Abstract

A inibição da DNA via de resposta danos parece ser uma estratégia atraente para a terapia do cancro. Foi anteriormente relatado que, em células de roedores expostas a stress térmico, o crescimento celular foi promovida pela actividade de ADN-dependente cinase de proteína (ADN-PK), uma enzima envolvida no DNA extremidade não-homóloga de união (NHEJ) necessário para dupla cadeia quebrar reparo. A ausência de um DNA-PK funcionando foi associada a regulação negativa da proteína de choque térmico 70 (HSP70). O objectivo deste estudo é, portanto, para investigar o papel da inibição de ADN-PK na apoptose induzida pelo calor em linhas celulares humanas. Os inibidores da fosforilação da subunidade catalítica de ADN-PK (DNA-PKcs) em Ser2056, tais como NU7026 e NU7441, foram utilizados. Além disso, derrubar de ADN-PKcs foi realizada utilizando pequeno ARN interferente (Sidna-PKcs). Para a exposição ao calor, as células foram colocadas em banho-maria a 44 ° C durante 60 min. A apoptose foi avaliada após 24 h de incubação fluxo cytometrically. As proteínas foram extraídas após 24 h, e analisadas quanto à expressão de HSP70 e Hsp40 por Western blotting. O ARN total foi extraída 6 horas após o tratamento e analisadas utilizando um sistema de microarranjos GeneChip® para identificar e seleccionar os genes regulados positivamente (≥1.5 vezes). Os resultados mostraram um aumento na apoptose induzida pelo calor na ausência de funcionamento a DNA-PKcs. Interessantemente, os níveis de expressão de HSP70 e Hsp40 foram elevados na ausência de DNA-PKcs sob stress térmico. Os resultados da análise de rede genética mostrou que os genes HSPs e Jun foram up-regulada de forma independente do ADN PKcs no pai exposta e bater para fora das células. Na presença de funcionamento de ADN-PKcs, houve um observou sobre-regulação de genes anti-apoptóticos, como NR1D1, enquanto que na ausência de ADN-PKcs os genes pró-apoptóticos, como EGR2, foram preferencialmente regulado para cima. A partir desses resultados, concluímos que em células humanas, a inactivação da DNA-PKcs pode promover a apoptose induzida pelo calor de forma independente de proteínas de choque térmico

Citation:. Okazawa S, Furusawa Y, Kariya A, Hassan MA, Arai H, Hayashi R, et al. (2013) Inactivação de DNA-Dependent Protein Kinase Promove Heat-apoptose induzida Independentemente do Calor-Shock Protein Indução em linhas celulares de cancro humano. PLoS ONE 8 (3): e58325. doi: 10.1371 /journal.pone.0058325

Autor: Michael Sherman, Boston University Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de novembro de 2012; Aceito: 01 de fevereiro de 2013; Publicação: 11 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Okazawa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio financeiro para este estudo foi fornecido por um Grant-in-Aid para a Investigação científica (B) (22.390.229), Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os tumores malignos são um grande problema no mundo que, no domínio da investigação médica o desenvolvimento de terapêuticas eficazes tem sido sempre no topo de interesses de pesquisa ao longo de décadas. Este objectivo persistiu ao longo dos anos, apesar das inúmeras ferramentas terapêuticas disponíveis (tais como cirurgia, quimioterapia, radioterapia, hipertermia [1], o ultra-som de alta intensidade focado (HIFU) [2], a imunoterapia [3], etc), e a variedade de as suas combinações estratégicas [1], [4], [5]. Isso ocorre porque nenhuma dessas ferramentas tem funcionado perfeitamente, ou com segurança em erradicar cancros. No entanto, para definir bases científicas para as descobertas de novas abordagens, uma profunda compreensão da biologia molecular do câncer torna-se obrigatória. Recentemente, os estudos sobre DNA danos resposta (DDR) vias prestados nesta área como promissora no tratamento do câncer. A combinação de agentes que danificam o DNA com as drogas que alvejam moleculares contra os jogadores envolvidos nas vias de reparo de DNA pode resultar um efeito sinérgico em matar células cancerosas [6]. Os estudos sobre DDR revelou uma pletora de alvos moleculares, tais como a ataxia telangiectasia mutada (ATM), ataxia telangiectasia e relacionados com Rad3 (ATR), e proteína-quinase dependente de ADN (DNA-PK). Estas proteínas são membros da fosfoinositol 3-quinase-like kinase (Pikk) familiar funcionando como transdutores em DDR para ativar várias proteínas envolvidas na resposta celular ao dano ao DNA [7] – [9].

