Abstract

Fundo

A metástase é um processo pelo qual as células cancerosas aprendem a formar tumores satélites em órgãos distantes e representa a principal causa de morte dos pacientes com tumores sólidos. NSCLC é o câncer mais letal humana, devido à sua alta taxa de metástase.

Análise

Metodologia /Principais Achados

A falta de um modelo animal adequado, até agora dificultado de progressão metastática. Examinámos c-Myc para a sua capacidade para induzir metástases em um modelo de rato C-RAF-conduzido para o cancro do pulmão de células não-pequenas. c-MYC sozinho induziu o crescimento do tumor franca só depois de longa latência em que as mutações secundárias tempo em K-Ras ou LKB1 foram detectados reminiscência de NSCLC humano. Combinação com C-RAF levou a aceleração imediata do crescimento do tumor, a conversão de células epiteliais papilares e indução interruptor angiogénico. Além disso, a adição de c-myc era suficiente para induzir a macrometástase nos gânglios linfáticos e do fígado com curta latência associada com eventos de troca de linhagem. Assim geramos o primeiro modelo condicional para metástase de NSCLC e identificaram um gene, c-MYC que é capaz de orquestrar todas as etapas deste processo.

Conclusões /Significado

potenciais marcadores para a detecção de metástases foram identificados e validados para o diagnóstico de biópsias humanas. Estes marcadores podem representar alvos de intervenção terapêutica futura à medida que incluem genes tais como GATA4 que são expressos exclusivamente durante o desenvolvimento do pulmão

Citation:. Rapp UR, Korn C, Ceteci F, Karreman C, Luetkenhaus K, Serafin V, et ai. (2009) Myc é um Gene Metástase para Non-Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 4 (6): e6029. doi: 10.1371 /journal.pone.0006029

editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Canadá |

Recebido: 29 Abril, 2009; Aceite: 25 de maio de 2009; Publicação: 24 de junho de 2009

Direitos de autor: © 2009 Rapp et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Krebshilfe – Fundação Mildred Scheel (concessão 106253) e pelas DFG (subvenções TR17). Emanuele Zanucco foi apoiado por uma bolsa da Iniciativa de Excelência alemão para a Escola Superior de Ciências da Vida, Universidade de Würzburg. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a metástase é um processo de múltiplos passos complexo pelo qual as células do tumor primário se tornar capaz de entrar e sair da vasculatura, resolver em locais distantes e, eventualmente, a crescer tumores secundários macroscópicas [1]. Pensa-se geralmente que a conversão metastático é um processo conduzido mutação. Uma série de genes e produtos de genes foram identificados que afectam positivamente ou negativamente a probabilidade de linhas de células de tumores humanos estabelecidos a metástase [2], [3], [4]. Os produtos génicos incluem receptores do factor de crescimento e os seus elementos de cascatas de transdução de sinal intracelulares. Reguladores de polaridade celular representam uma segunda classe de genes que podem promover metástases [5], [6]. Através da utilização de uma linha celular de cancro de pulmão do rato, carcinoma do pulmão de Lewis (LLC), uma terceira categoria de reguladores de metástases foi recentemente descrito que sublinhou a importância da inflamação como uma força motriz [7]. Além disso, o candidato a metástase indutores ou -suppressing genes também incluem genes que codificam micro RNAs que regulam conjuntos de genes associados a proliferação, invasão ou migração de [8], [9].

Enquanto o trabalho com as linhas celulares de tumores humanos in camundongos tenha sido esclarecedor, falta de conhecimento sobre o seu repertório de genes do cancro, bem como a incapacidade para estudar a cinética de progressão tumoral espontânea nesses modelos limitar a sua utilidade. Temos, portanto, estabeleceu um modelo de rato para o câncer de pulmão de células não pequenas humano (NSCLC) em que adenoma pré-malignas é induzida por um

RAF

transgene especificamente expressos em tipo alveolar pulmonar II células epiteliais [10]. NSCLC é o câncer de pulmão humano mais freqüente ea principal causa de morte por cancro no homem. Geração de camundongos compostos que carregam, além de

RAF

outros transgenes que codificam proteínas que modulam as vias de sinalização freqüentemente alterada em NSCLC humana permitiu-nos a desvendar dois passos fundamentais no processo de metástase, a indução do interruptor angiogênico e progressão para micrometástases associada a reprogramação dos genes seletor intestinais [11]. β-catenina foi identificado como o indutor interruptor crítica para ambos os passos, e também promoveu o crescimento invasivo [11].

