeiros a demonstrar que a invasão da matriz extracelular pelas células do cancro provoca a activação de PKA dentro do bordo de ataque invasiva e que tanto a actividade de PKA e de ancoragem são necessários para a invasão da matriz. Estas observações sugerem um papel para a atividade PKA e AKAP em EOC metástase

Citation:. McKenzie AJ, Campbell SL, Howe AK (2011) Protein Kinase A Atividade e ancoragem são necessários para a migração celular cancro do ovário e Invasão. PLoS ONE 6 (10): e26552. doi: 10.1371 /journal.pone.0026552

editor: Neil A. Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido

Recebido: 16 de junho de 2011; Aceito: 28 de setembro de 2011; Publicação: 19 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 McKenzie et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela concessão # R01GM074204 (para AKH) dos Institutos Nacionais de Saúde /Instituto Nacional de Ciências Médicas gerais (https://www.nigms.nih.gov) e de um pós-bolsa (a SLC) a partir do Centro de Câncer Vermont e Organização de Pesquisa do Câncer Lake Champlain (https://www.vermontcancer.org). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução câncer de ovário

epitelial (EOC) é a quinta causa mais comum de morte por câncer em mulheres nos Estados Unidos e tem a maior taxa de mortalidade de todos os cancros ginecológicos [1]. Aproximadamente 80% dos pacientes apresentam com doença fase tardia e menos do que 25% dessas mulheres são curados. EOC constitui a esmagadora maioria ( 90%) de neoplasias do ovário e é único na sua disseminação oculta clinicamente e metástase [2]. Em contraste com a maioria dos outros tipos de carcinoma, disseminação de EOC através da vasculatura e formação de metástases verdadeiramente distais é uma ocorrência rara. células EOC derramado a partir do tumor primário sobre a superfície do ovário e esfoliar na cavidade peritoneal. A colocação anatómica dos ovários facilita a disseminação local de EOC, que pode ocorrer por migração directa e invasão de células tumorais para e em órgãos adjacentes, bem como através do transporte de células tumorais esfoliadas por toda a cavidade peritoneal, através do fluxo de fluido peritoneal normal de [2] , [3]. Devido a este modo único e furtiva de divulgação, os esforços no desenvolvimento de métodos para a detecção precoce do EOC têm falhado [4], [5], [6]. Apesar de cirurgia, quimioterapia citoredutores combinação e estratégias para determinar marcadores biológicos, locais e células quimiorresistentes divulgados persistem e, eventualmente, prosperar, levando à alta recorrência e 25% de taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com EOC [3], [5], [7], [8], [9]. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares que regulam EOC invasão e disseminação tem o potencial para ter um impacto significativo sobre o curso da doença.

Devido à dependência de difusão EOC e metástases na migração celular e invasão , nosso laboratório tem se esforçado para entender os mecanismos subjacentes a estes processos em EOC. A migração celular é um processo altamente ordenou que exige um esforço coordenado entre numerosas proteínas em regiões subcelulares distintas [10], [11], [12]. Nós mostramos anteriormente que a proteína-quinase dependente de AMPc (PKA) é importante para a migração celular e a dinâmica do bordo de ataque de uma série de células [13], [14], [15]. PKA é uma cinase heterotetramérica que pode existir em duas isoformas, tipo I e tipo II, dependendo da isoforma da subunidade reguladora (RI e RII) associado com a holoenzima. PKA tem numerosos alvos associados com o movimento actomiosina baseado em células [16] e estudos iniciais demonstraram que hiper-activação ou inibição de PKA inibiu a migração quimiotáctica de células [16], [17], [18]. Este papel aparentemente contraditório de PKA foi clarificada pela demonstração de que, para além da actividade global, a localização da PKA no espaço sub-celular, mediada através da ligação de subunidades de PKA R a A quinase ancorar proteínas (AKAPs; [19], [20]) , regula a migração de células [13], [21], [22]. Especificamente, tem sido demonstrado que as subunidades e actividade de PKA são ambos enriquecidos em estruturas protrusivos no bordo de ataque de células que migram [13], [21], [22]. Além disso, largo inibição do tipo I e tipo II ancoragem (

ou seja

ancoragem através de RI ou subunidades RII) em geral [13], [21], ou inibição específica de proteínas de ancoragem individuais (

por exemplo,

AKAP-Lbc; [22]), inibe a migração. Estes e outros relatórios (revisto em [23], [24]), estabelecer a importância de localizar a atividade PKA para locais subcelulares distintas durante o processo migratório das células normais.