Foi relatado que a DNA-PK interage com o factor de transcrição de choque térmico (HSF1) [10]. Num estudo, o rato negativo linha celular scva2 ADN-PKcs e um combinado de ADN-PKcs linha celular positiva SC (8) -10 derivado a partir de scva2 pela introdução de um gene estrutural de ADN-PKcs, foram expostas a um tratamento térmico e a extensão foi avaliada de apoptose induzida por calor. As células negativas DNA-PKCS mostrou um pouco atrasado indução HSP70 que atingiu um nível de estado estacionário mais baixo. Esta observação foi justificado pela HSF1 e DNA-PKcs interação [11]. No entanto, como a ativação DDR por hipertermia não foi reconhecido na época, o envolvimento da ativação do ATM, fosforilação p53 [12], ea indução de γH2AX [13] por estresse térmico não foi relatado. Recentemente, a fosforilação de p53 em Ser15, bem como a sinalização intracelular da extremidade não-homóloga de união (NHEJ) foi revelado. Além disso, vários outros cenários de envolvimento DNA-PK em resposta ao estresse de calor, tais como sinal de sobrevivência de células-regulação pela fosforilação de Akt através do DNA-PK [14] e ativação de NFkB p50 [15], foram também relatados. Além disso, o nosso grupo demonstrou que a inibição de ADN-PK por inibidores de ADN-PK e técnica de RNAi promoveu a morte celular induzida por ultra-sons, independentemente de p53 fenótipo [16].

Neste estudo, iremos semelhante a investigar papel de ADN-PK na apoptose induzida pelo calor em diferentes linhas celulares de cancro humano. Nós supomos que a inibição de ADN-PKcs pode reforçar a morte celular induzida por hipertermia. Os detalhes dos mecanismos subjacentes também será estudada.

Resultados e Discussão

Heat-induzida apoptose foi reforçada por-PK DNA Inibidores

Controle e células tratadas foram analisadas para o grau de condensação da cromatina como um indicador para a indução de apoptose utilizando um fluxo Nuclear-ID ™ kit cromatina verde condensação medida cytometrically. A análise foi realizada 24 horas após a exposição ao calor na presença ou ausência de inibidores de ADN-PK. Como mostrado na Figura 1A B, ambos os inibidores de ADN-PK NU7026 e NU7441 reforçada apoptose significativamente após estresse por calor. Curiosamente, NU7026 não teve nenhum efeito sobre as células normais ao passo que sob condições induzidas NU7441 apoptose significativa em células HeLa na ausência de stress térmico. Esta foi provavelmente devido à maior potência da tarde contra outros membros das proteínas da família Pikk como alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) e phosphatidylinositide-3-quinase (PI3K) [17]. Deve ser indicado aqui que o DMSO foi confirmada para não interferir com os resultados obtidos (dados não mostrados).

de condensação da cromatina nas células na presença de 10 uM de (a) NU7026, ou (b) NU7441. (C) A inibição de ADN-PKcs fosforilação em Ser2056 por 10 uM de NU7026 NU7441 ou 6 horas após a exposição a stress térmico. (D) análise de transferência de Western dependente do tempo de células HeLa (0-6 h) mostra as alterações na fosforilação de DNA-PKcs a Ser2056 (DNA-PKcs-pS2056) e as HSPs; HSP70 e Hsp40, por 10 uM de NU7026. A caspase-3 clivada e expressão de HSP por Western Blotting 24 h após o tratamento na ausência ou na presença de 10 uM de (E) NU7026 ou (f) NU7441. NU7441 induzida fraca ativação da caspase-3, sem a exposição ao calor no aumento com os dados de condensação de cromatina. Os dados estão expressos como médias ± DP (*, P 0,05; **, P 0,01; NS, não significativo).