50% de NSCLC humana portadores de mutações em genes que codificam activadores da cascata mitogénica (RAS-RAF- MEK-ERK) [12] e esta cascata é conhecido por induzir um gene alvo de beta-catenina, c-myc [13], decidimos analisar directamente a capacidade da proteína c-MYC para promover a progressão do tumor no nosso murino RAF-driven modelo de cancro do pulmão. Além disso MYC era um candidato porque ele foi conhecido por afetar a reprogramação em tumores com base em nossas descobertas anteriores do RAF cooperação /MYC no sistema hematopoiético murino [14], [15]. Nos seres humanos, a amplificação e rearranjos de genes Myc foram encontrados numa fracção do NSCLC [16]. Vários grupos começaram a avaliar c-MYC em modelos de ratos com NSCLC. Endógeno c-Myc está envolvido em NSCLC induzida por K-Ras não metastático como foi demonstrado por utilização de um mutante c-myc negativo dominante [17]. expressão ou função de c-Myc transgénicos demonstrou indutível cooperação com mutante K-Ras na progressão do tumor para vários graus de [18], [19], mas nenhum dos modelos deu origem a metástases. Aqui, mostramos que a expressão constitutiva ou induzível de c-Myc para além de C-RAF em células tipo II é suficiente para induzir rapidamente metástases para os nódulos linfáticos e do fígado. Combinando os transgenes c-myc e C-Raf causada aparência de um interruptor fenotípica de células cubóides para papilares alveolar /colunares epiteliais (APEC) que são as células tumorais que crescem mais rapidamente e também predominam na metástase do fígado. Além disso c-Myc induz a produção de VEGF por células tumorais que conduzem a vascularização do tumor com os vasos que são incomuns mosaicos contendo PECAM-1 positivos e PGP 9.5 células endoteliais positivas. PGP 9.5 foi anteriormente conhecido como um marcador de células neuroendócrinas imaturas [20]. conversão metastático por c-MYC pode ser reconstruído em cultura de células usando células A-549 NSCLC não-metastáticos e infecção por um retrovírus MYC transdução.

Resultados

c-MYC coopera com C- RAF em causar câncer relacionado morte

Para testar se a C-RAF e c-MYC cooperar na transformação do pulmão tipo de células epiteliais II in vivo, ratos SPC-C-RAF Bxb foram cruzados com SPC-c-MYC transgênico ratos. Observação por um período de ≥2 anos demonstrou morte acelerada no composto (SPC-C-RAF bxb /SPC-c-myc) murganhos (Figura 1A), embora o grau de aceleração era menos do que observado anteriormente no sistema hematopoiético com MYC /RAF retrovírus [21]. No entanto, os ratos composto teve uma latência média que diferiu significativamente camundongos transgênicos única SPC-c-MYC por análise de log-rank. O exame histológico em diferentes pontos de tempo revelou que ratos transgénicos individuais diferiam na sobrevida livre de tumor. Considerando SPC-C-RAF bxb ou ratinhos composto foram tumor uniformemente positiva às duas semanas de idade, os ratinhos transgénicos simples SPC-c-myc desenvolveram tumores tardio e com penetrância incompleta indicando que c-myc não é limitante da taxa de proliferação de células do tipo II e /ou que as células que respondem são eliminados por apoptose (Figura 1B).

