Abstract

visa

receptor do factor de crescimento epidérmico inibidores da tirosina quinase (EGFR) (TKI) mostraram dramáticos benefícios clínicos no cancro do pulmão de não pequenas células avançado (CPNPC); No entanto, a resistência continua a ser um problema sério na prática clínica. O presente estudo analisou as diferenças de sinalização da via-associado-mTOR entre as linhas de células EGFR TKI-sensível e resistente à NSCLC e investigou a viabilidade de segmentação mTOR com inibidor de mTOR específica em células NSCLC resistente ao EGFR TKI.

Métodos

Foram selecionados quatro tipos diferentes de células NSCLC EGFR TKI-sensíveis e resistentes ao: PC9, PC9GR, H1650 e H1975 células como modelos para detectar diferenças de sinalização da via-associado-mTOR por western blot e imunoprecipitação e avaliaram o efeito antiproliferativa e parada do ciclo celular de ku-0063794 pelo método MTT e citometria de fluxo.

resultados

no presente estudo, observou-se que Akt Ser473-FOXO1 via de sinalização associada a mTORC2 em estado basal foi altamente activado em células resistentes.

In vitro

mTORC1 e mTORC2 atividades quinase ensaios mostraram que a prova de TKI EGFR linhas de células NSCLC tiveram maior atividade mTORC2 quinase, enquanto que as células sensíveis tinham maior atividade mTORC1 quinase no estado basal. O inibidor de mTOR ATP-competitiva ku-0063794 mostrou dramáticos efeitos antiproliferativos e interrupção do ciclo de células G1 em células ambos sensíveis e resistentes. Ku-0063794 no ic

50 concentração que inibia eficazmente ambos os níveis de fosforilação de mTOR e p70S6K; a última é um substrato mTORC1 e não regular positivamente a fosforilação de Akt Ser473 que seria induzida pela rapamicina e resultou em inibição parcial da fosforilação FOXO1. Observamos também que as amostras de tumores NSCLC clínicos EGFR TKI-sensíveis e resistentes ao tinha total mais elevada e os níveis de expressão p70S6K fosforilada.

Conclusão

Nossos resultados indicam associada à mTORC2 sinalização da via foi hyperactivated em EGFR células resistentes-TKI e alvo mTOR com inibidores de mTOR específicos é provável uma boa estratégia para pacientes com EGFR mutante NSCLC que desenvolvem EGFR TKI resistência; os potenciais papéis específicos de mTORC2 em células NSCLC-resistentes TKI EGFR eram ainda desconhecido e deve ser investigado

Citation:. Fei SJ, Zhang XC, Dong S, Cheng H, Zhang YF, Huang L, et al . (2013) Segmentação mTOR superar Fator de Crescimento Epidérmico Receptor de tirosina-quinase de resistência aos inibidores de Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 8 (7): e69104. doi: 10.1371 /journal.pone.0069104

editor: Jingwu Xie, da Escola de Medicina da Universidade de Indiana, Estados Unidos da América

Recebido: 14 de fevereiro de 2013; Aceito: 05 de junho de 2013; Publicação: 16 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Fei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 30772531 e No. 81.071.699, www.nsfc.gov.cn), Guangdong desenvolvimento social dos projectos do plano de ciência e tecnologia (Não: 2011A030400010, www.gdstc.gov .cn /). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores receberam Gefitinib da AstraZeneca para experiências in vitro em seu laboratório. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) via de sinalização desempenha um papel central no desenvolvimento e progressão do câncer de pulmão [1]. EGFR inibidores da tirosina cinase (TKI) gefitinib e erlotinib são terapias clínicas eficazes para doentes com NSCLC avançado que têm mutações activados por EGFR, em comparação com o padrão de quimioterapia de primeira linha citotóxico [2] – [4]. No entanto, apesar destas vantagens dramáticas de TKI de EGFR, todos estes pacientes inevitavelmente desenvolver resistência a gefitinib e erlotinib, normalmente de 6-12 meses após o início do tratamento TKI [5]. Vários mecanismos, incluindo uma mutação T790M em EGFR, amplificação MET, e a sobre-expressão do factor de crescimento de hepatócitos (HGF), induzir a resistência adquirida à reversível EGFR-TKI para NSCLC com mutações de activação de EGFR [6] – [8]. Um meio de superar a resistência TKI permanece um desafio na prática clínica. Geralmente, as estratégias para superar a resistência considerar o mecanismo de resistência em si [7], [9], [10], ao passo que uma estratégia alternativa é a de identificar novas moléculas ou mecanismos que vencer a resistência, tais como mTOR.