Western blotting, Figura 1C mostra que ambos os inibidores de êxito poderia suprimir a fosforilação de DNA-PKcs em Ser2056 às 6 h pós-exposição ao estresse térmico. análise dependente do tempo de células demonstraram que a fosforilação de DNA-PKcs a Ser2056 aumentou gradualmente com o tempo até seis horas depois do tratamento térmico. No mesmo curso de tempo, houve um aumento simultâneo na expressão de HSP70 e Hsp40. Surpreendentemente, mediante a inibição de ADN-PK, a DNA-PKcs-pS2056 diminuiu enquanto a expressão de HSP70 e Hsp40 manteve o seu aumento dependente do tempo (Figura 1D). A retenção de HSPs aumento padrão na ausência de ADN-PK vem em contraste com a diminuição associada relatado em células de ratinho e pode assim reflectir que a sensibilização de células humanas para a apoptose por meio da inibição de ADN-PK poderia funcionar independentemente de HSPs. Para provar esta diferença especial, confirmou-se que 10 pM de tratamento NU7441 diminuiu a expressão de HSP70 em células de ovário de hamster chinês, CHO-K1 (Figura S1).

morte celular através da indução da apoptose foi ainda confirmada por caspase 3 clivagem. Na Figura 1E F, caspase-3 clivada foi detectada 24 h pós aquecimento. A caspase-3 clivada foi significativamente aumentada em presença de inibidores especialmente NU7441. tratamento NU7441 induzida banda fraca em células não-aquecida no aumento de dados com a condensação da cromatina. Além disso, os dados revelam que o aumento da HSP70 e Hsp40 foi sustentado até 24 horas após o tratamento com inibidor de ADN-PK.

A apoptose foi Reforçada pela DNA-PKcs Knockdown Usando pequeno RNA de interferência

induzida por calor

de modo a confirmar o papel de ADN-PK na apoptose induzida pelo calor, foram realizados ensaios alternativos em células sem um ADN-PK funcional através de silenciar a proteína por um siRNA de ADN-PKcs-alvo (Sidna-PKcs). Os procedimentos de transfecção foram primeiro confirmados por transferência de Western 48 e 72 h após a transfecção. A Figura 2A mostra a ausência de bandas de ADN-PKcs endógenas, em todas as concentrações de Sidna-PKcs. Outras experiências foram assim realizados utilizando células transf ectadas a 20 nm. As células transfectadas com ARNsi de luciferase (siLuc, 20 nM) em condições semelhantes foram usados ​​como controlos negativos. Após a exposição ao calor, as células sem funcional de ADN-PK exibido condensação da cromatina significativa em comparação com células transfectadas com siLuc (Figura 2B). Em apoio, a caspase-3 bandas de 24 h após tratamento aumentou significativamente em células Sidna-PKcs-transfectadas. Estes resultados suportam ainda mais a função de DNA-PKcs na apoptose induzida pelo calor. Novamente, não houve relação óbvia entre HSP e silenciamento de ADN-PK após a exposição ao estresse térmico (Figura 2C). Esta descoberta vem em contraste com relatos sobre células de roedores que faltam funcional que mostra o ADN-PK que o nível de expressão de HSP70 sob stress térmico foi regulada para baixo [11] (Figura S2). Para confirmar a generalização a outras células humanas, foram realizadas experiências semelhantes em duas variantes de células de glioma maligno, a saber; células M059K com o funcionamento de ADN-PK e a DNA-PKcs variante M059J defeituoso. Como mostrado na Figura S3, a expressão de HSP70 e Hsp40 foi semelhante em ambas as células, independentemente do estado de ADN-PK. Como tal, pode concluir-se que em células humanas, a inibição de ADN-PK, aumenta a apoptose induzida pelo calor de forma independente de HSPs.