(a), lote de Kaplan-Meier para SPC-C-RAF bxb (n = 24), SPC-c-myc (n = 52 ), composto (n = 35) e de tipo selvagem (n = 28) ratinhos de controlo da mesma ninhada. Log-rank análise por cento de sobrevivência para ratos composto vs SPC-C-RAF Bxb = p 0,05; SPC-C-RAF bxb vs SPC-c-myc = p 0,0001; ratinhos composto vs SPC-c-myc = p 0,0001. n: número de animais. (B) a incidência de tumores em SPC-C-RAF bxb (n = 51), SPC-c-myc (n = 30), ratinhos composto (n = 109) e de tipo selvagem da mesma ninhada de controlo de ratinhos (n = 58). Log-rank análise de sobrevida livre de tumor de SPC-C-RAF Bxb vs SPC-c-MYC = p 0,0001; ratinhos composto vs SPC-c-myc = p 0,0001; tipo selvagem vs SPC-c-myc = p 0,0001. n: número de animais. (C) cinética da progressão tumoral. secções de tumor de pulmão representativos corados com hematoxilina e eosina (H E). A caixa amarela e setas destaca adenoma de células cubóide (inserção) em camundongos SPC-C-RAF Bxb; a caixa vermelha e as setas indicam células pleomórficas (inserção) em camundongos SPC-c-myc e as caixas brancas mostram um adenoma de células colunares (inserção) em camundongos compostos. Para a avaliação da capacidade de invasão na interface tumor-estroma, as áreas em caixa do terceiro painel são ampliados no painel inferior. Genótipos e idades de ratos, conforme indicado. aglomerados de células tumorais pequenas isoladas ao redor do tumor principal foram indicados com setas vermelhas. Barra de escala: 100? m. (D, E) H E coloração de secções de pulmão embebidos em parafina a partir do composto (D) e os ratos SPC-c-MYC único transgénico (E) mostrando tumores papilares em bronquíolos. Idade de ratinhos, como indicado. (F) a progressão desmoplásico de tumores de pulmão de um rato composto. Idade de ratinhos, como indicado. barra de escala, 100 mm.

lesões pré-malignas em SPC-c-MYC única ratinhos transgénicos

Antes de início de malignidade franca no SPC-c-Myc individuais aglomerados ratos transgênicos de células pleomórficas são detectados nos pulmões que são potenciais fontes de metástases de células de iniciação (MICS) (Figura 1C). Curiosamente, aglomerados pleomorfo em pulmões de sobreviventes a longo prazo foram geralmente diminuído ou completamente ausente (dados não mostrados). A fim de caracterizar estas potenciais lesões pré-malignas, a expressão de genes que regulam a proliferação e desenvolvimento do pulmão foi examinada por imunocoloração (figura S1). Como esperado, forte nuclear c-Myc e a expressão de C-RAF em baixos níveis endógenos foi detectada nestes agregados (Figura S1). células pleomórficas proliferam como julgado a partir da coloração PCNA e tem uma taxa elevada de apoptose que é presumivelmente responsável pela sua falta de expansão hiperplásico (Figura S1 e S2 Figura), que também define estas lesões além de hiperplasia adenomatosa atípica (AAH). Os marcadores de pneumócitos tipo II são mantidos nos focos positivo c-Myc incluindo Gata6 que acciona um TTF-expressão [22]. Em contraste GATA4 e seus mucina do gene alvo não são expressos (Figura S1). Dos efectores a jusante do Gata6-TTF-1 cascata único pro SP-C, mas não ccsp é expresso em níveis baixos, quando comparado com pneumócitos tipo II do lado de fora dos aglomerados demonstrando a ausência de células-tronco alveolares bronco (BASCs) (Figura S1) [ ,,,0],23]. expressão de c-Myc em cachos pleomorfo está associada com a indução da proliferação e apoptose (Figura S1 e S2 Figura). Na verdade, utilizando um doxiciclina (DOX) indutível transgene c-myc, observou-se a apoptose massiva após a indução de um dia e extensa perda de tecido pulmonar quatro semanas após a indução (Figura S3A-S3C). O prolongamento do período de indução levou à formação de clusters pleomórficos e tumores pulmonares papilares isolados (Figura S3D-S3E).

A seguir, olhou para Aquaporin 5 expressão que é compartilhado entre o tipo I e tipo II pneumócitos [24] e achei que fosse mantido em clusters pleomórficos (Figura S1). Para obter mais insights sobre características progenitoras dessas células, foi analisada uma série de marcadores de vias de desenvolvimento. Estes incluem HNF-3SS, Sox9 [20], e factores que são notoriamente envolvidos em células estaminais ou progenitoras, tais como Bmi-1 [25], SS-catenina e Id2 [20]. Todos estes genes foram encontrados a ser expresso (Figura S1). Id2 foi descrito para mediar a sinalização de Myc em conjugação com uma proteína do retinoblastoma [26]. Conclui-se que as células da alta c-MYC expressam grupos têm características de células progenitoras, mas diferem de BASCs.

