Abstract

O papel do proliferador de peroxissoma – activado δ receptor- (PPAR δ) gene na carcinogênese do cólon continua a ser altamente controversa. Aqui, nós estabelecemos ratos nus modelo de xenotransplante utilizando um câncer de cólon linha celular KM12C humanos com PPAR δ silenciados ou normal. Os xenoenxertos em grupo PPAR δ-silenciados cresceu significativamente maiores e mais pesadas com menos diferenciação, promoveu a proliferação de células, o aumento da expressão do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o índice de apoptose semelhante em comparação com os do grupo de PPAR-δ normal. Depois de tratadas com o inibidor de VEGF bevacizumab específico, as capacidades de crescimento e proliferação de xenoenxertos foram diminuiu em ambos os grupos, enquanto ainda significativamente mais elevada no grupo de PPAR-δ silenciado do que no grupo de PPAR-δ normal. A administração de agonista de PPAR δ diminuíram significativamente a expressão de VEGF em células KM12C PPAR-δ normais, mas não em células de PPAR-δ silenciados. Estes resultados demonstram que, knockdown de PPAR δ promove o crescimento do cancro do cólon por indução de diferenciação menos, acelerar a expressão de VEGF e a proliferação de células tumorais in vivo, e reduz a sensibilidade do tumor para o bevacizumab. Este estudo indica que PPAR δ atenua cólon carcinogênese

Citation:. Yang L, Zhou J, Ma Q, Wang C, Chen K, Meng W, et al. (2013) Knockdown de Gene PPAR δ promove o crescimento do cancro do cólon e reduz a sensibilidade à Bevacizumab no modelo de nudez Mice. PLoS ONE 8 (4): e60715. doi: 10.1371 /journal.pone.0060715

editor: Alan P. Fields, Mayo Clinic College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Abril de 2012; Aceito: 02 de março de 2013; Publicação: 08 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores reconhecer o apoio bolsa da Fundação de Ciência Natural da China (No. 30801332; https://www.nsfc.gov.cn/), Ph.D. Fundação programas de Ministério da Educação da China (No. 200.806.100.058; https://www.chinapostdoctor.org.cn/) e da Fundação do Câncer Sueco (https://www.cancerfonden.se/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

proliferador de peroxissoma – activated receptor-δ (PPAR δ), um membro da família de receptores nucleares PPAR activados por ligandos [1], é expresso ubiquamente na maior parte dos tecidos e altamente expresso em epitélio, em particular, pele e intestino [2], [3]. Semelhante a outros receptores nucleares de hormonas, heterodimerizes PPAR δ com o receptor retinóide X e exerce os seus efeitos através da regulação da transcrição de genes mediante a ligação do ligando [4]. O papel mais bem caracterizados para o PPAR δ até à data é a de regular o metabolismo dos lípidos e homeostase da energia, tais como indução de transporte reverso de colesterol, elevando a lipoproteína de alta densidade, aumentando a oxidação de ácidos gordos e energia desacoplamento [5], [6]. Além disso, de PPAR δ também está implicado na implantação do embrião, cura de feridas, a resposta inflamatória, proliferação de células endoteliais, angiogénese, cancro da pele e carcinogénese colorectal [7], [8].

Em contraste com o bem caracterizado papéis de PPAR δ em metabólica e homeostase energética, o papel do PPAR δ na carcinogénese colorrectal permanece incerto. Alguns estudos fornecem evidências de que PPAR δ promove tumorigênese enquanto outros produzir resultados conflitantes, como anteriormente revista [9]. Estes resultados inconsistentes ditar a necessidade de examinar ainda mais a função de PPAR δ na patogênese do câncer colorretal. Recentemente, nós estabelecidos com sucesso modelos do PPAR δ-knockdown de linhas celulares de cancro do cólon (KM12C etc.) por RNA mediada por lentivírus interferência (RNAi) [10]. Verificou-se que o PPAR δ knockdown induzida significativamente menos diferenciação e proliferação destas células promovido [9], [10]. Estes resultados indicam que o PPAR δ pode desempenhar um papel supressor de tumor, facilitando a diferenciação e inibir a proliferação do cancro do cólon. No entanto, ainda falta de experiência in vivo para depor estes resultados in vitro. Para definir de forma mais rigorosa o papel do PPAR δ na carcinogênese colorretal, que examinou o efeito do PPAR δ knockdown nos xenoenxertos de ratinhos nus estabelecidos com células KM12C no presente estudo.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

