Abstract

Fundo

Há boas evidências na literatura de que o sistema canabinóide é perturbado no cancro colorectal. No presente estudo, nós investigamos se CB

1 receptor intensidade imunorreativa (CB

intensidade 1IR) está associada com a gravidade da doença e resultado.

Metodologia /Principais Achados

CB

1IR foi avaliada em, espécimes embebidos em parafina fixadas em formalina recolhidos com uma intenção consecutivo durante o tumor primário ressecção cirúrgica de uma série de casos diagnosticados com câncer colorretal. centro de tumor (n = 483) e na frente invasiva (n = 486) CB

1IR foi pontuado de 0 (ausente) a 3 (coloração intensa) e os dados foram analisados ​​como uma divisão mediana ou seja CB

1IR 2 e ≥2. Em microssatélites estável, mas não microssatélites tumores instáveis ​​(como julgado com base na determinação imunohistoquímica de quatro proteínas de reparo mismatch), houve uma associação positiva significativa do grau do tumor com o CB

intensidade 1IR. A diferença entre os tumores estáveis ​​e instáveis ​​microssatélites para esta associação de CB

1IR estava relacionado com o CpG insularidade metilação dos casos. As análises de Cox de regressão indicou uma contribuição significativa de CB

1IR para a sobrevivência específica da doença nos tumores estáveis ​​microssatélites ao ajustar para o estágio do tumor. Para os casos com tumores estáveis ​​fase II microssatélites, houve um efeito significativo tanto do centro do tumor e CB frente

1IR na sobrevida específica da doença. As probabilidades de sobrevida livre de eventos em 5 anos foram: 85 ± 5 e 66 ± 8%; interior do tumor, 86 ± 4% e 63 ± 8% para o CB

1IR . 2 e CB

1IR≥2 grupos, respectivamente

Conclusões /Significado

O nível de CB

1 na expressão do receptor de cancro colorectal está associada com o grau do tumor de um modo dependente do grau de CpG hipermetilação. A alta CB

1IR é indicativo de um pior prognóstico em pacientes com tumor estáveis ​​II microssatélites estágio

Citation:. Gustafsson SB, Palmqvist R, Henriksson ML, Dahlin AM, Edin S, Jacobsson SOP, et al. (2011) High tumor canabinóide CB

1 Receptor Imunoreatividade impacta negativamente Disease-Specific Sobrevivência na Fase II de microssatélites Estável câncer colorretal. PLoS ONE 6 (8): e23003. doi: 10.1371 /journal.pone.0023003

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 29 Dezembro, 2010; Aceito: 11 de julho de 2011; Publicação: 25 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Gustafsson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores agradecer ao Conselho de Ciência sueca (Grant não 12158, medicina, CJ Fowler.); Sociedade Sueca de Câncer (Grant não CAN2008 /856, R. Palmqvist;. Grant não CAN2010 /437, C. J. Fowler.); e os fundos de pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade Umeå (C. J. Fowler) para apoio financeiro. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O canabinóide acoplados à proteína G

1 (CB

1) receptores são mais conhecido por seu papel na mediação dos efeitos psicotrópicos procurados pelos usuários recreativos de cannabis. No entanto, Cb

1 os receptores e os seus endógena ligandos anandamida (arachidonoylethanolamide) e 2-araquidonoilglicerol mediar uma variedade de efeitos no corpo, incluindo a regulação da dor, formação de osso, homeostase de energia e função gastrintestinal [1] – [4]. No cólon humano, CB

receptores de 1 encontram-se no epitélio da cripta, bem como em células inflamatórias subepiteliais, no músculo liso de vasos sanguíneos e no plexo submucosa [5], [6], onde modulam a, entre outras funções , a taxa de trânsito intestinal e propulsão do cólon [4].