(a) células HeLa transfectadas com diferentes doses de pequeno RNA de interferência contra a DNA-PKcs (Sidna-PK) e da luciferase (siLuc); (B) células knockdown DNA-PKcs- expostos ao estresse térmico apresentaram maior percentual de condensação da cromatina; (C) o knockdown de DNA-PKcs reforçada activação da caspase-3 na sequência de stress de calor, independentemente da expressão de HSP70 e Hsp40 em 24 h após tratamento; (D) HSF1 banda de forma activa foi reforçada na ausência de DNA-PKcs 1 h após a exposição ao estresse térmico. Os dados são expressos como a média ± DP (**, P 0,01, NS; não significativa).

A expressão de HSF1 forma activa foi analisada em células HeLa em 1 h de exposição pós calor ( 44 ° C durante 60 min). forma activa HSF1 foi regulado para cima, na ausência de ADN-PKcs (Figura 2D). Esta constatação reflete que a ativação HSF1 não necessita de ADN PKcs.

Análise Gene Expression

Figura 3A mostra que o estresse calórico pode-regulam 403 conjuntos de sondas por ≥1.5 vezes, tanto no siLuc- e células Sidna-PKcs-transfectadas (grupo 1). Mais 160 conjuntos de sondas foram regulados positivamente em estresse por calor por ≥1.5 vezes em células siLuc transfectadas somente (grupo 2) Considerando que 179 conjuntos de sondas foram up-regulada por ≥1.5 vezes em células Sidna-PKcs-transfectadas (grupo 3). A rede genética que compreende genes grupo 1 mostrou que as HSP, tal como HSP70 (HSPA6) e Hsp40 (DNAJB1), foram altamente expressos (Figura 3B). genes pró-apoptóticos como Jun proto-oncogene (junho) e FBJ murino osteosarcoma viral oncogene homólogo B (FOSB) também foram identificados como genes up-regulamentados. O aumento da regulação do Grupo 1 genes em ambas as variantes de células sugere que esses genes respondem ao estresse térmico, independentemente do estatuto DNA-PK, a coisa que suporta ainda os dados de Western blot. Semelhante a células HeLa, os nossos estudos anteriores mostraram que a expressão do fecho de leucina-região de base (bZIP) factores de transcrição jun, ATF3 e FOS também foram reforçados em células U937 linfoma humanos que mostram a apoptose após a exposição a stress térmico a 44 ° C durante 15 min [18]

(a) diagrama de Venn ilustrativa de genes regulados positivamente em siLuc- e Sidna-PKcs-transfectadas células após a exposição ao estresse térmico.; (B) Comum genes em ambas as células siLuc- e Sidna-PKcs transfectadas expostos ao estresse térmico sobre-regulada (Grupo 1); a rede genética é exibido graficamente como nós (genes) e arestas (as relações biológicas entre genes). A cor do nó indica o nível de expressão do gene respectivo. Nós e bordas são apresentadas em várias formas e etiquetas que representam as classes funcionais de genes e a natureza da relação entre os nós, respectivamente. Esta rede mostra que genes HSP não foram associados com status de DNA-PK e que genes relacionados-JUN foram sobre-regulada em resposta ao calor induzida por danos às células.

O perfil de alguns genes selecionados expressão, nomeadamente; HSPA6, DNAJB1, DNAJA4 e Jun, foi determinada utilizando-qPCR em tempo real (Figura 4A-D). Os resultados mostraram que os níveis de ARNm destes genes foram significativamente aumentados por stress de calor.