O cancro do cólon linha celular KM12C humana (de Professor IJ Fidler, Anderson cancer Center, TX), não tratada ou tratada por RNA mediada por lentivírus interferência (RNAi) contra o gene PPAR δ do nosso estudo anterior [10], foram usados. As células foram mantidas em meio mínimo essencial de Eagle (MEM), com sais de Earle, L-glutamina e aminoácidos não essenciais (Sigma-Aldrich), suplementado com 1,5% de NaHCO3, 1 mM de Na-piruvato (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), 1 × MEM solução vitamínica (Invitrogen), 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen), 1 ug /ml de puromicina (apenas para as células tratadas para manter a pureza) e soro fetal de bovino 10% (Invitrogen). A expressão de PPAR ô foram silenciados de forma estável nas células tratadas por RNAi mediada por lentivírus como examinado no nosso estudo anterior [10].

O estabelecimento de xenoenxertos de tumor em ratinhos nus

quarenta e oito camundongos nu feminino de seis semanas de idade foram adquiridos a partir de Sichuan Universidade de animais de Laboratório Center (Chengdu, China). Os ratinhos foram mantidas durante 7 dias numa unidade de cuidados animais convencional antes do início do estudo.

Os ratinhos foram anestesiados por injecção intra-peritoneal de pentobarbital (65 mg /kg, Catálogo No.p3636, Sigma-Aldrich, Suécia). As células KM12C quer com silenciados estavelmente PPAR δ ou não tratada foram então injectados por via subcutânea (2 × 10

6 células /murganho em 100 uL de PBS) no flanco direito de cada ratinho (24 ratinhos por grupo). Vinte e quatro horas após a inoculação, doze ratinhos seleccionados aleatoriamente de cada grupo foram injectados com bevacizumab (Avastin ™, Genentech, CA) através da veia da cauda a 5 mg /kg de peso corporal. O crescimento do tumor foi monitorizado em intervalos regulares por medição de dois diâmetros do tumor usando compassos de calibre electrónicos. O volume do tumor foi calculada com a seguinte fórmula: (comprimento x largura

2) /2. Os ratinhos foram sacrificados 25 dias após a inoculação, e os tumores foram fixados em formalina neutra a 10%. Os procedimentos foram operados de forma cega por um investigador (L. Yang) sem o conhecimento de agrupar informações

declaração de Ética:. O manejo dos animais foi realizado em estrita conformidade com as recomendações contidas no Guia para o Cuidado e uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela aprovado pelo Comité de animal Experimental de Ética da Universidade de Sichuan. Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Hematoxilina e Eosina (HE)

Os xenoenxertos de ratinhos foram regularmente incorporados em paraffinum e depois seccionados a uma espessura de 5 um. Os cortes foram desparafinados em xileno, re-hidratadas em etanol, lavadas em água destilada, e em seguida fixadas com formaldeído a 4%, coradas com hematoxilina e eosina Ehrlich (Sigma-Aldrich), seguido por desidratação em álcool graduado. As lâminas foram montadas e analisadas em microscópio de luz.

imuno-histoquímica Assay (IHC)

Os immunostaings foram realizadas em 5 mm secções embebidas em parafina conforme relatado anteriormente [9]. Os anticorpos primários foram policlonal de coelho anti-IgG de PPAR δ (ARP37889, Sistemas Aviva Biologia, CA), anti-Ki67 de Ig G (ab15580, Abcam, MA) e anticorpo monoclonal de ratinho IgG anti-VEGF (ab68334, Abcam, MA). O sistema Envision etiquetado polímero-HRP anti-coelho (DakoCytomation, CA) foi usado como um anticorpo secundário. Secções conhecidos para mostrar a coloração positiva para o PPAR δ, Ki67 ou VEGF foram incluídos em cada série, recebendo tanto o anticorpo primário ou PBS, como controlos positivos ou negativos. Em todos os procedimentos de coloração, os controlos positivos apresentaram coloração clara, enquanto não houve coloração nos controlos negativos.