mTOR é uma cinase de serina /treonina conservado que ocorre em mTORC1 e complexos mTORC2 [11]. Ele integra sinais de fatores de crescimento, o fornecimento de nutrientes e estado de energia para ativar o crescimento celular, e é regulada em vários tipos de câncer [12]. Portanto, os estudos de segmentação mTOR para terapia de câncer têm recebido atenção nos últimos anos. No entanto, a resposta clínica a rapamicina e os seus análogos tem sido fraco [13]. Muitos estudos têm demonstrado os mecanismos da sua resposta pobre tanto

in vitro

e

in vivo

[14] – [16]. O nosso relatório anterior também mostrou que todas as linhas celulares de NSCLC em nosso laboratório são resistentes a RAD001 (um análogo de rapamicina) [17]. De facto, a rapamicina inibe apenas parcialmente funções mTORC1 e em vez disso induz a fosforilação de Akt Ser473 [16] e não inibe mTORC2 em tudo [18]. Estudos mais recentes têm indicado que mTORC2 regula a sobrevivência da célula e organização do citoesqueleto, regulando fosforilação de seus substratos, Akt motivo hidrofóbico (HM) local (Ser473) e sítio PKCα HM (ser657) [19], [20]. actividade aumenta mTORC2 quinase em alguns tumores; Assim, a segmentação mTORC2 poderia inibir o crescimento de células cancerosas e proliferação [21] – [23]. Portanto, a hipótese de que mTORC2 desempenha um papel importante no crescimento e proliferação celular e que a segmentação mTOR com inibidores de mTOR específicos iria produzir melhores efeitos anti-tumorais após resistência adquirida-TKI.

Em primeiro lugar, analisou diferenças na mTOR- vias de sinalização associadas entre as células NSCLC EGFR TKI-sensíveis e resistentes ao em um estado basal

in vitro

. Então, nós ensaiadas mTORC1 e mTORC2 actividades de quinase

in vitro

. Finalmente, avaliou-se a efeitos antiproliferativos e ciclo celular prisão de ku-0063794 e analisou a expressão de p70S6K total e fosforilada em amostras tumorais.

Materiais e Métodos

Os anticorpos e Regents

Ku-0063794 (TOCRIS, Minneapolis, MN, EUA) e gefitinib puro, gentilmente fornecida pela AstraZeneca, foram preparados em DMSO e diluídos com meio de cultura antes da sua utilização. mTOR (# 2983), p-mTOR (# 2971), Rictor (# 2114 e # 5379), Raptor (# 2280 e # 5382), Akt (# 9272), Ser473 p-Akt (# 4060), p-p70S6K (# 9208), p-4EBP1 (# 9459), FOXO1 (# 2880) e p-FOXO1 (# 9461) anticorpos para transferência de western e a imunoprecipitação foram todos adquiridos a partir de CST (Beverly, MA, EUA). p70S6K (# ab47504) e p-p70S6K (# ab60947) anticorpos para transferência de Western e imuno-histoquímica foram adquiridos a Abcam (Cambridge, MA, EUA). Inactiva Akt1 /PKB1 (# 14-279) e 4E-BP1 (# 10022-H07E) foram adquiridos a Millipore (Bedford, MA, EUA) e sino Biológica (Pequim, China), respectivamente.

Linhas Celulares

O humano adenocarcinoma de pulmão linhas celulares PC9, H1650, H1975 e (ATCC, Manassas, VA, EUA) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Tony Mok, Universidade chinesa de Hong Kong. células PC9 abrigar um EGFR exão 19-frame exclusão e são altamente sensíveis ao EGFR TKI. células H1650 abrigar um EGFR exão 19-frame exclusão e são resistentes ao EGFR TKI. células H1975 transportar a mutação do EGFR T790M-L858R e são resistentes ao TKI de EGFR. PC9GR a resistência adquirida gefitinib pela exposição crônica das células PC9 e médio com concentrações crescentes gefitinib. Resumidamente, as células foram expostas a PC9 10 nM de gefitinib em meio contendo FBS a 10%, e a concentração foi aumentada de um modo gradual. As células que foram capazes de crescer em 1? M gefitinib foram obtidos 6 meses após a exposição inicial.