Salvamento e crescimento acelerado do c-MYC tipo transformado II pneumócitos por C-RAF

contrastam com os pulmões de camundongos transgênicos única SPC-c-MYC que só desenvolvem lesões pré-malignas, nódulos tumorais em pulmões de composto ou camundongos transgênicos individuais tarde SPC-c-myc foram se expandindo rapidamente e frequentemente continham tumores macroscópicos com células cilíndricas que estavam ausentes em SpC adenomas -C-RAF Bxb-driven (Figura 1C). Várias linhas de evidência indicam que as células colunares surgem a partir de células cubóides em ratinhos compostos. Em primeiro lugar, a incidência tumoral em duas semanas e dois meses de idade é a mesma para os ratos de compostos SPC-C-RAF bxb único e SPE-C-RAF bxb /SPC-c-myc (Figura 2A). Em segundo lugar, células cilíndricas surgem principalmente dentro de focos tumorais cubóide (Figura S4A). Finalmente, as células colunares pode ser rápida e frequentemente induzida in vivo por tratamento de DOX de ratinhos transgénicos compostos triplos (SPC-C-RAF bxb /SPC-rtTA /Tet-O-c-myc) (Figura S4B e S4C). Para testar a reversibilidade de c-myc expressão do transgene DOX foi removido de uma semana após a indução por um período de quatro semanas (Figura S4D). A análise histológica do tumor do pulmão fotografada mostraram persistência de células colunares no centro de um tumor remanescente que de outra forma exibe um fenótipo cubóide (Figura S4D). A extensão do período de observação após a remoção DOX a 10 semanas de eliminação de células colunares demonstradas em tumores de todos os ratinhos analisados ​​(dados não mostrados). Comparação de carga tumoral entre ratos e camundongos que foram retirados DOX por dez semanas depois de um período de indução quatro semanas não mostraram diferenças significativas induzidas continuamente (dados não mostrados). Estes dados sugerem que um “choque de retirada oncogene” -Efeito [27] é responsável pelo desaparecimento de APEC embora reversibilidade do cubóide induzida-MYC para colunar interruptor fenotípica é uma possibilidade alternativa.

(A) Tumor incidência no SPC-C-RAF Bxb (azuis abertas quadrados) e camundongos compostos (triângulo aberto do vermelho). Cada símbolo representa um pulmão. Os valores foram normalizados para o tamanho do pulmão para compensar as diferenças de idade. Não há nenhuma diferença significativa entre as médias. (B) Percentagem de células positivas pro SP-C que são PCNA positivos. Os valores representam a média de SD. Genótipos e categorias de tumor são indicadas da seguinte forma: SPC-C-RAF Bxb cubóide (azuis abertas quadrados), composto cubóide (quadrados em vermelho) e composto colunar (vermelho círculos abertos). Cada símbolo representa um tumor. (C) duas semanas e dois meses de idade os ratinhos foram injectados diariamente com BrDU durante uma semana e perseguidos durante um dia. Parafina secções de pulmão embutidos de camundongos transgênicos única e compostos SPC-C-RAF Bxb foram duplamente coradas para BrDU (verde) e Ki67 (vermelho) para identificar as células em ciclo. DAPI coloração destaca tumores pulmonares. Barra de escala: 100? M. (D, E) Percentagem de células BrdU e Ki67 positivas nos tumores de ambos os genótipos em diferentes idades. 30 tumores a partir de 3 ratinhos foram analisados ​​por genótipo. Os valores representam a média de SD. (F) O volume do tumor foi calculado medindo a área do tumor assumindo uma forma esférica de tumores. Símbolos representam tumores individuais. Cada coluna representa um mouse. Genótipos e categorias de tumor são como descrito em B. Todos os tumores a partir de cada uma das categorias foram comparados entre os genótipos. Os valores representam a média de SD. As diferenças estatísticas entre os grupos, como indicado. ns: Não