As lâminas foram examinadas IHC, independentemente, de forma cega por dois investigadores (LY e JZ) sem o conhecimento do agrupamento em formação. Os investigadores teve cada secção pela intensidade de coloração de células tumorais como se segue: 0 (coloração negativa), 1 (fraca coloração exibidos como de cor amarela clara), 2 (coloração moderada exibiram como castanho amarelo), e 3 (coloração forte exibiu como marrom) . Para evitar o efeito artificial, as células nas margens das secções e em áreas com pouca morfologia não foram contados. Nos casos em que a pontuação coloração tiveram resultados discrepantes, uma pontuação de consenso foi alcançado após a reavaliação

celular Apoptosis Detection

O nível de apoptose foi determinada por desoxinucleotidiltransferase terminal (TdT). – mediada dUTP nick end-rotulagem (TUNEL) ensaio usando o In Situ Cell Death Detection Kit (Catálogo No. 11684817910, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha), seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, as secções foram de-parafinado, re-hidratadas, permeabilizadas e equilibrada. Após a reacção de marcação, os resultados foram avaliados usando Leica DM IL HC fluorescente microscópio. As células totais foram visualizados em 330-380 nm para a coloração DAPI, e células apoptóticas foram visualizados em 465-495 nm para coloração com FITC. As secções sem adição de TdT ou receber DNase I foram incluídos em cada série como controles negativos ou positivos, respectivamente. Para cada amostra, cinco campos de alta potência (× 200) foram seleccionados de forma aleatória, e o número de células apoptóticas foi contado para cada campo. índice de apoptose (AI) = número de células positivas /número de células totais.

em tempo real transcrição reversa (RT) de PCR

O ARN total foi extraído a partir de tumores utilizando TurboCapture mRNA Kit (Qiagen , Alemanha), seguido por transcrição reversa com High-Capacity cDNA de transcrição reversa Kit (Applied Biosystems, CA). Os ARNm que codificam a proteína VEGF, Ki67, relacionadas com a diferenciação dos adipócitos (ADRP), proteína de ligação a ácido gordo fígado (L-FABP), e fosfatase alcalina de intestino (ALPI) foram quantificadas usando análises em tempo real de RT-PCR por detecção de SYBR verde. reacção de PCR foi realizada nas Applied Biosystems 7500 rápida Real-Time PCR System, usando o método comparativo de ciclo limiar (Ct) (△△ Ct) como descrito anteriormente [11]. Os iniciadores utilizados para quantificar os ARNm foram listados no Quadro 1. A expressão foi normalizada para desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH), e a 1 × mistura de iniciadores GAPDH (pré-desenvolvido Ensaio TaqMan reagentes, Applied Biosystems) foi utilizado para a detecção . Cada amostra foi analisada em triplicado.

Medição de VEGF a partir de células KM12C

produção de VEGF a partir de células KM12C foi medida com um kit VEGF humano colorimétrico ELISA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL). Resumidamente, as células KM12C (1 × 10

6) com PPAR δ silenciados ou não tratadas foram cultivadas em meio livre de soro durante 18 h. Em seguida, as células foram tratadas com veículo ou concentração de GW501516, o agonista específico dos PPAR δ (0, 1, 2, 4, 8 uM) durante 24 h indicado. Os sobrenadantes foram submetidos a ELISA de acordo com as instruções do fabricante. A intensidade da cor de cada poço foi determinada num leitor de microplacas (Anthos htIII, Áustria) a 450 nm. As curvas de calibração foram construídos para cada ensaio traçando valor de absorbância versus a concentração de cada calibrador. As concentrações de VEGF de amostras foram então lidas a partir da curva de calibração e normalizadas para nanogramas por 10

6 células.

Análise Estatística

A significância estatística foi determinada utilizando um teste t, ou , quando aplicável, teste de classificação soma, a análise de variância (ANOVA) ou o teste do qui-quadrado com o programa SPSS 13.0. A expressão relativa de mRNA foram analisados ​​utilizando o software RESTO-XL

© (disponível em https://www.wzw.tum.de/gene-quantification/) com base no método ΔΔCt [11].