Além das funções descritas anteriormente, o sistema endocannabinoid actua como um “danos limitante” sistema para mitigar os efeitos de situações patológicas. Este parece ser particularmente verdadeiro para o sistema endocannabinoid gastrointestinal. Deste modo, a inflamação induzida por agentes tais como o ácido 2,4-dinitrobenzeno sulfónico, ácido sulfónico trinitrobenzeno, óleo de mostarda ou de sódio de sulfato de dextrano é mais pronunciada em CB

1

– /- ratos do que nos seus companheiros de ninhada do tipo selvagem, enquanto o tratamento com um agonista do receptor de CB, ou com compostos que bloqueiam a remoção celular e o metabolismo de endocannabinoids, alivia a inflamação [7] – [11]. Um

um polimorfismo do receptor CB (1359 G /A) está associado com uma susceptibilidade reduzida à colite ulcerativa no homem [12], embora para o nosso conhecimento, ainda não se sabe como este polimorfismo de um único nucleótido afecta sinalização canabinóide. focos de criptas aberrantes no cólon, uma alteração patológica no início da sequência de adenoma-carcinoma colorrectal no desenvolvimento do cancro, são formados como um resultado de tratamento azoximetano em ratos, e o tratamento é associado com um aumento nos níveis de 2-araquidonoilglicerol. O bloqueio do metabolismo da presente endocannabinoid reduziu a incidência de focos de criptas aberrantes, tal como o tratamento com um agonista do receptor de CB [13] e, talvez de maneira surpreendente, por tratamento com um CB

um receptor agonista inverso [14].

Os canabinóides e endocanabinóides produzir efeitos potencialmente úteis após a proliferação de células cancerosas, motilidade e comportamento invasivo (comentários, ver [15], [16]). Em linhas celulares de cancro colorrectal, tanto efeitos CB

1-dependentes e independentes de de canabinóides endógenos e /ou sintéticos sobre a viabilidade das células foram relatados [17] – [20]. Em um modelo genético de progressão colorectal cancer (Apc

Min /+ camundongos), os animais sem o CB

1 receptor mostraram um maior número de pequenos pólipos intestinais e do cólon do que o CB correspondente

1

+ /+ ratinhos [21]. doentes com cancro colorectal que são ou homo- ou heterozigótico para a 1359 G /A CB

um polimorfismo de receptores exibem um tempo de sobrevivência mais curto do que os L /G pacientes de tipo selvagem [22]. Finalmente, a expressão reduzida do BC

ARNm de um receptor e proteína foram relatados em cancro colorrectal [17], [21], devido, pelo menos em parte, a um aumento da taxa de metilação da região promotora do receptor [21].

os dados acima são consistentes com a sugestão de que o sistema de canabinoide endógeno pode ser nociva para o cancro colorectal, e que uma tal disfunção pode afectar a gravidade da doença e /ou do resultado. Uma maneira de investigar esta possibilidade é determinar o nível de CB expressão

1 receptor em uma grande coorte de casos bem caracterizados de cancro colorectal com longos tempos de acompanhamento. Este foi realizado no presente estudo. Dado que o câncer colorretal é altamente heterogênea, um foco particular tem sido feito sobre a relação do CB

1 imunoreativos intensidades com componentes patológicos chave /moleculares da doença [23]: fase, status de grau de tumor, instabilidade de microssatélites de triagem, a incidência de botões na parte dianteira do tumor, e CpG ilha methylator fenótipo (CIMP).

Métodos

Declaração de Ética

a comissão de ética de pesquisa da Umeå University Hospital (Ethical Review Board Regional em Umeå, Suécia) aprovou a manipulação de amostras de tecido e dados dos pacientes no presente estudo, incluindo o procedimento pelo qual os pacientes verbalmente deram o seu consentimento informado. Esta autorização foi documentada em cada registro do paciente, e isso foi considerado pela comissão de ética para ser suficiente. No banco de dados usado para as análises aqui, as amostras de tecido foram dadas um número de caso e ano, e os nomes dos pacientes não foram indicadas no banco de dados.