Sublinhando a importância potencial de PKA na patogênese do câncer de ovário são as observações que a atividade PKA e expressão subunidade são muitas vezes desregulados na EOC. A expressão da subunidade catalítica de PKA [25] e a subunidade reguladora RI [26], [27], [28] correlaciona-se com a fase avançada e /ou COE mais agressiva. Além disso, os níveis de mRNA de AKAP3 (

aka

AKAP110 ou proteína bainha fibrosa de 90 kDa (FSP90)) em tumores de ovário correlacionar positivamente com o estágio da doença e mau prognóstico [29], [30], enquanto dois outros AKAPs – AKAP1 (

aka

AKAP149) e AKAP13 (

aka

AKAP-LBC) – também parecem ser regulada para cima no EOC mucinoso (A. Howe, observações não publicadas a partir Oncomine). Apesar destas observações, o PKA significado funcional e sinalização AKAP em células metastáticas EOC não foi bem investigado.

Dada a importância da função de PKA e AKAP para a migração celular e sua desregulação em EOC, foi investigada a regulação espacial da atividade PKA na migração de células EOC e determinado se a atividade PKA e ancoragem são necessários para a migração celular EOC. Aqui, nós relatamos que a atividade PKA é regulado para cima na ponta de células EOC não só durante a migração, mas também durante a invasão da matriz extracelular, bem. Além disso, a inibição da actividade de PKA e migração de células AKAP blocos funcionais EOC e invasão. Estas observações demonstram, pela primeira vez, a importância da PKA ancoragem para a invasão da matriz e estabelecer a importância da actividade de PKA espacialmente regulados na migração e invasão – e, assim, talvez metástase – de células EOC

Materiais e Métodos.

Reagentes e Cultura de células

SKOV-3 e células COS-7 foram obtidas da American Type Culture Collection e mantidas em antibiótico livre de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% (vol /vol) de soro fetal de bovino (FBS). HIO-80 células foram uma generosa oferta do Dr. Andrew Godwin (Departamento de Oncologia Molecular, Fox Chase Cancer Center) e foram mantidas em uma mistura 01:01 de livre de antibióticos Médio 199: MCDB-105 suplementado com 4% FBS e 0,2 U /ml de insulina porcina. Todas as células foram cultivadas a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO

2. DMSO, citocalasina D e azul de tripano foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). GM6001 foram obtidas da Millipore (Billercia, MA). O fenol livre de vermelho de Matrigel e fibronectina humana foram adquiridos a partir de BD Biosciences (Bedford, MA). A inibição farmacológica da actividade de PKA foi conseguida utilizando H89 ou MPKI (Biomol). H89 é uma isoquinolona que compete com ATP para a ligação a PKA; apesar da utilização generalizada e a potência considerável, ela exibe especificidade única modesto para a PKA [31]. MPKI, um inibidor altamente específica PKA, miristoilada é um péptido, a célula-permeável compreendendo a região pseudo-substrato inibidora (aminoácidos 14-27) da proteína endógena da proteína quinase um inibidor (PKI) [14]. A inibição farmacológica da PKA ancoragem foi conseguida utilizando StHt31 (Promega), um péptido Stearated compreendendo o domínio de ligação de PKA R-subunidade de Ht31 (

AKA

AKAP-LBC); Assim, StHt31 actua como um inibidor competitivo de células-permeável da interacção entre AKAPs endógenos e ambos RII e, a concentrações ligeiramente mais elevadas, subunidades de PKA RI, [33] [32]. inibidores genéticos de atividade PKA e de tipo I ou tipo II PKA ancoragem são descritos abaixo.