P Art 0,05 foi considerado como o nível de significância. Os dados apresentados representam pelo menos três repetições de cada experimento realizado em triplicado.

Resultados

Knockdown de PPAR δ Crescimento Tumor Promovido e diminuiu a sensibilidade para Bevacizumab

Para examinar o efeito knockdown de PPAR δ sobre o crescimento do tumor in vivo, inoculado com células KM12C quer PPAR δ volumes dos tumores silenciados ou normais em ratinhos nus e medido até 25 dias. Como mostrado na Figura 1A, o declive da curva de crescimento do xenoenxerto foi superior ao longo de todo para o grupo de PPAR-δ silenciados, e esta diferença nas taxas de crescimento foi estatisticamente significativo (

P

0,05). No final do período de crescimento, o volume médio do tumor foi 2,1 vezes maior para o grupo knockdown que o grupo controle (2,8 cm

3 vs. 1,3 cm

3,

P

= 0,015; Figura 1A-C), com um peso médio de 4,0 ± 1,4 g para o grupo knockdown e 2,5 ± 0,6 g para o controle (

P

= 0,021, Figura 1D).

(a). Curva de crescimento de xenoenxertos. Em cada ponto de tempo, os xenoenxertos de PPAR grupo δ-silenciados (N = 12) aumentou significativamente maiores do que os do grupo de controlo (n = 12) (*

P

0,05), mesmo quando tratado por bevacizumab (**

P

0,05) (média ± DP, t-teste). (B). fotografia representativa de ratos em cada grupo foi feita 25 dias após a inoculação. (C). Os xenoenxertos de ratinhos nus quando sacrificados. grupo (D) Os xenoenxertos em PPAR δ-silenciados foram significativamente mais pesados ​​do que aqueles no grupo de controle quando os ratos nu sacrificado (média ± SD; *

P = 0,021

; **

P = 0,02

;. t-test)

para avaliar a relevância de combinar PPAR δ knockdown com o tratamento bevacizumab, injetamos bevacizumab para os ratos. Descobrimos que, a administração de bevacizumab diminuíram significativamente o crescimento do tumor de ambos os grupos, ao passo que os tumores no grupo de PPAR-δ silenciados cresceu significativamente mais rápido do que o normal de PPAR δ grupo (

P

0,05; Figura 1A). O volume final médio dos tumores foi de 1,4 vezes maior no grupo knockdown que o grupo controle (0,9 ± 0,11 cm

3 vs. 0,6 ± 0,15 cm

3,

P

= 0,033; Figura 1A- C), com um peso médio de 1,2 ± 0,5 g para o grupo knockdown e 0,8 ± 0,2 g para o controle (

P

= 0,02, Figura 1D).

Os xenoenxertos com PPAR δ knockdown foram

menos diferenciado

Seguindo o padrão unificado da National Patologia Pesquisa do Câncer Colorretal na China, a diferenciação de tumor foi classificado com a porcentagem de componentes da estrutura adenóide da seguinte forma: bem diferenciado ( 95%), moderada (50 % -95%), mal (5% -50%) e indiferenciado ( 5%). Por coloração HE, encontramos significativamente mais menos diferenciadas (mal + indiferenciada) xenoenxertos no grupo PPAR δ-silenciada do que aqueles no grupo controle (85% vs. 17%,

P

= 0,025) (Figura 2A, B). Foram quantificados ainda mais os genes associados com a diferenciação terminal, e descobriram que os mRNAs que codificam ADRP, L-FABP ou ALPI foram todos significativamente diminuída no grupo de PPAR-δ silenciados em relação ao grupo de controlo (

P

0,05 ; Figura 2C)

(A).. fotografias representativas de xenoenxertos por coloração HE. Os xenoenxertos em PPAR grupo δ-silenciados (n = 12) foram, obviamente, menos diferenciadas do que aqueles no grupo de controle (n = 12). × 400 ampliação. (B). grupo silenciados PPAR δ- teve xenotransplantes significativamente mais menos diferenciadas do que o grupo controle (85% vs. 17%,

P

= 0,025, teste de Qui-quadrado). (C). Mostrado por RT-PCR quantitativa, os mRNAs que codificam ADRP, L-FABP ou ALPI foram significativamente menores no PPAR δ-silenciado grupo em relação ao grupo (

P Art 0,05) controlar.