tumores papilares significativas crescer mais rapidamente do que os tumores cubóides de ambos os genótipos. Consistentemente a fracção de células que expressam PCNA positivas, pró SP-C foi maior em tumores papilares (Figura 2B). Dados semelhantes foram obtidos por BrDU e rotulagem de Ki67 (Figura 2C-2E). Como esperado a partir dos dados de proliferação, os volumes dos tumores aumentou mais rapidamente em tumores papilares de ratos compostos (Figura 2F). Para caracterizar adicionalmente as células colunares que são a imagem de marca de adenocarcinoma avançado, que foram digitadas para marcadores de linhagem de células progenitoras e, como no caso das lesões pré-malignas em ratinhos transgénicos simples SPC-c-myc. Semelhante a aglomerados pleomorfismo, células colunares em focos de tumor no início a partir de ratinhos composto expressa marcadores de células progenitoras (figura S5A). Uma diferença principal no entanto foi o elevado nível de expressão de C-RAF do transgene que medeia salvamento de crípticas transformantes de c-Myc a partir de apoptose (Figura S2A e S2B) conduzindo a expansão de focos tumorais no início. Em contraste, os aglomerados pleomorfo em ratinhos compostos foram semelhantes àqueles nos pulmões de ratinhos transgénicos único SPC-c-myc em termos de taxa de apoptose (dados não apresentados). A expressão de marcadores de células progenitoras em focos tumorais de murganhos composto também diferem na expressão Id2 em fases tardias de tumor quando as células positivas eram muito raros (Figura S5B). Estes dados são consistentes com relatos de uma função supressora de tumores de Id2 no epitélio intestinal, onde dirige a diferenciação [28]. Uma terceira diferença refere-se a homogeneidade da expressão do transgene. Considerando c-myc foi uniforme em todos os clusters pleomórficos, C-RAF e c-MYC expressão do transgene em focos tumorais colunar foi heterogênea e diminuiu em estágios tardios (Figura S5b), sugerindo a flutuação da expressão genética [29]. Finalmente, como é o caso dos aglomerados pleomorfo e em adenomas SPC-C-RAF BXB [30], BASCs não foram detectados em estádios precoces ou tardias em tumores (Figura compostos S5A e S5B).

c-myc promove a progressão do tumor concomitante com a angiogênese, na ausência de transição epitelial mesenquimal (EMT)

em aceleração ratos compostos tumor foi histologicamente evidente em todas as idades analisadas com tumores pulmonares frequentes não invasivos macroscópicas que estavam ausentes no SPC-C-RAF Bxb camundongos transgênicos individuais (Figura 1C painéis inferiores). tumores pulmonares macroscópicas geralmente eram do tipo papilífero e classificados como adenocarcinoma. Em casos raros (2 em 50 casos para cada genótipo) encontramos tumores papilares oclusão bronquíolos e exemplos de desmoplasia em composto e camundongos transgênicos individuais SPC-c-Myc, recursos adicionais que são uma reminiscência de patologia NSCLC humana (Figura 1D-1F).

c-myc foi relatada para induzir angiogénese [31]. Aumentou significativamente os níveis de vasos sanguíneos e linfáticos foram detectados em tumores de pulmão de composto e SPE-C-MYC único ratinhos transgénicos (Figuras S6A-C). O mecanismo de indução interruptor angiogênico por c-MYC não envolve interferência com a expressão da caderina-E em contraste com nossos achados anteriores destacando ß-catenina [11] como nenhuma ß-catenina nuclear foi detectado (Figura S5C). células Além disso mastócitos que são necessárias para a angiogénese Myc induzida em tumores de ilha pancreática ([17] estão ausentes de adenocarcinomas do pulmão em ratinhos de ambos os genótipos (dados não apresentados). Em vez disso, a expressão de VEGF foi detectado em células tumorais de tumores pulmonares de SPC-C -MYC individuais transgénicos ou ratinhos compostos (Figura S7A). Myc também é capaz de induzir o VEGF em células humanas em cultura a-549 e mouse MLE-15 NSCLC (Figura S7B). Os dados combinados indicam que Myc induz angiogénese por sobre-regulação de VEGF em células NSCLC.

uma observação surpreendente foi feita quando nós exploramos potenciais características neuroendócrinas da nossa NSCLC por coloração com PGP 9.5. PGP 9.5 é um marcador neuroendócrino imaturo e um marcador tumoral candidato para NSCLC humana, onde é expressa em células de tumor a partir de .. 70% de fase II e tumores IIIA [32] no nosso modelo de NSCLC, a maior parte das células tumorais são negativas para esta enzima deubiquitinating em todas as fases independentes de genótipos (dados não mostrados) em vez disso, a coloração parece marcar vasos nos tumores primários do SPC-c-MYC única transgênicos e ratos composto (comparar Figura S6D). Em co-coloração fato de secções tumorais com PGP 9.5 e PECAM-1 mostrou colocalisation destes marcadores nas mesmas embarcações (Figura S6E). A fim de examinar se PGP 9.5 é um marcador de angiogênese patológica, nós também coradas secções de pulmão do tipo selvagem, onde a coloração foi encontrado exclusivamente em grandes embarcações, mas não nos capilares (Figura S6E), em conformidade com uma recente publicação que mostra a expressão do PGP 9.5 em humanos artérias carótidas [33]. Nossos resultados são o primeiro relatório sobre ocorrência de tais células endoteliais na vasculatura do tumor.