Plasmids e transfecção

A codificação plasmídeo mCherry-fundido com o PKI proteína inibidora PKA (veja acima ) tem sido descrito anteriormente [14], enquanto plasmídeos que codificam GFP fundida com os inibidores de ancoragem do tipo I ou do tipo II (RI ancoragem disruptor (RIAD; [34]) e superAKAP

-in silico

(sAKAP

é

; [32], respectivamente), bem como a sua correspondente mexidos (

SCR

) controlos negativos, foram gerados utilizando os oligonucleótidos fosforilados a 5 ‘(Invitrogen) listados na Tabela S1 Especificamente,. oligos complementares foram recozidos, gerando 5 ‘

Sal

I e 3′

BamH

Eu extremidades pegajosas, em seguida, ligados diretamente em

Sal

I /

BamH

versões mCherry de RIAD e sAKAP

I-digerido pEGFP-C1 (Clontech). é

foram gerados substituindo o

Nhe

I-

BamH

Eu fragmento que codifica EGFP na respectivos plasmídeos com a

Nhe

I-

BamH

Eu fragmentar a partir pmCherry-C1. Para a transfecção e a expressão transiente de proteínas, as células foram transfectadas utilizando FuGENE6 (Roche) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 6 ul de FuGENE6 foi adicionado a 100 ul de soro e DMEM isento de antibiótico, brevemente agitada em vórtice, e incubou-se à temperatura ambiente durante 5 min. Um total de 1,5 ug de ADN foi adicionado à mistura, brevemente agitada em vórtice, e incubou-se à temperatura ambiente durante 15 min. A mistura foi então adicionada gota a gota a um prato de 35 mm contendo células em entre 80-90% de confluência, deixou-se repousar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos, depois voltou para a incubadora. Todas as experiências foram feitas entre as 24-48 h após a transfecção.

Imunofluorescência

Para a visualização de actina, fibronectina, paxilina, e subunidades de PKA Ria e RIIα, as células foram fixadas em formaldeído a 3,7% em PBS durante 10 min, permeabilizadas durante 10 min em PBS contendo 0,25% Triton x 100, bloqueadas com PBS contendo 3% de BSA, quer durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C e depois incubadas com anti-fibronectina (1:400, BD Transdução) , anti-paxilina (1:500, BD Transdução), anti-PKA Ria ou RIIα (Genetex 1:200 e BD Transdução 1:200 respectivamente) os anticorpos primários para 1 h, à RT. Após lavagem 3 x 5 min com PBS, as células foram incubadas com Alexa-594 burro acoplado anticorpo secundário anti-ratinho (Invitrogen, 1:400) e Alexa 488-faloidina conjugada (Invitrogen, 1:100) durante 1 h à TA. As lamelas foram montadas em lâminas de vidro para microscópio (Fisher) usando um pequeno volume de PermaFluor montagem (Thermo Scientific). imagens de epifluorescência foram capturados apesar de 10, 20, 40, e objectivos 60X Plano Apo num microscópio Nikon Eclipse TE-2000E invertido utilizando os filtros apropriados específicos de fluoróforo (Chroma Technology Corp, Rockingham, VT) e uma câmara CoolSnap HQ (Photometrics, Tucson , AZ), controlada por software Elements (Nikon).

migração de cicatrização ensaio

lamelas de vidro foram esterilizadas por imersão consecutivo em intervalos de 30 min em concentrações crescentes (70, 95, 100%) de EtOH. As lamelas de cobertura foram removidas a partir de EtOH e seco ao ar no capuz de cultura de tecidos. Uma vez secas, as lamelas de cobertura estéreis foram revestidas em 20 ug /ml de fibronectina humana diluída em PBS estéril, quer durante a noite a 4 ° C ou 2 horas a 37 ° C. Uma monocamada confluente de células foi semeado em ECM lamelas conjugados e deixadas aderir durante a noite. Uma ferida foi feita na monocamada por raspagem de uma ponta de pipeta estéril P200 através das células, e as lamelas foram lavadas uma vez com PBS estéril para remover todos os restos de células. As imagens foram adquiridas utilizando um Plano de Apo objetiva de 10x no microscópio invertido Nikon Eclipse TE-2000E como descrito acima.