PPAR δ Knockdown promovido a proliferação de células tumorais

Nós temos mostrado previamente que as células KM12C PPAR δ-silenciados teve uma taxa de crescimento promovido in vitro [9]. Para testemunhar que in vivo, foi examinada a expressão do marcador de proliferação de Ki67 em xenoenxertos. Como mostrado pelo ensaio IHC, o grupo PPAR δ-silenciados tinham significativamente maior expressão de Ki67 de PPAR δ o normal grupo (média de pontuação: 3,5 ± 0,4 vs 2,0 ± 0,6,

P

= 0,026; Figura 3A, B). Após o tratamento bevacizumab, a expressão de Ki67 foi marcadamente diminuiu em ambos os grupos, enquanto ainda significativamente maior no grupo PPAR δ-silenciada do que no grupo controle (média de pontuação: 2,3 ± 0,5 vs 1,2 ± 0,3,

P

= 0,031; Figura 3A, B). O RT-PCR quantitativo produziu resultado concordante com o ensaio IHC (

P

0,05; Figura 3C).

(A). fotografias representativas de expressão Ki67 em xenoenxertos coradas por IHQ. × 400 ampliação. (B). grupo silenciados PPAR δ- (n = 12) tinham significativamente maior pontuação da coloração Ki67 que o grupo controle (n = 12) (*

P

= 0,026), mesmo após tratada por bevacizumab (**

P

= 0,031) (média ± SD; teste t). (C). O nível de mRNA de Ki67 foi significativamente maior no grupo PPAR δ-silenciada do que no grupo controle (*

P

= 0,018), mesmo após tratada por bevacizumab (**

P

= 0,025).

PPAR δ knockdown não afetou a apoptose de células tumorais

o efeito do knockdown PPAR δ na apoptose celular foi examinada pelo ensaio TUNEL. Como mostrado na Figura 4, diferença significativa de IA não foi encontrada entre PPAR δ-silenciados e grupo de controlo (6,2 ± 4,7% vs. 7,0 ± 3,6%,

P

= 0,81), mesmo após o tratamento bevacizumab ( 10,8 ± 4,1% vs.11.2 ± 2,9%,

P

= 0,75).

(A). imagens representativas de cada grupo. As células totais foram identificados por coloração com DAPI, e as células de apoptose positivos foram identificados por coloração com FITC. × 200 de ampliação. (B). Os dados quantitativos do índice de apoptose (AI). Não houve diferença significativa de AI entre os grupos, mesmo depois de tratados com bevacizumab (média ± SD, *

P

= 0,81, **

P

= 0,75; teste t).

Knockdown de PPAR δ expressão induzida por VEGF em xenoenxertos

Para analisar a correlação de PPAR δ com VEGF, examinamos ainda mais a expressão de VEGF nos xenoenxertos. Por IHC, encontramos esse grupo PPAR δ-silenciados tinham significativamente mais casos com alto-expressa VEGF (pontuação ≥2.0) (77% vs. 33%,

P

= 0,03) e maior pontuação intensidade do que o controle grupo (3,1 ± 0,3 vs 1,5 ± 0,2,

P

= 0,028; Figura 5A, B). A análise por RT-PCR quantitativa mostrou que, o ARNm de VEGF foram significativamente aumentados no grupo de PPAR-δ silenciados em comparação com o controlo. (

P =

0,032; Figura 5C)

(A). fotografias representativas de expressão VEGF em xenoenxertos coradas por IHQ 400x de ampliação.; (B). PPAR δ- grupo silenciados (n = 12) tinham significativamente maior pontuação da coloração VEGF do que o grupo controle (n = 12) (*

P

= 0,028; rank sum). (C). resultado quantitativo RT-PCR (*

P =

0,032).