Os pacientes

O fixado em formol e parafina amostras -embedded utilizados no presente estudo foram obtidos a partir de tecido recolhidas durante tumor ressecção cirúrgica primária do câncer colorretal (crums (câncer colorretal em estudo Umeå)). As amostras foram coletadas com uma intenção consecutiva no Departamento de Cirurgia, Hospital Universitário Umeå, na Suécia, durante o período de 1995-2003 e, quando possível, os pacientes foram acompanhados por até 113 meses [24]. Para além dos dados clinico-patológicos relatados em [24], os dados sobre a estabilidade de microssatélites /instabilidade rastreio de estado (imunoquímico determinação da expressão de quatro proteínas de reparação de emparelhamentos incorrectos) e CIMP foram recolhidas e previamente relatada [25]. Incidência de botões na parte dianteira do tumor foram avaliados como em [26]. Os critérios de exclusão era insuficiente ou inexistente amostra de tecido do tumor e informação clínica insuficiente. Ao todo, 487 casos foram marcados para qualquer centro de tumor ou CB frente tumor

1 imunorreatividade receptor (ver abaixo). A informação clínica no banco de dados para estes pacientes foi a seguinte: a média de idade de 71 anos (intervalo 26-96, n = 487, dos quais 269 eram do sexo masculino e 218 do sexo feminino); localização do câncer no cólon direito de 31,1%, para a esquerda do cólon 31,1%, reto 37,8% (n = 482); estágio da doença Eu 15,5%, 39,3% II, III 21,0%, IV 24,2% (n = 476); o grau do tumor bem /bem-moderadamente diferenciada 48,75%, moderada-baixa /pouco diferenciado 51,25% (n = 480); microssatélite estável de 85,0%, microssatélite instável 15,0%; (N = 473); estatuto CIMP negativa de 50,4%, baixa de 37,2%, alta de 12,4% (n = 484). Além disso, 82,4% (de 483 casos) não receberam radioterapia pré-operatória (ou 5 × 5 Gy ou 25 × 2 Gy); 75,0% (de 476 casos) tiveram a cirurgia radical; e 13,7% (de 475 casos) receberam quimioterapia adjuvante.

Medição da CB

1 imunorreatividade receptor (CB

1IR) no tecido tumoral

As secções de tecido embebidos em parafina foram desparafinados e reidratadas antes recuperação antigênica em uma panela de pressão (2100 retriever, Biocare Medical) em Diva Decloaker (Biocare Medical). As amostras foram em seguida colocados numa máquina de imunocoloração semi-automático Ventana (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ). O anticorpo para o receptor CB

1 (Abcam cat. N. 23703, Abcam plc, Cambridge, Reino Unido, diluídas a 1:50) e os componentes secundários (iVIEW DAB Detection Kit, Ventana Medical Systems, Inc.) foram então adicionados. O anticorpo, um anticorpo policlonal de coelho criado a um péptido correspondente aos ácidos aminados do terminal C 461-472 da CB humana

1 receptor e que reage de forma cruzada com o humano, ratos e ratinhos CB

1 receptor de acordo com dados os fabricantes, foi demonstrado anteriormente pelos investigadores em Umeå (incluindo o autor correspondente) para produzir o padrão adequado de coloração no cerebelo humano, mas não para a produção de imuno-reactividade no prosencéfalo de CB

1

– /- ratos [27 ]. Uma explosão ExPasy (https://expasy.org/tools/blast/) da sequência do péptido deu CB

1 e as suas duas variantes de splicing como os únicos sucessos no homem. Em várias outras espécies, receptores

1 CB foram novamente identificados, o único não-CB

1 hits sendo a partir de proteínas denominadas “proteína não caracterizada [Gene: CNR1]” (a partir de porco, cão e galinha), bem como ” proteína uncharacterized putativa [Gene: PANDA_015085] -.