Trypan Blue Exclusão Ensaio

Para avaliar a viabilidade celular, uma mistura 01:01 de tripano azul (0,4%, Sigma) e meio isento de soro contendo 1% de BSA foi adicionada às células e incubou-se à temperatura ambiente durante 10 min imediatamente após a remoção de um ou outro do donut ou criando o ferimento na monocamada. As imagens foram tiradas da periferia da rosca e ao longo de toda a margem da ferida usando uma objectiva de 10X Plano Apo na Nikon Eclipse TE-2000E, como descrito anteriormente.

A fabricação de juntas de silicone

quarenta g de Sylgard 184 elastômero de silicone (Ellsworth Adhesives) e 4 g de Sylgard agente de cura 184 elastômero foram rigorosamente misturados até nublado com bolhas. A mistura turva foi vertida para uma placa de 10 cm de cultura de tecidos estéril até uma profundidade de 2-4 mm de altura. As bolhas foram removidos, colocando o prato num recipiente de 850 ml Desi-Vac (Fisher) e evacuação da câmara 60 vezes e permitindo que a câmara se em repouso durante 10 min. Este passo foi repetido duas vezes ou até a mistura estar livre de bolhas. A mistura de silicone foi deixada a curar à temperatura ambiente durante 48 horas ou durante uma hora sobre uma placa de aquecimento de 84 ° C até ficar completamente polimerizada. O molde de silicone foi removido gentilmente o prato e colocado sobre uma superfície limpa e seca apropriada para o corte. Para fabricar o anel de vedação em forma de anel, uma biópsia por punção 6 milímetros foi utilizado para produzir um cilindro de silicone, e um perfurador de biópsia de 2 milímetros foi utilizado para fazer um buraco mais pequeno no centro do cilindro de 6 mm. O silicone “donuts” foram então lavadas em Liquinox (diluído 1:10 em água nanopura) durante 15 min, lavadas 10 vezes com água nanopura, lavou-se com EtOH a 70% durante 15 min, em seguida, armazenado em fresco de EtOH a 70% até ser necessário.

Donut migração /invasão Ensaio

lamelas de vidro estéreis foram revestidos com 20 ug /mL de fibronectina, tal como descrito acima. Limpos, donuts de silicone esterilizados foram deixados a secar ao ar antes de colocar sobre as lamelas revestidas. Uma mudança na refracção na interface donut lamela pode ser visto como o donut adere por contacto conformada. -confluentes foram privadas de soro a noite antes do ensaio. As células foram tratadas com tripsina e ressuspensas em meio isento de soro adequado contendo 1% BSA e contadas utilizando um hemocitómetro. As células foram plaqueadas a confluência (células de 6000 /de rosca para SKOV-3, células COS-7, e HIO-80) num volume de 10 uL utilizando uma ponta de gel de carregamento estéril para o centro do anel de vedação em forma de rosca, de modo a contê-los dentro de uma área restrita. O número de células necessárias para formar uma monocamada confluente depende da ECM escolhido, o diâmetro do poço interno da rosca, e a capacidade de estiramento das células, e, portanto, tem de ser determinado empiricamente para cada linha celular. PBS estéril foi adicionado em torno da junta de vedação para evitar a evaporação do pequeno volume de meio. Depois de aderir durante a noite, o PBS foi aspirado, e os donuts foram cuidadosamente removidos com pinças estéreis. Os núcleos foram coradas utilizando Hoescht 33342 corante nuclear (Invitrogen, 1:2000 em meio) durante 15 min a 37 ° C. O meio de coloração foi removida e substituída por qualquer meio completo ou meio contendo agentes farmacológicos, tal como descrito nas legendas das figuras. Para os ensaios de invasão, a monocamada de Hoescht-corada foi coberta com Matrigel livre de vermelho de fenol e incubadas durante 15 min a 37 ° C para permitir a polimerização. As células foram então incorporados suplementado com meio completo ou tratados como no ensaio de migração. As imagens iniciais foram adquiridos através de uma objectiva 2X PlanApo em um microscópio invertido Nikon Eclipse TE-2000E, como descrito acima. As células foram tratadas com 10 ng /mL de EGF ou alta de soro (10%) para estimular a migração. Imagens adicionais foram adquiridos após os tempos indicados e pares iniciais e finais de imagem estado foram analisados ​​usando as configurações padrão de uma macro ImageJ personalizado escrito (DonutQuant disponíveis como texto S1). Resumidamente, os centros de macro e os limiares de ambas as imagens iniciais e finais estaduais, em seguida, remove as células de extrema-outlier,