Análise Western Blot

As células foram cultivadas em 25 cm

2 garrafas de cultura, sem qualquer droga e colhidas na fase log do crescimento para a extracção de proteínas. As células foram lisadas em tampão de lise RIPA contendo PMSF 1 × e um cocktail de inibidores de fosfatase ×. A concentração de proteína de cada ligado foi determinada usando o ensaio de ácido bicinconínico. As amostras foram sujeitas a SDS-PAGE. As proteínas foram detectadas utilizando o kit de quimioluminescência aumentada (Thermo, Rockford, IL, EUA).

Para a quantificação dos níveis da proteína, os filmes foram digitalizados e analisados ​​com o software labwork. Os níveis relativos de proteína foram contadas utilizando uma comparação com células PC9.

A imunoprecipitação e Kinase Assays

As células na fase log de crescimento foram lisadas em 0,5 ml de tampão de lise arrefecido em gelo (40 mM Hepes pH 7,5, 120 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 × cocktail de inibidores de fosfatase, 1 × isento de EDTA cocktail de inibidores de protease contendo 0,3% [W /v] CHAPS) [24]. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Adicionou-se uma alíquota de 10 uL de conjugado de grânulo imobilizado com o anticorpo indicado e incubaram-se com rotação durante 90 minutos à temperatura ambiente. Os imunoprecipitados foram lavados quatro vezes com tampão de lise de CHAPS e uma vez com o tampão de quinase Rictor-mTOR (mM de HEPES pH 7,5 25 acetato de potássio, 100 mM, MgCl 1 mM de

2). Os imunoprecipitados foram incubadas num volume final de 15 uL durante 20 min a 37 ° C em tampão de quinase Rictor-mTOR contendo 500 ng inactivo Akt1 /PKB1 ou 4E-BP1, na presença de ATP para a reacção de quinase. A reacção foi parada pela adição de 200 ul de tampão arrefecido com gelo de diluição de enzima (MOPS 20 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM, 0,01% [W /v] Brij 35, 5% de glicerol, 0,1% de 2-mercaptoetanol e 1 mg /ml de BSA). Após uma curta centrifugação, o sobrenadante foi removido a partir do talão conjugado Sepharose e analisados ​​por imunotransf erência. Os imunoprecipitados foram desnaturados e resolvidos por SDS-PAGE, e os géis foram corados com um kit de coloração com prata.

Avaliação de efeitos antiproliferativos

A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio MTT, em conformidade com o método de Mosmann e Carmichael [25], [26], e a linearidade entre os números de células e os valores de densidade óptica foi estabelecida. A actividade antiproliferativa de tratamento com um único agente foi avaliada em monocamadas individuais, com células cultivadas em placas de 96 poços. O número de células por poço foi PC9 2000, 2000 PC9GR, 1200 H1650, H1975 e 3.000 células. O

valor de IC 50 foi a concentração que resulta em 50% de inibição de crescimento celular após uma exposição de 72 horas para a droga em comparação com a de células de controlo não tratadas.

Análise de citometria de fluxo de ciclo de distribuição celular

As células foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 1 x 10

5 por poço e deixou-se assentar durante a noite. Em seguida, as células foram tratadas durante 72 h com Ku-0063794 do IC

50 concentração. As células foram tripsinizadas, contadas, lavadas e ressuspensas. As células foram então sedimentadas e fixa-se a adição gota a gota de etanol a 70% arrefecido com gelo, armazenado em PBS, e depois ressuspenso em solução de iodeto de propídio (180 ug /ml) e analisadas utilizando citometria de fluxo.

Os pacientes com NSCLC

amostras tumorais de gefitinib ou pacientes tratados com erlotinibe foram obtidos a partir de Guangdong Hospital Geral (Guangzhou, China). O estudo foi aprovado pelo comitê de ética de Guangdong Hospital Geral. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito. A presença da mutação do EGFR em cada amostra foi confirmado por amplificação específica do exão (exões 18-21), seguida por sequenciação directa ou a amplificação de mutação refractário Scorpion [27]. amplificação MET foi analisada por reacção quantitativa relativa em tempo real em cadeia da polimerase [28].