Células

HeLa foram tratados a 44 ° C durante 60 min e, em seguida, incubadas a 37 ° C durante 6 h. Os níveis de expressão de ARNm de (a) DNAJB1 (Hsp40), (b) HSPA6 (HSP70), (c) DNAJA4, (d) jun, (e) NR1D1, (f) AHR, (g) BIRC3, (h) JUND , (i) EGR2 e (j) KLF4 normalizados para o nível de expressão de GAPDH. Os dados são expressos como a média ± DP (*, P 0,05; **, P 0,01; NS, não significativo)

A seguir, descrita a possível rede genética que compreende a. genes regulados positivamente em células siLuc-transfectadas (grupo 2) (Figura 5A). Os genes identificados incluiu genes pró-apoptóticos que funcionam através de vias relacionadas com o TNFa, tais como TLR4 [19], RIPK2 [20], e TNFRSF10B, também conhecido como DR5, que pode ser activado por necrose tumoral a apoptose ligando induzir relacionado com o factor [21 ]. Os factores associados ao receptor de factor de necrose de tumor, tais como TRAF2 e TRAF6, também foram detectadas. TRAF2 medeia a sinalização a partir da superfamília do TNF-R para a activação de JNK (c-Jun N-terminal Kinase) ou NFkB [22]. TRAF6 também participa na via de sinalização da superfamília de TLR e induz a apoptose através de uma via dependente de caspases e aumenta a activação de NFkB [23]. TRAF3IPs interage com as proteínas da família TRAF e ou i-kB ou cinase MAP quinase [24]. gene IRF1 induz a morte celular na presença de TNFa e INFγ [25]. Por outro lado, também foram identificados alguns genes de sobrevivência celular. A sobre-regulação dos genes de sobrevivência foi de novo confirmada pelo ensaio de qPCR. A Figura 4E mostra que o nível de ARNm de NR1D1 foi regulado para cima em células transfectadas-siLuc enquanto sub-regulada em DNA-PKcs células knockdown. NR1D1 é retratado na rede, como o gene que pode influenciar TLR4. NR1D1 foi relatado como sendo um gene alvo LXR em macrófagos humanos e reprime-TLR-4 induzida pelo LXR expressão [26]. Curiosamente, NR1D1 é um dos receptores intranucleares e é considerada contribuir para o sistema circadiano, no entanto, o modo biológico da sua acção é desconhecido. Um relatório recente sugere NR1D1 pode actuar sobre a actividade da enzima no metabolismo da gordura de crescimento epidérmico humano do receptor do factor 2 (ERBB2) -positivo cancro da mama, e para funcionar em sobrevivência celular [27], [28]. Assim, pode ser que NR1D1 é induzida sob stress de calor por ADN-PK para promover o metabolismo da célula para a sobrevivência. Da mesma forma, a Figura 4F G mostram a expressão diferencial de AHR e BIRC3 em ambas as variantes celulares. AHR tem muitas funções no ATM sinalização, diferenciação óssea, a diferenciação de linfócitos Th17, expressão P450, e a regulação do NFkB caminho [29], [30]. Além disso, aumenta o gene AHR SERPINE1 relacionados com citoprotecção [31], que também foi identificado como um gene sobre-regulado nos nossos estudos anteriores, [33] [32]. BIRC3 (inibidor de apoptose celular da proteína 2; cIAP2) é um dos inibidores de proteínas da família da apoptose. BIRC3 é induzida por TNFa através de NFkB via, e pode ser induzido por outras vias de PI3K, incluindo [34]. Neste ponto, foi importante para confirmar o papel destes genes em células de sobrevivência resgate após a exposição estresse por calor. Para isso, foram realizados experimentos knockdown contra NR1D1 e BIRC3 em células HeLa, seguido por tratamento térmico. A eficiência de derrubar foi verificada por análise de qPCR 24 h após transfecção (Figura S4). As células transfectadas foram expostas a stress térmico 24 h após a transfecção. A análise Western blot mostrou que os clivados níveis de caspase-3 aumentou ligeiramente em siNR1D1- e células transfectadas siBIRC3-24 h pós-tratamento (Figura S5). As células que carecem NR1D1 exibida aumento significativo na condensação da cromatina em comparação com células transfectadas com siLuc, ao passo que o knockdown de BIRC3 ligeiramente, mas não significativamente, aumentada a percentagem de células com cromatina condensada a seguir ao tratamento térmico (Figura S6).