ou seja

células fora as monocamadas circulares que são demasiado longe para ser imputável à migração (

por exemplo

células que afrouxaram e flutuou no de outra área do prato). A máscara da imagem centralizada, inicial é então criada e sobreposta na imagem estado final e todos os núcleos fora da fronteira da máscara de imagem inicial são contadas como células migraram.

FRET imagem

células SKOV-3 que expressam o biossensor actividade de PKA, pmAKAR3 [35], [36] foram lavadas e mantidas em Leibovitz L-15, meio para a imagiologia de FRET. As células foram fotografadas em uma Nikon Eclipse TE-2000E microscópio com uma lente objetiva de 60 × /1.4 NA Plano de Apo de imersão em óleo e arrefeceu câmera CCD. PCP, YFP e as imagens foram adquiridas FRET 10 horas após o início do ensaio. A aquisição foi definido com a exposição de 700 ms e 2 × 2 binning para todas as três aquisições. Imagens em cada canal foram submetidas a subtração de fundo, e proporções de cor amarela-a-ciano foram calculados usando o plugin FRET Analyzer ImageJ. imagens PseudoColor foram gerados usando ‘ratio’ do ImageJ olhar para cima da tabela. Imagens foram usando o recurso “background Subtrair” em ImageJ subtraído-fundo, com um raio bola rolar de 500.

Resultados

atividade PKA é aumentada na vanguarda de migrar aleatoriamente SKOV-3 células

os trabalhos anteriores tinham demonstrado activação discreto de PKA na vanguarda migratória de muitos [13], [21], [22] mas não todos [37] tipos de células. Para determinar se a PKA foi activado na vanguarda da migração de células do EOC, SKOV-3 células EOC humanos foram transfectadas com pmAKAR3, um plasma dirigido à membrana FRET biossensor para a actividade de PKA [21], [36], em seguida plaqueadas em FN-revestido lamelas de vidro, estimuladas com 10 ng /ml de EGF para 4-6 horas (para promover aleatória, a migração quimiocinética), e acompanhados por imagens ao vivo de células. actividade de PKA (como indicado por índices elevados FRET) era, de facto, de forma discreta e dinamicamente elevada dentro do bordo de ataque da migração de células SKOV-3 (Figura 1 e Filme S1). Isto sugeriu que os aumentos locais na actividade de PKA desempenhar um papel na regulação da dinâmica de ponta, e, assim, a migração de células activamente migrar EOC. Esta hipótese foi suportada por precoce, experiências exploratórias nas quais as células SKOV-3 foram sujeitos a cicatrização de feridas ensaios ou migração zero na ausência ou na presença de inibidores amplamente utilizados de actividade de PKA (H89 e MPKI; ver Materiais e Métodos)) e de ancoragem (StHt31; ver Materiais e Métodos). O exame da morfologia celular logo após o início destes ensaios mostraram efeitos significativos destes inibidores sobre a morfologia do bordo de ataque e de migração (Figura S1). Especificamente, as células não tratadas migraram para áreas feridas de forma eficiente e com ampla, agitando lamelip�ios (Figura S1A e D). Em contraste, as células em que a actividade de PKA foi inibida com o H89 inibidor de PKA não-selectivo ou do inibidor altamente selectivo MPKI não migrar de forma eficiente e mal entrou no espaço da ferida, apresentando levando estruturas borda desprovidas de plissados ​​mas rife com adesões focais – evocando um adesivo, espalhando fenótipo mais do que um de migração (Figura S1B e D). As células em que a PKA ancoragem foi interrompido pela StHt31 entraram no espaço da ferida para uma extensão maior do que H89- ou células tratadas com MPKI mas, ao contrário das células de controlo, exibiram múltiplas, espaçadas de forma irregular-agitando bordas por célula (Figura S1C e D). Juntos, esses resultados apoiaram ainda a hipótese de que a migração de células EOC pode exigir atividade PKA e ancoragem e justifica uma investigação mais aprofundada utilizando abordagens mais sofisticadas e reagentes específicos.