O interruptor angiogênico, presumivelmente, não foi acompanhado por típica mesenquimais transição epitelial (EMT) nas bordas tumorais como nós não detectar células duplamente positivas para pro SP-C e vimentina ou pró SP-C e N-caderina (Figura S8B). Além disso junções E-caderina de células cilíndricas em tumor permaneceu intacta (Figura S8A). Consistentemente não observamos frentes invasivos em tumores papilares (Figura 1C). Em vez disso, os grupos isolados de células de tumor foram encontrados na vizinhança dos tumores primários reminiscentes de migração colectiva [34] (Figura 1C).

tumores longa latência em ratinhos SPC-c-myc são positivas para

K Ras

ou

LKB1

mutações

como a cinética de desenvolvimento do tumor foi adiado em camundongos SPC-c-Myc, em comparação com SPC-C-RAF Bxb ou ratos compostos eo número de tumores final por pulmão era mais baixo (Figura 3A), procurado para mutações secundárias. Tendo em vista este objectivo, um painel de genes (Texto S1) que são frequentemente alteradas em NSCLC humano foi examinada num conjunto aleatório de tumores a partir de dez murganhos que levaram à identificação de mutações pontuais frequentes em

K-Ras e

genes LKB1

(Figura 3B). A maioria dos

K-Ras

mutações eram do exão 1 e foram heterozigotos. Houve um caso de uma mutação exão 2 (Figura 5B) e em três casos sem mutações foram encontradas em

K-Ras

ou quaisquer outros genes no painel exceto

LKB1

(Figura 3B) . Na verdade mutações no exão 6 do presente supressor de tumor que é mutado em 34% de NSCLC humano [35] foram encontradas em cada um dos três

K-Ras

tumores pulmonares SPC-c-myc negativos (Figura 3B). Apenas em um dos casos foram

LKB1 viajantes – e

K-Ras viajantes – mutações encontradas para coexistir. Neste exemplo, foi observada uma mutação diferente da

LKB1

que estava presente em ambos os alelos (Figura 3B). Em todos os outros casos,

K-Ras

mutações ou presença de oncogênico C-RAF eram mutuamente exclusivas com

LKB1

mutação (Figura 3B). Este achado pode sugerir que K-Ras /C-RAF sinalização em células tipo II podem normalmente levar a inativação deste supressor de tumor. Uma relação similar foi encontrada entre o

K-Ras

mutações e presença de oncogênico C-RAF, consistentes com o padrão mutuamente exclusivo de

RAF

e

RAS

mutações em tumores humanos [36] [37] (Figura 3B).

(a) Tumor incidência por pulmão em ratinhos SPC-c-myc como uma função da idade. O número de animais são de 17 para 2 meses, 10 para 6-10,5 meses e 15 para 13-17 meses. Cada símbolo representa um pulmão indivíduo. Note-se que a ordenada é focos /cm

2 ao contrário de mm

2 na Figura 2. (B) Ocorrência de

K-Ras Comprar e

LKB1

mutações no pulmão primário tumores. 10 escolhidos aleatoriamente ratinhos positivos tumores foram examinados por um painel de genes candidatos (

EGFR

,

K-Ras

,

B-RAF

,

C-RAF

,

p53

,

Pi3K

,

PTEN

,

Akt

e

LKB1

). Mostrado aqui são dados para

K-Ras Comprar e

LKB1

, os únicos genes do painel em que foram encontradas mutações. Zigosidade é como indicado. camundongos individuais são listados por números de identificação para facilitar a comparação entre as tabelas.