( a) genes em células siLuc transfectadas expostos ao calor Up-regulada (Grupo 2 na Fig. 3A). Este grupo é composto por genes anti-apoptóticos tais como NFkB relacionado via genes, AHR e NR1D1; (B) genes em células Sidna-PKcs transfectadas expostos ao calor Up-regulada (Grupo 3 na Fig. 3A). Este grupo compreende genes pró-apoptóticos que normalmente são inibidas pela atividade DNA-PK, como EGR2, KLF4 e ATF4.

Figura 5B ilustra a possível rede genética que compreendem os genes regulados positivamente em Sidna -PKcs células transfectadas (grupo 3). A Figura 4H-J fornecer os resultados qPCR para alguns genes seleccionados, ou seja, JUND, ERG2 e KLF4. Entre os genes supra-regulados é JUND que se comporta de forma semelhante às proteínas JUN para transactivar um promotor AP-1-responsivo em conjunto (Figura 4H). JUND exibe um papel dependente de células na prevenção da morte celular em fibroblastos embrionários salientou-UV rato [35], enquanto que aumenta a actividade de caspase-3 induzida por UV na leucemia mieloblástica humana [36]. expressão SOCS1 é induzida pela estimulação TLR e inibe JAK STAT sinalização /[37], como modelo de feedback negativo [38]. SOCS1, que é regulada por JUND em células T [39], regula a duração da sinalização de NFkB através da diminuição da expressão de genes dependente de NFkB [40]. PLAUR é um gene do receptor do activador de plasminogénio do tipo uroquinase. PLAUR regula a sobrevivência de células endoteliais e é importante para o anti-apoptose induzida por VEGF [41]. A expressão ao longo de JUND leva ao sub-regulação de ARNm VEGFA [42].

A rede genética também confirma a regulação de vários genes pró-apoptóticos que vai em coordenação com o aumento observado na apoptose nas ausência de ADN-PK. EGR2 desempenha um papel chave na via apoptótica induzida por PTEN. ERG2 foi diferencialmente aumentou em Sidna-PK derrubar células (Figura 4a). A expressão ao longo de EGR2 induz a apoptose em diversas linhagens de células tumorais através BNIP3L BAK e [43]. Cycs (gene da citocromo c que induz a apoptose através de Bcl-2 via após a sua libertação a partir da mitocôndria para o citoplasma), factor de activação de transcrição 4 (ATF4) (SIDA na sobre-regulação da expressão de proteína pro-apoptótica da proteína C /EBP-homóloga [ ,,,0],44]), e o factor de transcrição dedo de zinco KLF4 (referida como estando envolvida na indução da apoptose em leucemia de células T [45]) foram todos identificados como genes sobre-reguladas. O aumento no nível de ARNm de KLF4 estava abaixo do nível de significância (p = 0,078), no entanto, a tendência pode ser observada em todos os replicados (Figura 4J). Estes genes pró-apoptóticos pode ser inibida pela a actividade de ADN-PK e portanto, na ausência de um funcional de ADN-PK, esses genes podem levar a um aumento da apoptose induzida pelo calor.

Materiais e Métodos

Chemicals

O NU7026 inibidor de ADN-PK selectiva (2- (morfolin-4-il) -benzo [h] chomen-4-ona) foi adquirido a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) e NU7441 (8- (4-dibenzotienilo) -2- (4-morf olinil) -4H-1-benzopiran-4-ona) foi adquirido a partir de Axon medchem (Groningen, Holanda). Eles foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO) a uma concentração final de 10 mM. As soluções-mãe foram armazenadas a -20 ° C até à sua utilização.