Ailuropoda melanoleuca

(panda gigante) “e” Chromosome 14 SCAF15003, fragmento de sequência do genoma espingarda todo “no

Tetraodon nigroviridis

(baiacu verde)

CB

1IR foi avaliada por um investigador (SBG), que desconhecia o estado clínico dos pacientes. As amostras foram classificadas com base na CB dominante

1 receptor imunorreactivo intensidade (CB

1IR) no interior do tumor e nas frentes invasivas do tumor e pontuadas de 0 (ausente) a 3 (intenso) para as células . Quando todas as amostras tinham sido marcado, o pesquisador repetiu o procedimento (sem acesso às contagens anteriores) e, em seguida, compararam as pontuações nas duas corridas. Casos em que as notas eram divergentes foram então avaliados pela terceira vez, novamente sem acesso às pontuações anteriores. Para as amostras de tumor dianteiros marcados, por exemplo, houve 53 ocasiões em que os primeiro e segundo sulcos não concordavam, devido principalmente às pontuações erróneos a partir da fase inicial da primeira execução. As pontuações finais foram, então, entrou por outro investigador (CJF) no banco de dados para análise.

Avaliações estatísticas

análises de sobrevida de Kaplan-Meier, χ

2 testes foram realizados teste exato de Fisher e utilizando o pacote estatístico incorporado no programa de computador GraphPad Prism 5, para o Macintosh (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Cox de riscos proporcionais de e análises de regressão logística binária foram realizadas por meio de estatística IBM SPSS 19 software para o Macintosh (IBM Inc., Somers, NY, EUA). Para as análises de sobrevivência, eventos específicos da doença foram definidos como morte com conhecida doença disseminada ou recorrente ( “†

ca”). Morte por outras causas foi censurada, como foram os casos em que o paciente ainda estava vivo na data do último seguimento. A duração da sobrevida livre de eventos é definido como o tempo desde o diagnóstico até que a data da morte do cancro colorectal, a morte de outras causas, ou se nenhuma morte ocorreu, até a data do último seguimento.

Resultados

CB

1IR imunohistoquímica

os estudos iniciais foram realizados usando o mesmo lote do anticorpo como em um estudo prévio realizado por pesquisadores em Umeå utilizando microarrays de tecido a partir de amostras de cancro da próstata [27]. Descobrimos que a uma diluição de 1:300, CB

1IR foi encontrado nas células epiteliais das criptas, com positividade dispersa em células inflamatórias subepiteliais (Fig. S1A), uma descoberta consistente com os estudos de CB

1IR no cólon normal, [5], [6]. Um exemplo de tecido de tumor coradas com este lote é mostrado na Fig. 1B. Devido à quantidade limitada de anticorpo remanescente, foi utilizado um lote posterior do anticorpo Abcam (lote 761993) para o estudo principal, e verificou que era necessária uma diluição menor (1:50) para a imunocoloração boa. Um exemplo de coloração é visto na Fig. 1A, com uma secção em série sem anticorpo primário correspondente mostrado na fig. 1B.

secções do mesmo caso foram usadas na presença (Painel A) e ausência (Painel B) do anticorpo primário. ampliação da objetiva é de 10 ×.

O melhor teste especificidade para imunoquímica é considerado o uso de controles de nocaute [28]. Descobrimos que a coloração imunoquímico apropriado foi visto nos cérebros de camundongos selvagens, que este estava ausente do cérebro de CB

1

– /- ratos (Fig. S2). Ashton [29] argumentou recentemente que os histogramas de densidade óptica são úteis para distinguir entre uma mudança no padrão de imunomarcação (como deve ser visto por um verdadeiro perda de sinalização de um nocaute) em comparação com uma redução na intensidade de marcação (o que levantaria um dúvida quanto à validade do anticorpo). histogramas de densidade óptica do nosso tipo selvagem e CB

1

– /-. tecidos são claramente diferentes (. melhor visto para os slides maior ampliação, Fig S2), consistente com boa especificidade do anticorpo [29]