SKOV-3 foram transfectadas com pmAKAR3, semeados em fibronectina revestido pratos durante a noite, estimuladas com 10 ng /mL de EGF para 4-6 h, e, em seguida, digitalizado por microscopia de FRET. As imagens foram capturadas a cada 30 seg, então pseudocolored de acordo com a relação de FRET (escala de cores mostrado na armação 0 ‘): essa montagem retrata quadros 2 min de intervalo. Por toda a sequência, ver vídeo S1. Scale bar = 5 mm.

migração celular EOC é regulada pela atividade e ancoragem de PKA

ensaios de migração de cicatrização de feridas, enquanto barato e fácil de implementar, sofrem de várias limitações, não é a menos do que são lesão fatal para as células ao longo da frente de ensaio e remoção da matriz extracelular subjacente (ECM). Assim, uma condição experimental que resulta na migração ineficaz neste ensaio podem reflectir, por exemplo, sensibilidade elevada a danos ou falha espectador para produzir

de novo da matriz em que a migrar. Por conseguinte, a mais e melhor explorar o requisito da actividade de PKA e de ancoragem, especificamente para a migração celular EOC, nós desenvolvemos uma versão melhorada de um ensaio de migração anteriormente descrito [38] que podem ser facilmente e com precisão mede o número de células que migram de um modo radial a partir de um monocamada definido circular (Figura 2; ver Materiais e Métodos para detalhes). Nosso ensaio – cunhou o ‘ensaio de donut’, após as juntas de silicone em forma de rosquinha utilizados para estabelecer a monocamada – é confiável e barata, fácil de implementar, aplicável a praticamente qualquer tipo de célula, e escalonável para alcançar relativamente alto rendimento e significância estatística usando um pequeno número de células (~6000), em relação a outros ensaios comparáveis ​​”libertação” (

por exemplo

-cicatrização de feridas ensaios). Além disso, ao contrário dos ensaios de cura de feridas, a nossa abordagem reduz significativamente tanto o desnudamento da proteína da MEC que cobre a superfície de migração (Figura S2) e a lesão fatal para as células na periferia do ensaio (Figura S3). Para aumentar a utilidade e facilidade de implementação do ensaio, desenvolvemos um macro ImageJ ( ‘DonutQuant’; veja S1 texto) para quantificar de forma rápida e automaticamente a migração. Resumidamente, o macro subtrai uma, ‘tempo = 0 “imagem inicial (feita imediatamente após a remoção donut) de uma imagem mais tarde ou final e conta os núcleos fora” tempo = 0’ área de (Figura 2C e D). Experiências utilizando citocalasina D para inibir a dinâmica de actina (Figura 2C e D), assim como a mitomicina C para inibir a progressão do ciclo celular (dados não mostrados) confirmou que o ensaio mede a migração e não simplesmente deslocamento da monocamada por divisão celular. Nós temos utilizado este ensaio para medir a migração de uma grande variedade de tipos de células (incluindo células CHO-K1, COS 7, HIO-80, as HUVEC, MCF7, MCF10A, MDA-MB-231, MDCK, NIH3T3, REF52, e SKOV-3) com facilidade comparável e efeito (A. McKenzie, S. Campbell, A. Howe, observações não publicadas).