A ativação do PPAR δ Diminuição VEGF Expressão em KM 12C Cells

Para confirmar a associação entre PPAR δ e VEGF, que trataram células KM12C com GW501516 (agonista específico de PPAR δ) ou veículo, e quantificado o VEGF no sobrenadante isento de células por ensaio ELISA. Como mostrado na Figura 6, a secreção de VEGF foi muito mais elevado nas células-silenciados δ o PPAR do que naqueles com células de controlo () PPAR δ normais antes da administração GW501516 (

P

= 0,035). Após o tratamento com GW501516, o VEGF foi reduzida de uma forma dependente da dose, nas células de controlo (

P

= 0,018), ao passo que não houve alteração significativa nas células do PPAR-δ silenciados ao longo de toda (

P

= 0,83).

as células KM12C foram tratados com concentrações seriadas de GW501516 ou veículo, e os sobrenadantes isentos de células foram recolhidos para quantificação de VEGF por ELISA. Tratada por GW501516, as células de controlo apresentaram uma diminuição dependente da dose da secreção de VEGF (*

P

= 0,018), enquanto que as células-silenciados δ o PPAR teve nenhuma mudança significativa ao longo de toda (**

P

= 0,83;. ANOVA)

Discussão

no presente estudo, verificou-se que os xenotransplantes em PPAR δ-silenciados grupo cresceu significativamente mais rápido com menos diferenciação, promoveu a proliferação celular enquanto o índice de apoptose semelhante e aumentada de VEGF em comparação com os do grupo de PPAR-δ normal, independentemente do tratamento bevacizumab. A administração de agonista de PPAR δ diminuíram significativamente a expressão de VEGF em células KM12C PPAR-δ normais, enquanto que não afectou de células de PPAR-δ silenciados. Estes resultados demonstram que, knockdown de PPAR δ promove o crescimento do cancro do cólon, diminuindo a diferenciação e promovendo a proliferação, bem como a expressão de VEGF de células tumorais in vivo, e reduz a sensibilidade do tumor para o bevacizumab. Estes resultados suportam um papel supressor de PPAR δ na patogênese do câncer de cólon.

No presente estudo, a constatação de que os xenoenxertos em ratinhos cresceu significativamente maior e mais pesado depois de PPAR δ knockdown indica que PPAR δ pode atenuar tumor crescimento in vivo. De acordo com esta conclusão, estudos recentes mostram que a formação de pólipos do cólon foi significativamente maior em ratos PPAR-δ deficiente em comparação com animais de tipo selvagem [12], [13]. Em contraste com estas observações, Park et al. [14] relatou que PPAR δ nulo HCT-116 células tinham uma diminuição da capacidade para formar xenoenxertos em ratinhos nus. Outro estudo concluiu que PPAR δ é dispensável para formação de pólipos no cólon da APC

mínimo de ratos [15]. No entanto, estas conclusões foram com base na análise de menos de 6 ratos, com poder estatístico limitado. O resultado do presente estudo inclui dados de um total de 48 ratos, fornecendo uma evidência mais definitiva para um papel funcional para PPAR δ na carcinogênese do cólon.

Para esclarecer o mecanismo subjacente ao crescimento promovido de tumores após PPARd knockdown, nós analisados ​​ainda mais a expressão diferenciação, proliferação celular, apoptose e VEGF nos xenoenxertos. Descobrimos que os xenotransplantes mostrou histologia significativamente menos diferenciadas após PPAR δ knockdown, com o aumento da expressão de genes relacionados com a diferenciação ADRP, L-FABP e ALPI. Estes resultados fornecem evidências in vivo de que PPAR δ pode facilitar a diferenciação de câncer de cólon. Este resultado é consistente com estudos recentes que implicam PPAR δ na regulação da diferenciação epitelial: A ativação do PPAR δ estimula a diferenciação terminal de queratinócitos [16] – [18]; PPAR δ promove a diferenciação de células de Paneth em criptas intestinais [19]. Recentemente, mostra-se que o PPAR δ knockdown induz menos diferenciação de linhas de células de cancro do cólon, e de alta expressão de PPAR δ está relacionado com uma melhor diferenciação de cancro rectal [10]. Estes resultados são consistentes com as observações in vivo no presente estudo. O regulamento sobre a diferenciação pode ser a base do efeito promotor de knockdown PPAR δ no crescimento do tumor como demonstrado neste estudo.