Uma forma comum de testes para a especificidade do anticorpo é investigar preadsorbtion do anticorpo com o péptido imunizante, embora a utilidade desta medida tem sido questionada [30]. No entanto, também foram realizadas uma série de experiências usando a pré-incubação do anticorpo com o péptido imunizante (Abcam, No. Cat. 50542). No entanto, a pré-incubação com o péptido de imunização aumentaram grandemente a observada imunorreactividade em vez de bloqueada, e o deu um padrão aleatório em vez de coloração imuno-reactivo (dados não mostrados). O péptido (de sequência de aminoácidos MSVSTDTSAEAL) imunizar tem dois ácidos aminados carregados negativamente (glutamato e aspartato), cinco aminoácidos polares (três serina, treonina) e dois aminoácidos não carregados positivamente. É bem conhecido que os péptidos carregados negativamente ligam-se ao vidro, e conclui-se que o processo de lavagem na técnica Ventana, sendo suficiente para proporcionar uma boa especificidade

per se

(como pode ser visto nos murganhos knockout), não é suficiente para remover péptido controlo positivo ligada ao anticorpo aderindo não especificamente para vidro e /ou para zwitteriônico lipídios.

Distribuição de CB

pontuações 1IR no centro do tumor e frentes

Um total de 483 (tumor interior) e 486 (frente tumor) casos foram marcados por CB

intensidade 1IR e entrou em banco de dados. Ambos membrana plasmática e CB citoplasmática

1IR foi marcado, de modo que os valores representam o pool total de CB

1 receptores. coloração nuclear de CB

1IR (encontrado em 42 casos) não foi marcado. As distribuições de freqüência do CB

1IR para o centro do tumor e frentes foram semelhantes, com uma pontuação de 0 a ser retornado para 77 e 60 casos; uma pontuação de 1 para 196 e 185 casos; uma pontuação de 2 para 140 e 156 casos; e uma pontuação de 3 para 70 e 85 casos (números são o centro do tumor e frentes, respectivamente). Não houve diferença significativa no padrão de distribuição dos dois conjuntos de pontuação (p 0,1, χ

2 de teste). Notou-se que as pontuações para as duas regiões não eram sempre os mesmos para um determinado caso. Na verdade, para os 482 casos marcados tanto para o centro do tumor e da frente, as pontuações foram os mesmos em apenas 319 (66%) dos casos, sendo mais alta na frente do tumor em 110 (23%) casos e mais elevada no centro do tumor em 53 (11%) casos. Em consequência, ao longo deste estudo, ambas as pontuações centro do tumor e da frente do tumor foram analisadas separadamente. tecido não malignas não foi marcado, mas, em geral, o seu nível de imunorreactividade parecia ser mais baixo que mais elevada do que visto para o tecido tumoral.

Associação de CB

1IR com as características dos pacientes no decorrer da cirurgia

Tendo em conta a distribuição do CB frequência

1IR, as análises foram realizadas utilizando uma divisão média simples, ou seja, CB

1IR 2 e ≥2. Usando os dados de todo o conjunto para procurar variáveis, uma regressão logística binária com os parâmetros sexo, local (ou seja, cólon direito, cólon esquerdo, reto), radioterapia (antes da cirurgia), estágio da doença, tumor grau histológico (ie diferenciação), tipo de tumor (ou seja, mucinoso ou não-mucinoso), instabilidade triagem status de microssatélites [estável (MSS) ou instável (MSI)], a quantidade de linfócitos em frente do tumor e da frequência dos botões de tumores (pequenos agregados de células tumorais em frente à invasão tumoral, [31]) foi realizada. Dessas variáveis, apenas o tumor grau histológico (p 0,005) e instabilidade de microssatélites triagem status (p 0,05) foram significativamente associados com a CB

1IR (dados não mostrados). Estes efeitos podem simplesmente ser visualizado através da divisão do conjunto de dados em quatro grupos com base em parâmetros significativos dos dois (Fig. 2). A maioria dos casos foram classificados como MSS, e o OC detalhada

1IR distribuições para os casos MSS que não receberam radioterapia antes da cirurgia estão resumidos na Tabela 1. Em ambos o centro do tumor e do tumor frentes, existem mais casos com uma CB

1IR≥2 para casos MSS com moderada pobres diferenciação tumoral /pobre do que com tumores bem /bem-moderadamente diferenciados. Nos casos MSI, este efeito do grau histológico do tumor não é visto, e os casos têm um CB semelhante

distribuição 1IR aos moderada pobres /casos MSS pouco diferenciados (Fig. 2). Uma análise mais aprofundada dos 62 casos com MSI marcou para a CB