p70S6K Imunohistoquímica

Imuno-histoquímica para total e fosforilada p70S6K foi realizada em lâminas de vidro carregadas positivamente que contêm seções 5 mícrons de fixado em formalina, tecido embebido em parafina. As lâminas foram desparafinadas, seguido por re-hidratação com concentrações decrescentes de etanol em série, e em seguida imerso em 3% H

2O

2 para inibir a actividade da peroxidase endógena. Após recuperação de antigénio em tampão de 1 mM de EDTA, pH 8,0, as secções de tecido foram incubadas com tampão (/5% de soro de cabra normal TBST) de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente. As secções foram então incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo primário diluído em diluente de anticorpo 1:100. O sistema de detecção Envision foi usado para visualização, de acordo com as instruções do fabricante. As secções foram contrastadas com hematoxilina de Harris, desidratados, e montado de forma permanente.

Avaliação da imuno-coloração

Todas as lâminas foram avaliadas de forma independente por dois patologistas que foram cegados para os casos. Casos com coloração em 10% das células foram consideradas positivas. imuno-reactividade foi graduada numa escala de 0-3 de acordo com a intensidade de coloração e a percentagem de células imunopositivas como se segue: 0, sem coloração; 10% de células positivas; 1, coloração fraca em 10% de células tumorais ou de coloração moderada em 10-40% das células tumorais; 2, coloração moderada em 40% das células tumorais ou forte coloração em 10-40% das células tumorais; 3, coloração forte em 40% das células tumorais [29]

Estatísticas

Os resultados são apresentados como médias ± erros padrão de, pelo menos, três experimentos

Resultados..

Akt Ser473-FOXO1 via de sinalização em EGFR células NSCLC-resistentes TKI foi altamente ativada no estado basal

Compreender as diferenças de sinalização da via-associado-mTOR entre as células NSCLC EGFR TKI-sensíveis e resistentes ao é fundamental para o direcionamento mTOR para superar a resistência do paciente após o tratamento TKI. No entanto, o conhecimento das diferenças de vias de sinalização entre as células NSCLC EGFR TKI-sensíveis e resistentes ao que falta. Aqui, nós seleccionado primeiras quatro linhas celulares de NSCLC diferentes que abrigam diferentes mutantes de EGFR, e que diferem na sensibilidade a inibidores da tirosina quinase, como modelos de células para análise das diferenças de sinalização-caminho em um estado basal por western blot. Como mostrado na Fig. 1, o mTOR total e fosforilada, proteínas Raptor, e rictor teve mais elevados níveis de expressão basal em todas as quatro linhas celulares de NSCLC. Em seguida, foram detectadas diferenças na via de sinalização associada-mTORC2 através da determinação do estado de fosforilação de Akt Ser473 e FOXO1. Curiosamente, verificou-se que as linhas celulares resistentes a TKI EGFR especialmente células H1650 (albergando a deleção de EGFR em 19 de exão e resistente a TKI) tinham níveis Ser473 mais elevadas de p-Akt que fez células sensíveis TKI-(células PC9) e expressão Ser473 P-Akt nível em células PC9GR (linha de células resistentes adquirida na gefitinib) também foi bastante elevado. Este resultado foi consistente com um relatório que as células PC9GR reduziram fosfatase e expressão homólogo tensina, o que levou a regulação positiva dos níveis de Ser473 P-Akt [30]. FOXO1 estado de fosforilação, a qual é regulada positivamente pelo local de Akt HM (Ser473) e estado de fosforilação inibe a apoptose de células [31], foi quase coerente com os níveis de p-Ser473 Akt nas quatro linhas celulares. Nós também detectada a expressão de p70S6K fosforilada e total, que é o substrato da mTORC1 e descobriram que todas as quatro linhas celulares tinham mais elevados níveis de fosforilação p70S6K. Tomados em conjunto, os nossos dados indicam que as células EGFR mutante NSCLC tinham níveis basais de expressão mais elevada de mTOR, e Rictor rapina e Akt Ser473-FOXO1 via de sinalização associada-mTORC2 foi hyperactivated em células resistentes.