Linhas de Células e Tratamento

carcinoma cervical humano células HeLa S3 (Riken, Tsukuba, Japão), glioma maligno humano M059K e o seu ADN PKcs variante defeituosa M059J (fornecida por A. Takahashi, Universidade Gunma, Japão), foram crescidos em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina mistura antibiótica /estreptomicina. E de células de ovário de hamster chinês suas células DNA-PKcs defeituosos variante V3 [46] (Riken) CHO-K1 e todos foram cultivadas em MEMα suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina /estreptomicina mistura antibiótica. O aquecimento foi realizado por imersão de uma placa de cultura celular selado-parafilme num banho de água a 44 ° C durante 60 min. A temperatura foi monitorizada com um termómetro digital (# 7563, Yokogawa, Tóquio, Japão). Em experiências de inibição, as células foram pré-incubadas com 10 uM de NU7026 ou NU7441 durante 30-60 minutos, seguido por exposição ao calor. As células tratadas foram então incubadas a 37 ° C até à análise, sem troca de meio.

Cromatina Análise Condensação

de controle e as células tratadas foram recolhidas 24 horas após o tratamento e coradas utilizando um cromatina nuclear verde-ID ™ kit de detecção de condensação (Enzo Life Sciences, Farmingdale, Nova Iorque), de acordo com o protocolo do fabricante. A extensão da condensação da cromatina foi medido através do cálculo da intensidade de fluorescência do parente verde Nuclear-ID ™ de controlar com citometria de fluxo (Epics XL, Beckman Coulter, Miami, FL).

Western Blot Analysis

As células foram dissolvidas em tampão de lise (50 mM de NaCl, 1% de Nonidet P-40 e 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0) contendo ortovanadato de sódio e proteases cocktail inibidor (Nacalai Tesque, Quioto, Japão). electroforese de SDS-polyaclylamidegel e Western blot foram realizados tal como descrito noutro local [47]. Os anticorpos primários utilizados foram como se segue: um anti-HSP70 anticorpo monoclonal de ratinho (MBL, Nagoya, Japão); um anticorpo anti-Hsp40 monoclonal de ratinho (MBL); 3 um anticorpo anti-caspase policlonal de coelho que reconhece o comprimento completo de caspase-3 (35 kDa), bem como os fragmentos (19- e 17-kDa) da enzima activada (Cell Signaling Technology, Danvers, MA); um anticorpo policlonal de coelho anti-fosfo DNA-PKcs no anticorpo Ser2056 (Abcam, Cambridge, Reino Unido); Um anticorpo monoclonal de coelho anti-DNA-PKcs (Epitomics, Burlingame, CA); um anticorpo anti-HSF1 policlonal de coelho (Stressgen Bioagentes, Victoria, Canadá); e um monoclonal de ratinho anti-gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) anticorpo (Organon Teknika, Durham, NC). proteínas imunorreactivas foram visualizadas usando quimioluminescência aumentada sistema de detecção (ECL) em um analisador de imagem luminescente (LAS-4000, Fujifilm, Tóquio, Japão).

densidades da banda foram quantificados através do programa Image J (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2012.) e as quantidades relativas de proteínas associadas com cada anticorpo específico foram normalizadas para bandas de GADPH.

a transfecção com pequeno RNA de interferência (siRNA)

O controlo negativo siRNA luciferase e de ADN-PKcs-alvo siRNA foram obtidos a partir Nippon Gene materiais (Toyama, Japão), e Thermo Fisher Scientific, Dharmacon produtos (Lafayette, CO), respectivamente. Os siRNAs segmentação NR1D1 (Rev-erbα) e BIRC3 (C-IAP2) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnolgy, Santa Cruz, CA. A transfecção foi levada a cabo em células HeLa usando RNAi Max (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, as células HeLa foram colhidas, lavadas e suspensas em meio de crescimento completo sem antibióticos. As células foram semeadas a uma densidade de 2,5 x 10 placas