Myc é suficiente para induzir metástase

Como vimos anteriormente progressão para micrometástases em camundongos SPC-C-RAF Bxb em que provocou a angiogênese por ablação de E-caderina, examinamos os ratos para a metástase em diferentes idades. Surpreendentemente múltipla macroscópica Fígado (Figura 4A e 4B) e foram observados linfáticos metástases Nó- (Figura 4C), já em dez meses de idade em composto (SPC-C-RAF Bxb /SPC-c-MYC) e SPC-c- MYC únicos animais trasngenic. ratinhos composto desenvolvido metástase significativamente mais cedo, em maior incidência do que SPC-c-myc único ratinhos transgénicos (Figura 5A). Considerando que em nódulos linfáticos macro e micro metástases foram vistos, apenas foram encontradas macro metástases no fígado. linfonodo e metástases hepáticas foram eventos independentes como eram metástases macro e micro sugerindo que a metástase iniciar células (MICs) podem ser diferentes para cada categoria (Figura 5A). Além ratinhos transgénicos simples SPC-c-myc, DOX expressão indutível de c-Myc que dá rapidamente origem a tumores nos pulmões papilares sobre o fundo C-RAF BXB (Figura S4) foi examinada para geração de metástases. Esses camundongos desenvolveram tumores pulmonares (Figura S9A) e metástases hepáticas (Figura S9C e 9D) composta de células cilíndricas. Coerente com a frequência de metástase em ratos constitutivos, em uma coorte de 10 ratos compostos induzíveis que foram induzidas 11-12 meses, um rato desenvolvido metastastasis hepática macroscópica e um segundo animal foi positivo para micro metástases em um linfonodo regional (Figura S9B) . Um grupo de controlo de ratinhos com a mesma idade (não induzido) que eram 14-17 meses de idade não mostram metástase (dados não mostrados). Semelhante a ratinhos constitutivos, secções de metástases do fígado de ratinhos compostos indutíveis (SPC-C-RAF bxb /SPC-rtTA /Tet-O-c-myc) foram positivas para pro SP-C e pan-citoqueratina (Figura S9e e S9F). Em contraste com os ratinhos constitutiva, a metástase do fígado em ratos compostos indutíveis provocou uma resposta pronunciada do estroma que separa o tecido do tumor a partir de fígado normal (Figura S9D). aglomerados nomeadamente, nessa zona fronteiriça rica em estroma isoladas de células tumorais que foram positivas para pan-Cytokeratin ou pro SP-C estavam presentes (Figura S9e e S9F) consistente com a invasão de migração coletiva [34]. Após exame do estado mutacional de K-Ras, um 1mutation exão foi encontrada em tumores primários de pulmão e metástases do fígado correspondente (dados não mostrados).

(a) O exame de metástases do fígado (esquerda) a partir de um SpC- c-MYC rato transgénico única. Um fígado normal (direita) de um único rato transgénico não metastático SPC-C-RAF Bxb. (B) H E de coloração de cortes de fígado embebidas em parafina de murganhos compostos SPC-c-myc e. secções representativas de papilar e metástases císticas são mostrados. áreas em caixa são mostrados em maior ampliação. Idades e genótipos, como indicado. Barra de escala: 100? m. (C) Coloração de fígado e metástases em linfonodos de camundongos compostos, para marcadores como indicado. Metástases de ratinhos SPC-c-myc foram indistinguíveis quando comparado com ratinhos compostos para os mesmos marcadores. áreas circulado em linfonodos marcar metástases (M). Barra de escala: 100 mm

(A) Resumo do padrão de metástase para ratinhos transgénicos única e compostos SPC-c-Myc.. Os animais são listados individualmente pelo número de identificação e agrupados de acordo com o genótipo. A idade média do aparecimento de metástases entre os grupos é significativa (p = 0,03). (B) Ausência de

K-Ras

mutação no macrometástase da RAF /MYC e tumores /MYC pulmonares RAS. N.m: sem metástase. n.d .: não feito. Δ: Exclusão. -:. Negative

Se a expressão aguda da c-MYC é suficiente para a conversão metastático, em seguida, a introdução em células NSCLC não-metastáticos deve gerar clones metastáticos. Para testar esta possibilidade foram empregados células A-549 humanos. Uma elevada de c-Myc que expressam um 549-clone de células (A-549 J5-1) (Figura 6A) foi injectado subcutaneamente em ratinhos imunodeficientes RAG1

– /- ratos. A incidência (Figura 6B) e taxa de crescimento local do tumor (Figura 6C) foi aumentada por expressão MYC, a tal ponto que os animais tiveram que ser sacrificados após seis semanas. Apesar de este período de tempo limitado da experiência, foi observada a metástase do pulmão e fígado em baixa frequência (Figura 6 D e 6E). Análise de secções de pulmão de ratos inoculados células A-549 J5-1 mostraram expressão de frango MYC em metástases do pulmão confirmação da origem das células (Figura S10). Os dados combinados estabelecer c-myc como uma forte indução de metástases gene para NSCLC.