As células foram cultivadas em meio completo sem tratamento medicamentoso. As proteínas foram extraídas a partir de células na fase logarítmica do crescimento, e os lisados ​​celulares foram imunotransferidas para detectar as proteínas indicadas. O experimento, repetido três vezes, produziu resultados semelhantes.

resistentes a TKI EGFR linhas de células NSCLC tinha Superior mTORC2 Kinase atividades, enquanto que as células sensíveis teve mTORC1 Superior Kinase Atividade no estado basal

com base nos resultados acima, a hipótese de que as células TKI de EGFR-sensíveis e resistentes ao têm uma actividade quinase mTORC2 diferente. Em seguida, ensaiou-se os mTORC2 actividade cinase nas quatro linhas celulares de NSCLC por imunoprecipitação. Em primeiro lugar, foi utilizado o anticorpo Rictor específica para puxar para baixo mTORC2 no immunoprecipitate. SDS-PAGE de coloração de prata (Fig. 2A) mostrou que as imunoprecipi tacões foram bem sucedidos que também foram verificados por Western blot dos imunoprecipitados (Fig. S1). Ser473 Akt foi um dos substratos identificados de mTORC2 e vários papéis usou-o como um substituto para representar a atividade mTORC2 [21], [24]. Assim, utilizou-se a proteína recombinante inactiva, Akt1 /PKBα, como um substrato para reagir com o imunoprecipitado

In vitro

, e, em seguida, detectados a Ser473 P-Akt. Como mostrado na Fig. 2B, embora a concentração de proteína de lisado de células na imunoprecipitado celular H1650 foi menor do que a dos outros três linhas de células, a actividade de quinase mTORC2 foi a mais elevada. A partir da Fig. 2B, também se pode ver que a atividade quinase mTORC2 em células PC9 foi o menor, e que em PC9GR e H1975 células tinham actividade quinase intermediária. Estes resultados foram quase consistente com os níveis de p-Ser473 Akt mencionados acima. Nós também detectada atividade mTORC1 quinase

in vitro

para comparar as diferenças entre mTORC2 e mTORC1 actividades de quinase em células NSCLC EGFR TKI-sensíveis e resistentes. FIG. 2C mostraram que também puxou para baixo com sucesso mTORC1. Como mostrado na Fig. 2D, embora a concentração de proteína na célula imunoprecipitado PC9 foi menor do que nos outros três células, a actividade de quinase mTORC1 foi a mais elevada. mTORC1 actividade cinase foi mais baixa em células H1650 e H1975. A partir da fig. 2B e 2D, também se pode ver que, nas mesmas células quando a atividade mTORC2 quinase foi regulada a actividade mTORC1 quinase seriam reprimidos indicando que se mTORC1 e mTORC2 existem em equilíbrio dinâmico. Tomados em conjunto, os nossos resultados mostraram que, embora ambas as células NSCLC EGFR TKI-sensíveis e resistentes ao tiveram maior expressão mTORC1 e mTORC2 no estado basal, as células resistentes a TKI EGFR apresentaram maior atividade mTORC2 quinase, enquanto que as células EGFR TKI sensíveis tinham maior mTORC1 quinase atividade.

(a, C) SDS-PAGE prata proteína coloração dos imunoprecipitados mTORC2 e mTORC1 preparados a partir de lisados ​​celulares PC9 com Rictor (D16H9) mAb Coelho (Sepharose Bead Conjugado) (# 5379) e Raptor (24C12 ) Rabbit mAb (Sepharose Bead Conjugado) (# 5382) comprado de CST, respectivamente. (B, D) A primeira coluna representa as concentrações de proteína e rictor rapina, respectivamente, em lisados ​​celulares. Os níveis de proteína relativos são contadas utilizando uma comparação com células que PC9 definida como 1,00. Os imunoprecipitados foram utilizados em ensaios de cinase com de comprimento completo, de tipo selvagem Akt1 /PKB1 humana recombinante e 4E-BP1 como substratos. A imunotransferência foi utilizado para detectar Akt /PKB a fosforilação em Ser 473 e 4E-BP1 em Thr 37/46, respectivamente. Os valores da relação de p-Akt Ser473 /t-Rictor e p-4EBP1 /t-Raptor representam a atividade de cinase de mTORC2 e mTORC1 respectivamente. O experimento, repetido três vezes, produziu resultados semelhantes.