(a) representação esquemática do ensaio de migração de donut em que as células são semeadas a confluência em uma matriz extracelular lamela de vidro -Revestido dentro de uma junta de silicone em forma de donut. Após as células aderiram de forma estável, a junta de vedação é removido, permitindo que as células para migrar radialmente. Imagens da monocamada são capturados imediatamente após a remoção de donut e em qualquer ponto de tempo depois de que é adequado para permitir a migração de uma dada linha celular. Uma macro ImageJ personalizada utiliza a imagem inicial como uma máscara subtractiva para determinar o número de células que migraram na imagem final tomada no final do ensaio. Os pormenores são apresentados em Materiais e Métodos. (B) Uma imagem de cinco juntas de donut em uma única lamela 25 mm; Isso permite a instalação fácil de ensaios replicados para aumentar o rendimento e gerar dados estatisticamente significativos. (C) As células COS-7 foram sujeitos ao ensaio de migração de donut, na presença de 2 uM de citocalasina D (cytoD) ou DMSO como um controlo do veículo. Imagens representativas tomadas no início (0 hora) e no final (20 h) do ensaio, bem como imagens mascarado (final menos iniciais) que descrevem células que migraram são mostrados. (D) O número de células COS-7 de células migradas foi calculada utilizando o ImageJ macro como descrito em Materiais e Métodos. Os dados representam a média ± D.P. de cinco anéis de espuma por lamela com três lamelas separadas por tratamento. (* = P 0,001).

Usando este ensaio, foram investigados os efeitos da inibição da PKA ou função AKAP sobre a migração celular EOC por transfecção Skov-3 células com plasmídeos que codificam proteínas fluorescentes (EGFP, mCherry ) fundida ao péptido inibidores da actividade de PKA ou de ancoragem (ver Materiais e Métodos). Especificamente, utilizou-se o mCherry Proteína Fluorescente fundida com o pKa proteína inibidora PKI (mCherry-PKI) para inibir a actividade de PKA [14], e EGFP fundido com o disruptor de ancoragem RI (RIAD) [34] e superAKAP

é

(sAKAP

é

) [32] peptídeos para interromper especificamente do tipo I e tipo II PKA ancoragem, respectivamente. Os plasmídeos que codificam mCherry sozinho ou EGFP fundido a mexidos RIAD ou sAKAP

é

sequências foram usados ​​como controles negativos. Estes reagentes permitem que geneticamente codificados excelente especificidade na inibição de actividade de PKA [14] ou a inibição de ancoragem através de RI e RII subunidades [32], [34], enquanto que permite a detecção e monitorização de células tratadas por meio de microscopia de fluorescência. Distinguir entre tipo I e tipo II de ancoragem é apropriado e necessário, como tipo-I e actividade de tipo II de PKA pode regular vias de sinalização distintas [19], [20] e, enquanto ambos os tipos de PKA têm sido implicados na migração em outros sistemas [13], [21] – [23], [39], nem foram avaliados no contexto de cancro do ovário migração

após a transfecção, as células foram submetidas ao ensaio de migração de donut e, depois. 24 horas, o número de células que migraram transfectadas, bem como o número total de células transfectadas e número total de células que migraram (transfectadas e não transfectadas) foi quantificada (Figura 3). Aquisição destes três números permite a expressão de migração como a percentagem de células que migraram, transfectadas pelo total migrado das células ( “MX /TM ‘) ou, para controlar as diferenças na eficiência de transfecção entre plasmídeos, a percentagem de migração, as células mais transfectadas o número total de células transfectadas ( “MX /TX ‘). Usando este método, SKOV-3 de migração foi significativamente atenuada quando qualquer actividade de PKA (Figura 3A e B) ou de fixação (Figura 3C) foi inibida utilizando os reagentes genéticos acima descritos. Curiosamente, a migração foi inibida quase igualmente por rompimento da ancoragem, quer através de RI ou subunidades RII (Figura 3C), consistentes com relatos anteriores que estabelecem a importância de ambos tipo I e tipo II PKA ancoragem na migração de outros tipos de células [13] , [21], [22], [39]. Em resumo, estes dados estabelecem a necessidade de actividade de PKA e de ancoragem para a migração de células de AOE.