(A) A coloração por imunofluorescência de células A-549 infectadas com v-myc frango vírus expressando J5 mostra expressão MYC (vermelho). DAPI marca núcleos. Barra de escala: 50 ^ m. (B) a incidência de tumores de controlo e MYC células que expressam A-549 seis semanas após a injecção subcutânea. O número de animais (n) são como indicado. (C) Monitorização do crescimento do tumor durante seis semanas de período. Os tumores foram medidos semanalmente. células que expressam MYC deu origem a tumores estatisticamente maiores na RAG1

– /- ratos. Os valores representam a média de SD. *: P 0,05. n = 17 ratinhos para cada grupo. (D) Análise de metástases. Parafina secções embebidas de pulmão, nódulo linfático e de tecidos do fígado de ratinhos transplantados foram rastreados para a metástase utilizando anticorpo citoqueratina-7 (CK-7). Para demonstrar a especificidade de expressão da CK-7 em células A-549 tumores primários foram corados na ausência (controlo negativo) ou na presença (controlo positivo) de anticorpo CK 7. Para cada órgão pelo menos 3 secções foram coradas e cuidadosamente selecionados, pelo menos, por duas pessoas. n = 17 ratinhos para cada grupo. Barra de escala: 50 ^ m. (E) incidência de metástases. LN:. Linfonodo

Uso de mutações em tumores primários de camundongos transgênicos única SPC-c-MYC para o rastreamento de linhagem de metástase

A descoberta de frequentes

K-Ras Comprar e

LKB1

mutações em tumores de pulmão, principalmente de camundongos transgênicos única SPC-c-MYC sugeriu que poderia ser capaz de usar dados de mutação para a linhagem rastreamento. Por isso, examinou o DNA de metástases do fígado e nódulos linfáticos para as mutações presentes nos tumores primários. Surpreendentemente, no caso de

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mutações, quatro dos cinco casos de c-Myc derivadas de tumores metástases que poderiam ser examinadas desta forma foram negativos para a mutação como foi a um caso de um rato composto que tinha um

K-Ras

mutação exão 1 em que o tumor primário e as metástases para nódulos linfáticos (Figura 5B). No entanto, um dos cinco casos de

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c-MYC tumor metástase derivada positiva foi positiva para o mutante

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. A mutação foi idêntico ao que no tumor do pulmão. Este rato tinha múltiplas metástases de órgãos que incluem além do fígado, rim, pâncreas e cérebro. Além disso, metástases em locais diferentes partilhada expressão de marcadores pulmonares. Figura S11 mostra que as células positivas dispersas pro SP-C estão presentes na metástase no fígado, pâncreas, cérebro e rins. Além disso, no rim, proteína de secreção de células Clara (ccsp) células tumorais positivas foram detectadas (Figura S11). Em um caso de um

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tumor de pulmão -mutant que deu origem a metástases hepáticas, a metástase resultados negativos para a mutação. O facto de que as mutações presentes nos tumores primários de pulmão são quase ausente nas suas metástases hepáticas sugere fortemente que a metástase é um evento precoce.

A histopatologia de metástases a partir de ratinhos transgénicos simples e compostas SPC-c-myc

em metástases exame histopatológico de ambos os genótipos foram indistinguíveis, exceto por sua abundância (Figura 4A e 5A). Em ambos os casos, encontramos dois tipos de metástase nos gânglios linfáticos hepáticos e, papilar e cística-papilar misto (Figura 4B). Comumente as duas formas coexistem no mesmo órgão alvo (Figura S12). Se essas duas formas podem interconvert ou se os cistos são formas precursoras iniciais de metástase cística-papilar mista é actualmente desconhecida. Barra de escala: 50 ^ m. Barra de escala: 50 ^ m.