O saldo da proliferação e apoptose desempenha um papel vital no controle do crescimento tumoral. A progressão do crescimento do tumor é caracterizado por uma proliferação acrescida e /ou diminuição da apoptose, ou de ambas. No presente estudo, verificou-se que a expressão de Ki67 foi significativamente aumentada enquanto a apoptose de células tumorais não foi alterado após PPAR δ knockdown. Isto demonstra que o PPAR δ knockdown pode promover a proliferação enquanto que não têm efeito sobre a apoptose de células de cancro do cólon. Este resultado é consistente com as nossas observações anteriores in vitro, que mostram que o PPAR δ knockdown promove a proliferação de células HCT-116, sem efeito sobre a apoptose [20]. O desequilíbrio da proliferação e apoptose é responsável pelo crescimento do tumor promovido após PPAR δ knockdown.

A angiogênese é um dos principais determinantes do crescimento tumoral, como tumor deve estimular o host para criar o seu próprio vasculatura de continuar a crescer quando ela cresce mais do que 1-2 mm

3 [21]. O VEGF é um gatilho de angiogénese e essencial para o desenvolvimento de vasos sanguíneos [22], [23]. Juntamente com o VEGF, outros genes relacionados com o crescimento estão envolvidos na angiogénese. Um estudo recente mostrou que a activação de PPAR δ VEGF sobre-regulada em células de cancro do cólon [24], implicando PPAR δ na angiogénese de cancro do cólon. No presente estudo, mostra-se que o VEGF foi significativamente aumentada em ambos as células KM12C e os xenoenxertos após PPAR δ knockdown, e diminuição em células KM12C PPAR-δ normais enquanto as células inalterada no PPAR-δ silenciada depois do tratamento de GW501516. Isto demonstra que a activação de PPAR δ inibe a expressão de VEGF e deste modo pode atenuar a angiogénese de cancro do cólon. Este resultado é consistente com os estudos recentes que mostram que δ PPAR pode inibir a proliferação de células vasculares endoteliais [7], [25], [26]. A promoção da angiogénese mediada por VEGF pode ser outro fator subjacente ao crescimento do tumor promovido após PPAR δ knockdown.

Para examinar a influência do knockdown PPAR δ na sensibilidade quimioterapêutico, que trataram os ratos nu com bevacizumab. Após o tratamento, o crescimento do tumor, bem como a proliferação de células foi retardado e, obviamente, a apoptose foi aumentada em ambos os grupos, ao passo que o grupo de PPAR-δ silenciada mostraram ainda maiores capacidades de crescimento do tumor e a proliferação de células do que o grupo de PPAR-δ normal. Esta constatação demonstra que o PPAR δ knockdown reduz a sensibilidade do cancro do cólon ao bevacizumab, subjacente, que pode ser o aumento da proliferação e diferenciação de tumores diminuir. Isto também implica que, via VEGF mediada não é o único mecanismo por meio do qual o PPAR δ regula o crescimento do tumor. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira vez para relatar o efeito da PPAR δ na quimio-sensibilidade de cancro do cólon. Isso implica que, o cancro do cólon com a expressão normal ou alta de PPAR δ pode ter uma melhor resposta ao bevacizumab do que aqueles com baixa expressão de PPAR δ. Portanto, o nível de PPAR δ expressão pode ser um potencial preditor eficácia de bevacizumab, eo desenvolvimento e aplicação de agente de PPAR δ-agonista pode ser uma maneira eficaz para promover a eficácia de bevacizumab para câncer de cólon.

conclusão, mostramos aqui que o PPAR δ knockdown promove o crescimento do cancro do cólon, induzindo menos diferenciação e acelerar a proliferação das células, bem como a expressão de VEGF, enquanto não tem qualquer efeito na apoptose, independentemente do tratamento bevacizumab. a activação pelo ligando de PPAR δ diminui a expressão de VEGF em células de cancro do cólon. Estes resultados indicam que, PPAR δ pode inibir o crescimento do tumor por indução de diferenciação, atenuando a proliferação celular e na angiogénese mediada por VEGF na patogénese do cancro do cólon, e facilitar a sensibilidade do tumor para o bevacizumab. Estes resultados suportam a razão para o desenvolvimento de agonistas de PPAR δ para a prevenção e /ou tratamento de câncer de cólon.

Reconhecimentos

Agradecemos Prof. I.J. Fidler (Cancer Center Anderson, Houston, TX) para a oferta de linha de células KM12C.