(A) células SKOV-3 foram transfectadas com o plasmídeo mCherry vazio ou mCherry-PKI, em seguida, sujeitas a migração de donut ensaios. Representante thresholded imagens das células migraram (migrado, com núcleos pseudocolored verde), a população total de células transfectadas (Transfectados), e uma sobreposição destas duas imagens são mostradas. Inserções representam ampliações das áreas indicadas pelos quadrados nos painéis superiores. Assim, no total migrado das células ( “TM”) são representadas em verde, no total transfectadas as células ( “TX”) são descritos no vermelho, e os núcleos amarelo retratam as células que migraram, ou seja, migraram e transfectadas células transfectadas ( ‘MX’) . (B) Para células transfectadas com mCherry vazio (MCH) ou mCherry-PKI (PKI), a percentagem média (± D.P.) de células transfectadas migraram mais o número total de células que migraram ( “MX /TM ‘) foi calculado. Para normalizar para a eficiência da transfecção, a percentagem média (± D.P.) de células transfectadas migraram mais o número total de células transfectadas ( “MX /TX ‘) foi também calculado. (* = P 0,05) (C) células SKOV-3 foram transfectadas com plasmídeos que codificam EGFP fundido com inibidores de tipo I (RIAD) ou tipo-II (SAIS) PKA ancoragem, ou seus respectivos controles mexidos (RIAD SCR, Sais SCR), em seguida, sujeitos a ensaios de migração de donut e análise, como descrito em (a e B). (** = P 0,001)

Type-II PKA é responsável por liderar a atividade PKA borda durante a migração

Dado que a atividade PKA foi enriquecido na vanguarda da migração SKOV- 3 células e que a inibição da actividade de PKA e ancoragem através de RI e RII atrofiado migração, procurou-se determinar se de ponta a atividade PKA foi mediada através de qualquer tipo I ou tipo II ancoragem. Para avaliar o efeito de, pelo RI ou RII-AKAP ancoragem interrupção sobre a localização da actividade de PKA durante a migração EOC, as células SKOV-3 foram co-transf ectadas com plasmídeos que expressam pmAKAR3 e inibidores genéticos de tipo-I e II-ancoragem do tipo R-subunidade (RIAD e sAKAP

é

, respectivamente) fundido a mCherry. A fluorescência espectros mCherry não se sobrepõe com os de qualquer YFP ou PCP e, assim, permitir que essas disruptores de ancoragem marcados fluorescentemente a ser usado em conjunto com microscopia de FRET. Uma vez transfectadas, as células foram sujeitas ao ensaio de migração de donut durante 10 horas, onde sobre as células foram fotografadas através de microscopia de FRET como descrito acima. As células que expressam tanto o disruptor de ancoragem e PKA repórter transfectadas plasmídeos foram fotografadas e as imagens PCP, YFP, fricção, e mCherry foram adquiridos. Para quantificar a percentagem de células que exibem actividade de PKA conduz borda, a proporção média de FRET no bordo de ataque (FRET

LE; medido 5-25 | iM a partir da frente da célula) foi medido em proporção com a relação de FRET no citoplasma (FRET

cito; medido 25-50 uM a partir da frente da célula (Figura 4E)). valores da relação foram binned em alta (FRET

LE /FRET

cito ≥1.5), moderada (FRET

LE /FRET

cito entre 1,2 e 1,5), e não (FRET

LE /FRET

cito 1,2) atividade PKA ponta.