Ku-0.063.794 inibiu a proliferação celular e resultou em G1 paragem do ciclo celular em células EGFR TKI-sensíveis e resistentes ao NSCLC

Selective inibidores de mTOR, tal como a Ku-0063794, inibir tanto mTORC1 mTORC2 e em diferentes linhas de células [32]. Neste estudo, foram avaliados os efeitos antiproliferativos de ku-0063794 em células NSCLC EGFR TKI-sensíveis e resistentes ao comparados com os de gefitinib que foram previamente relatados em nosso laboratório [17], [33]. Os dados indicaram efeitos dose-resposta de inibição do crescimento em PC9, células PC9GR, H1650, H1975 e. A Tabela 1 e Fig. 3A mostrou que a Ku-0063794 inibiu a proliferação de células em ambas as células NSCLC TKI de EGFR-sensíveis e resistentes ao em nanomolar (nM) concentrações, ao passo que o gefitinib inibida apenas células PC9 em concentrações nM. concentrações gefitinib maiores (MM) foram necessários para chegar ao IC

50 valor em células resistentes a TKI EGFR, que excedem em muito as concentrações plasmáticas máximas em pacientes [34]. Também se avaliou o ciclo celular após tratamento com Ku-0063794 do IC

50 nível por citometria de fluxo e verificaram que todas as quatro linhas de células foram bloqueadas na fase G1 depois de um 72-hr tratamento Ku-0063794, em particular as células PC9 e PC9GR , em comparação com a de células de controlo sem qualquer tratamento medicamentoso (Fig. 3B).

(a) Inibição da eficiência de Ku-0063794 nas quatro linhas celulares de NSCLC. (B) A Ku-0063794 induzida paragem do ciclo celular em ambas as células TKI de EGFR-sensíveis e resistentes ao. O painel superior representa distribuições do ciclo celular basal da PC9, PC9GR, H1650 e H1975 linhas de células, respectivamente, e o painel inferior representa as distribuições do ciclo celular de PC9, PC9GR, H1650 e H1975 células após o tratamento com o CI

50 concentrações de ku-0063794 para 72 horas.

Porque ku-0.063.794 exibiu efeitos antitumorais dramáticas, analisamos ainda mais a sua actividade antiproliferativa no IC

50 concentração por western blot. Em primeiro lugar, foram detectados estado de fosforilação de mTOR após o tratamento com Ku-0063794 no ic

50 concentrações em todas as quatro linhas de células, respectivamente (Fig. 4A). Em seguida, analisou-se ainda mais o estado de fosforilação de proteínas da via mTOR sinalização associada (Fig. 4a). Através do software labwork quantitativa de proteína, analisou-se a proporção de proteína fosforilada mais de proteína total no estado basal e após o tratamento com Ku-0063794 no ic

50 concentrações em todas as quatro linhas de células (Fig. 4B). Como mostrado na Fig. 4A e 4B, Ku-0063794 estado de fosforilação de mTOR eficazmente inibida e, em seguida, inibiu fortemente a fosforilação de p70S6K que é um substrato de mTORC1. A partir da Fig. 4B, nós também podemos ver que ku-0.063.794 no IC

50 concentrações não aumentam significativamente a expressão Ser473 p-Akt especialmente em células PC9 e PC9GR que poderiam ser induzidas por rapamicina [16]. Na verdade, as proporções de P-Akt Ser473 /t-Akt em H1650 e H1975 células diminuiu resultante nas proporções reduzidas de p-FOXO1 /t-FOXO1 nestas células em comparação com que, no estado basal. Assim, ku-0063794, como um inibidor de mTOR ATP-competitiva novela, mostraram efeitos antiproliferativos marcados e interrupção do ciclo celular G1 induzida tanto em células NSCLC EGFR TKI-sensíveis e resistentes ao

in vitro

.

(a) células foram tratadas durante 72 h com Ku-0063794 no ic

50 concentrações, e os lisados ​​celulares foram imunotransferidas para detectar as proteínas indicadas. O experimento, repetida três vezes, deu resultados semelhantes. (B) Os rácios de mTOR via de sinalização associados proteínas fosforiladas mais de proteínas totais no estado basal e após tratamento com ku-0.063.794 no IC

50 concentrações em todas as quatro linhas celulares.