1IR que não receberam radioterapia antes da biópsia não revelou associação significativa do centro de tumor ou CB frente

1IR com qualquer estágio da doença (aqui estádios I e II foram combinadas uma vez que apenas 4 casos com a fase I foram marcados para o centro do tumor CB

1IR), o grau do tumor, se os tumores eram mucinoso ou não-mucinoso, incidência de linfócitos em frente ao tumor ou o status CIMP (p 0,1, o teste exato de Fisher ou χ

2 de ensaio, conforme apropriado, dados não mostrados). Por gênero, os valores p para os CB

1IR distribuições foram 0,069 e 0,18 para o centro do tumor e frontal, respectivamente (teste exato de Fisher), e para a incidência de botões na frente do tumor, os valores de p (χ

2 ensaio) foram 0,086 e 0,073, respectivamente (dados não mostrados)

Painel A, centro do tumor.; Painel B, frente tumor. Os dados são agrupados de acordo com tumor grau histológico (w-m, bem /bem-moderadamente diferenciado; m-p, moderada-baixa /pouco diferenciado) e estabilidade de microssatélites (MSS, estável; MSI, instável). A χ

2 e, portanto, valores de p são para os dados agrupados como uma matriz 4 × 2 (onde o 2 é o CB

1IR). n refere-se ao número total de casos para cada bar.

Uma diferença importante entre MSS e MSI é a maior incidência de um alto grau de CpG ilha metilação na segunda [32]. Em nosso conjunto de dados, dos 467 casos marcou para o status de triagem instabilidade de microssatélites, CIMP status e tumor centro CB

1IR, as distribuições CIMP foram: MSS (n = 396), negativo 225 (57%), baixa 153 (39 %) e alta 18 (4,5%); MSI (n = 71), negativo 15 (21%), de baixo 17 (24%) e elevado 39 (55%) (P 0,0001, χ

2 de teste). Quando o estado CIMP das amostras foi adicionado na regressão logística binária de todo o conjunto de dados com os parâmetros descritos acima, o efeito significativo do grau histológico do tumor foi mantida (p 0,005) para ambos o centro do tumor e CB frente

1IR , mas o efeito do estado de rastreio de instabilidade microssatélite foi perdida para os centros de tumor (p 0,1), mas não para as frentes de tumor (p 0,05) (dados não mostrados). A fim de investigar adicionalmente este, os dados para as amostras foi dividida em três grupos CIMP: negativo, alto e baixo, independentemente do estado de instabilidade microssatélite rastreio ou se os pacientes receberam radioterapia antes da cirurgia. Houve uma clara influência do estado CIMP nos resultados, onde o efeito do grau histológico do tumor foi observado nos casos com uma pontuação CIMP-negativo, mas não nos casos com uma pontuação CIMP de alta, os casos CIMP-baixos estar em algum lugar no meio (Fig. 3). Esta análise não levou em conta o status de triagem instabilidade de microssatélites dos casos a fim de alcançar o tamanho dos grupos suficientes. No entanto, um padrão similar é visto quando o MSS e casos MSI são analisados ​​separadamente, embora, como uma advertência deve-se salientar que alguns dos tamanhos dos grupos são muito pequenas (Fig. S3).

Painel A, centro do tumor; Painel B, frente tumor. Os dados são agrupados de acordo com tumor grau histológico (w-m, bem /bem-moderadamente diferenciado; m-p, moderada-baixa /pouco diferenciado) eo status CIMP. Dos 473 casos marcou para o centro do tumor CB

1IR, 389 foram classificados como MSS, 71 como MSI e 13 não classificadas na base de dados. Os números correspondentes para o CB frente tumor

1IR foram 392, 71 e 13, respectivamente. Os valores de p são para o teste exato de Fisher. O total (ou seja, CB