Análises de EGFR TKI Clínica-sensível e resistente à Lung Adenocarcinoma os tecidos mostrou total Superior e fosforilada p70S6K expressão em ambos os cânceres sensíveis e resistentes

Desde ku-0.063.794 no IC

50 concentração que inibia eficazmente os níveis de fosforilação p70S6K tanto células NSCLC sensíveis e resistentes, estes resultados indicaram que a Ku-0063794 pode exercer mais efeitos antitumor em tumores que expressam níveis elevados de p70S6K, total ou fosforilada. Nós examinamos amostras tumorais de pacientes gefitinib- ou tratados com erlotinib com EGFR-mutante NSCLC (Fig. 5). Todos os pacientes tiveram uma resposta tumor clínica parcial para gefitinib ou erlotinib e, posteriormente, desenvolveram resistência aos medicamentos clínica. Nós avaliamos a expressão de p70S6K total e fosforilada em cinco pacientes por imuno-histoquímica; um com amostras pareadas obtidas antes e após o tratamento geftinib, dois com amostras sensíveis à droga, e dois com espécimes resistentes aos medicamentos. Detectamos o estado da mutação T790M e amplificação MET em todas as amostras resistentes aos medicamentos. Ambos os espécimes de tumor de drogas sensíveis e resistentes a fármacos teve maior expressão total de p70S6K (Fig. 5B e 5C). Encontramos também maior expressão p70S6K fosforilada nestes tumores. Estes achados sugerem que o câncer tanto de drogas sensíveis e resistentes ao tinha total maior e expressão p70S6K fosforilada, e que p70S6K pode ser um bom indicador de uma resposta a ku-0063794.

(A) Resumo dos tumores em gefitinib e doentes tratados com erlotinib, incluindo três casos de drogas sensíveis e resistentes ao, respectivamente. Caso 3 foi uma amostra emparelhado antes e após o tratamento TKI. ADC representa adenocarcinoma. (B) Expressão de p70S6K total e fosforilada nos casos TKI de EGFR-sensíveis. O painel superior representa p70S6K total e o painel inferior representa p70S6K fosforilada. (C) A expressão da p70S6K total e fosforilada nos casos resistentes-TKI de EGFR. O painel superior representa p70S6K total e o painel inferior representa p70S6K fosforilada. ADC representa adenocarcinoma; S e R representam sensível a maiúsculas e caso resistente, respectivamente. Barras de escala, 50 mm.

Discussão

vias EGFR sinalização estão envolvidos no desenvolvimento e progressão do câncer de pulmão. A ligação de EGFR ao seu ligando EGF conduz à dimerização e inicia uma série de cascatas de sinalização a jusante através da PI3K-Akt-mTORC1, Erk, e vias STAT3 [35]. Estudos anteriores têm demonstrado que os padrões de sinalização activadas por EGFR mutantes diferem dos activada por ligando EGFR de tipo selvagem, e que os mutantes sensíveis ao EGFR resultantes de sinalização de EGFR constitutivamente activar e escapar regulação negativa [36] – [39]. mutações sensíveis ao EGFR tornaram-se os preditores efeito curativo para TKI, e os benefícios clínicos dramáticos de TKI são em grande parte baseado em uma profunda compreensão das vias de sinalização mutantes sensíveis ao EGFR. Portanto, as alterações de compreensão nas vias de sinalização depois que os pacientes desenvolvem resistência a EGFR TKI é muito importante para superar a resistência. Vários mecanismos de resistência TKI foram demonstradas nos últimos anos, incluindo o mutante T790M [40], a amplificação MET [7], e a sobre-expressão de HGF [8]. A maioria das estratégias actuais para superar a resistência adquirida-TKI envolvem visando o mecanismo de resistência em si. Por exemplo, a segunda geração de inibidores da tirosina quinase, tais como irreversíveis BIBW 2,992 para os pacientes com uma mutação T790M e inibidores de MET combinado com TKI de EGFR para a amplificação MET [7], [9] – [10]. Aqui, fornecemos uma nova perspectiva para procurar novos alvos moleculares para superar a resistência através da análise sistemática de sinalização diferenças caminho entre células NSCLC EGFR TKI-sensíveis e resistentes ao

in vitro

. Os nossos dados mostraram que a AKT Ser473 associada-mTORC2-FOXO1 via de sinalização foi altamente activado em células NSCLC resistentes-TKI de EGFR, no estado basal e