1IR 2 e ≥2). Número de casos é mostrado fechado dentro de cada barra

Associação de CB

1IR com a evolução da doença

os casos na base de dados tinha sido seguido por até 113 meses [24], permitindo que a influência do CB

pontuação 1IR no momento do diagnóstico sobre a evolução da doença a ser determinado. Usando todo o conjunto de dados (ou seja, mesmo naqueles casos em que CB

1IR não foi marcado, um risco proporcional de análise univariada de regressão Cox em todo o conjunto de dados indicavam que a administração da radioterapia antes da cirurgia foi, sem surpresa, associado com a evolução da doença (Exp ( B) 0,60 [IC 95% 0,40-0,91] p . 0,05), onde o número de casos que não receberam /receber radioterapia foi 441/102 a análise de regressão de riscos proporcionais de Cox é um teste usado para determinar a contribuição do parâmetro (s) sob investigação na sobrevida específica da doença, sem fazer suposições quanto à natureza da curva de sobrevivência. a medida Exp (B), às vezes chamada de taxa de perigos, indica a alteração no risco como o parâmetro sob investigação é alterada a partir do parâmetro padrão (aqui sem radioterapia) para o parâmetro de teste (aqui radioterapia). neste caso, a radioterapia reduz o risco de morte devido à doença uma vez que o valor Exp (B) foi significativamente menor que a unidade. a fim de eliminar a influência deste parâmetro, o CB

dados 1IR foi analisada apenas para os casos que não receberam radioterapia. Além disso, os casos MSS e MSI foram analisados ​​separadamente.

Para os casos MSS, uma análise de riscos proporcionais de Cox univariada não conseguiu mostrar um efeito significativo de qualquer tumor interior ou da frente CB

1IR sobre doença- sobrevida específica. No entanto, quando uma análise bivariada foi realizada com o estágio da doença como o segundo parâmetro, uma contribuição muito significativa de CB

1IR foi visto (Tabela 2). Isto foi confirmado em parcelas de sobrevivência de Kaplan-Meier: para todo o conjunto de dados, não houve contribuição significativa do tumor interior CB

1IR (Fig. 4A), enquanto que no estágio do tumor II (em que os tumores se infiltraram na muscular própria do cólon ou do recto, mas não deram origem a metástase ganglionar), e no tumor em estágio IV (em que os tumores se espalharam para outros órgãos), os casos com uma CB

1IR≥2 têm uma sobrevida específica da doença mais pobres de casos com uma CB

1IR 2 (. Figuras 4B e D; definições de estadiamento da doença dada em [33]). Nenhuma diferença foi observada para o estágio do tumor III, embora se deva ter em mente que este é um grupo altamente heterogêneo, que o número de casos foi menor do que para os estágios da doença II e IV e que análises de subgrupos sofrem de baixa potência. Havia apenas três pacientes diagnosticados com a fase I colorectal cancer (onde o tumor só se infiltraram na camada submucosa do cólon ou do recto e não se espalhou para os gânglios linfáticos ou outros órgãos) que morreram como resultado de seu câncer durante o acompanhamento up período, a análise se opõe à influência da CB

1IR mediante resultado específico da doença neste grupo de doentes. No caso de o OC frente do tumor

1IR, o efeito significativo sobre a resposta tumoral nos pacientes fase II foi também visto, mas não nos pacientes IV fase (Fig. 4 e dados não mostrados, respectivamente). Nos casos fase II, as probabilidades de sobrevida livre de eventos em 5 anos foram: 85 ± 5 e 66 ± 8%; tumor interior, 86 ± 4% e 63 ± 8% para o CB

1IR 2 e CB

1IR≥2 grupos, respectivamente. Pode-se notar que alguns dos casos fase II morreu dentro de um mês da cirurgia. No entanto, quando esses casos foram excluídos, a contribuição significativa de CB

1IR para o resultado específica da doença foi mantida (dados não mostrados). Após a subdivisão dos casos fase II de acordo com a localização de cancro, uma contribuição significativa de ambos centro do tumor e CB frente

1IR na sobrevida específica da doença foi observada para os tipos de câncer retal, mas não para os cancros do cólon, embora a direção ( isto é, a sobrevivência mais pobre para um elevado CB

1IR) foi o mesmo. É importante notar, porém, que a interpretação dos resultados com estes subgrupos são limitados por uma baixa potência e não são suportados pelo Cox análises (ver abaixo).

Kaplan-Meier da sobrevivência específica da doença para as regiões de tumor mostradas e estádios da doença. Mostrada nas figuras são o número de casos (n), seguido por o número dos que morreram como um resultado do cancro colo-rectal (†

CA). A χ

2 valor dado nas figuras é a partir do log-rank (Mantel-Cox) teste comparando as duas curvas; ** P 0,01, * p 0,05,

† 0,05 p 0,1;

NSp 0,1. O correspondente χ

2 valores para frente tumor estágios III e IV foram 0,24

NS e 1,44

NS, respectivamente.

O facto de os pacientes MSS o CB

1IR está relacionado com o grau histológico do tumor no momento da cirurgia podem, evidentemente, significa que a associação acima descrito é simplesmente um reflexo da influência do tumor grau histológico sobre a evolução da doença. Esta possibilidade foi investigada utilizando análises regressão de risco proporcional de Cox multivariados (Tabela 2), em que se verificou que o grau histológico do tumor fornecida informação de prognóstico aditivo ao observado com o centro de tumor CB

1IR, quando o estágio da doença foi também incluído como um parâmetro. Em contraste, a CB frente tumor

1IR parâmetro perdeu importância. No entanto, quando a incidência de botões na parte dianteira do tumor também foi incluído (em si um factor de prognóstico), a influência do tumor grau histológico sobre a evolução da doença foi reduzida, enquanto que a influência de ambos o centro do tumor e CB frente

1IR estava significativa (Tabela 2). Estes dados sugerem que o significado prognóstico do centro do tumor e, possivelmente, também CB frente tumor

1IR não é secundário a sua associação com o grau histológico do tumor. Outras análises indicaram que o significado prognóstico da CB

1IR permaneceu quando a região status, gênero e tumor do CIMP foram incluídos na análise multivariada (centro do tumor, Exp (B) 1,77 [95% CL 1,16-2,72, p 0,01; frente tumor Exp (B) 1,67 [95% CL 1,11-2,50] p . 0,05)

para os casos MSI, nenhuma conclusão pode ser tirada sobre se CB

1IR impacto na sobrevida específica da doença nos casos em estágio II, simplesmente por causa dos 32 casos que caíram nessa categoria (após exclusão de casos que receberam radioterapia antes da cirurgia), apenas um morreu de câncer durante o período de acompanhamento.

Discussão

o presente estudo foi motivado por dados de ambas as células cultivadas e amostras de pacientes que sugerem que um sistema de sinalização endocanabinóide disfuncional está envolvido tanto na patogênese e /ou como consequência de cancro colo-rectal [13], [14], [17 ], [21], [22]. No início vale a pena comentar sobre o fato de que tanto a superfície celular e CB citoplasmática

1 receptores foram marcados. receptores

1 CB são frequentemente considerados como receptores de superfície de células, mas está bem estabelecido em muitas células e tecidos que tenham sido encontradas intracelularmente [34] – [37], como seria de esperar para os receptores que internalizam a seguir à estimulação agonista sustentada [38], [39]. Foi sugerido que estes receptores intracelulares são activos e pares de cinase regulada por sinal extracelular [35], embora outros autores não vi co-localização intracelular de CB

1 com os receptores de subunidades Ga [39]. Os ligandos de ocorrência natural para CB

1 receptores são altamente lipofílicos, e, portanto, a membrana plasmática não é uma barreira à sua penetração celular. Extracelular quinase regulada por sinal é uma molécula de sinalização importante, e tem sido implicado em efeitos antiproliferativos dos canabinoides em um número de linhas de células de cancro diferentes [40], de modo que não é razoável (e tecnicamente muito menos difícil) para marcar a intensidade combinada de membrana plasmática e CB intracelular

1 receptores. Existem três principais resultados em a partir do estudo, e estes são discutidos, por sua vez.

1.