In vitro

mTORC1 e mTORC2 actividades de quinase verificado destes resultados. (Fig. 1 e 2). Estes resultados indicam que o direccionamento de mTOR incluindo mTORC2 poderia alcançar melhores efeitos antitumorais

mTOR é um controlador central do crescimento celular, a proliferação, metabolismo, e angiogénese.; no entanto, os inibidores de mTOR atuais, como RAD001, mostram actividade clínica modesta apenas contra NSCLC pré-tratados [14]. De facto, a rapamicina alvo apenas um subconjunto das actividades intracelulares de mTORC1. A rapamicina inibe alostericamente a actividade quinase mTORC1 por ligação a proteína celular FKBP12 distai para o local activo de quinase [15]. Em alguns casos, mTORC1 é sensível à rapamicina e completamente inibe a fosforilação mediada por S6K1 mTORC1. Como relatado anteriormente, a rapamicina induz a fosforilação de Akt Ser473 o que reduz o seu efeito anti-tumor através de Akt Ser473-FOXO1 via de sinalização devido ao alívio de realimentação de S6K-IRS-PI3K [16], [41]. Na verdade, Akt fosforilação Thr308 é regulada positivamente pela PI3K-PDK1 e Akt fosforilação Ser473 é controlado positivamente pela mTORC2 [20], sugerindo que se a inibição de mTORC1 iria promover a atividade mTORC2 quinase. Nossos dados indicam um equilíbrio dinâmico entre mTORC1 e mTORC2 que deve ser confirmado nos próximos estudos (Fig. 2B e 2D) e explicar por que os efeitos RAD001 mediadas são fracos em todas as linhas de células NSCLC

in vitro

. Os resultados sugerem que tanto mTORC1 e mTORC2 deve ser orientada

Os inibidores de mTOR ATP-competitivos novos (

e

.

g

., Torin1, PP242, ku-0.063.794. , e WAY-600), que inibem tanto a mTORC1 e mTORC2, exercem efeitos sobre a síntese proteica, o crescimento de células e proliferação de células marcadas, e promover fortemente autofagia em vários tipos de células de cancro

in vitro

[32], [ ,,,0],42]. Estes inibidores de mTOR ainda estão na fase inicial de avaliação; assim, o seu potencial terapêutico para o cancro permanece incerto. Na verdade, inibidores de mTOR, tais como novos Torin1 e PP242, têm efeitos anti-proliferativos que são mediadas principalmente por inibição completa da mTORC1, mas não mTORC2 [43], [44]. Nosso trabalho anterior e o papel da La Monica, mostram que as células NSCLC resistentes a TKI EGFR eram insensíveis a everolimus (RAD001), e everolimus poderia sinergia com gefitinib que constituiu mais uma estratégia alternativa para superar a resistência EGFR TKI [17], [45] . Em nosso estudo, descobrimos que a segmentação mTOR com Ku-0063794 também produziu melhores efeitos antitumorais e reduziu parada do ciclo celular G1 em células ambos sensíveis e resistentes por meio de ensaio de MTT e citometria de fluxo análise que deve ser reforçada pela capacidade de formação de colónias de ensaios (CFC) no futuro; não encontramos prisão significativa do ciclo de célula G1, embora a proliferação de células foi inibida em células H1975 por ku-0.063.794 que talvez principalmente devido a outras formas de morte celular como apoptose ou autofagia. Indicadores de apoptose e /ou autofagia iria continuar a ser investigada no futuro (Fig 3B.); os seguintes efeitos antiproliferativos de segmentação mTOR indicado que a Ku-0063794 não só inibiu os níveis de fosforilação p70S6K, mas também os níveis de fosforilação FOXO1 parcialmente inibida e não regular positivamente os níveis de fosforilação de Akt Ser473 (Fig. 4). Tomados em conjunto, os nossos dados e aqueles a partir de um relatório anterior [46] sugerem que a falta de um aumento em níveis de Akt Ser473 fosforilação pode ter sido devido à inibição da mTORC2; promovendo assim a efeitos antitumorais. Na verdade, os potenciais papéis específicos de mTORC2 em células NSCLC-resistentes TKI EGFR foram ainda desconhecido e deve ser mais estudada nos próximos estudos. Além disso, descobrimos que as células resistentes a TKI EGFR teve fosforilação Ser473 maior Akt. Como relatado anteriormente, Akt perifosina inibidor mostraram melhores efeitos anti-proliferativos em recidiva /Macroglobulinemia de Waldenstrom refractário [47] e Jeong et al também relataram que inibidores de Akt e inibidor mTORC1 sinergicamente aumento da morte celular em células NSCLC [48]. Todos estes sugerem que os inibidores da Akt pode ser outra boa alternativa de tratamento para tumores insensíveis TKI.