4 células /cavidade em 12 cavidades e deixados a aderir durante 24 h. Para a transfecção, 800 uL de Opti-MEM (Invitrogen) foram adicionados às células, seguido por 200 uL de Opti-MEM contendo o ARNi Max complexos de siRNA /preparada 20 minutos antes da adição (reverso protocolo de transfecção). Seis horas mais tarde, o meio de transfecção foi substituído por meio completo fresco sem antibióticos. Em seguida, as células foram incubadas mais 42 h. Trinta minutos antes do tratamento térmico, o meio foi trocado por meio completo com antibióticos.

Isolamento de ARN

O ARN total foi extraído a partir de células utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) e tratada com ADNase I (kit de DNase isenta de RNase; Qiagen) durante 15 min à temperatura ambiente para remover o ADN genómico residual. a qualidade do RNA foi analisado usando um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). As amostras de RNA que tinham número de integridade do RNA (RIN) valores acima de 9,5 foram considerados aceitáveis.

Microarray e Gene Computacional As análises de expressão

A expressão gênica foi analisada utilizando um conjunto de genes de GeneChip® Human 1.0 ST manchado com cerca de 28.869 conjuntos de sondas (Affymetrix, Santa Clara, CA). As amostras para hibridação matriz foram preparadas como descrito no Manual Técnico Expressão GeneChip® Affymetrix. As matrizes digitalizados foram analisados ​​utilizando o GeneChip® Analysis Software Suite (Affymetrix). Os dados de intensidade de hibridação obtidos foram analisados ​​usando o software de análise de GeneSpring® ver 11.5 (Silicon Genetics, Redwood City, CA) para extrair genes significativos. Para examinar ontologia gênica, incluindo os processos biológicos, componentes celulares, funções moleculares e redes genéticas, os dados obtidos foram analisados ​​usando as ferramentas de análise Ingenuity Pathways (Ingenuity® Sistemas, Mountain View, CA, EUA), uma aplicação web-entregue que permite a identificação, visualização e exploração de redes de interacção molecular em dados de expressão de genes [48]. listas completas de conjuntos de sondas de todas as amostras estão disponíveis no Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE39063).

real -tempo de Reacção em Cadeia de polimerase quantitativa (qPCR)

-qPCR em tempo real de ensaio foi realizada com o sistema em tempo real, PCR Mx3000P® (Stratagene Japão, Tokyo, Japão) usando SYBR® Premix Ex Taq (Takara Bio, Shiga , Japão) de acordo com o protocolo do fabricante. Reacção de transcriptase inversa (kit de reagente PrimeScript®, Takara Bio) foi realizada com ARN total tratado com ADNase. Os iniciadores foram desenhados com base nos seguintes sequências de base de dados: NM 006145, DnaJ (Hsp40) homólogo, subfamília B, membro 1 (DNAJB1); NM 002155, proteína de choque térmico de 70 kDa 6 (HSP70B ‘) (HSPA6); NM 018602, DnaJ (Hsp40) homólogo, subfamília A, membro 4 (DNAJA4); NM 002228, jun proto-oncogene (junho); NM 021724, subfamília receptor nuclear 1, grupo D, membro 1 (NR1D1); NM 001621, receptor de hidrocarboneto aromático (AHR); NM 001165, baculovírus repetição IAP contendo 3 (BIRC3); NM 005354, jun D proto-oncogene (JUND); NM 000399, a resposta inicial de crescimento 2 (EGR2); NM 004235, Kruppel-like factor 4 (KLF4); NM 002046, desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH). GAPDH foi utilizado como controle para a normalização [49].

Análise Estatística

Os dados são apresentados como médias ± SD. A significância estatística entre dois conjuntos de dados foi determinada utilizando o teste t de Welch usando software R (A Fundação R para Statistical Computing, versão 2.15.1, software livre disponível em https://www.R-project.org), com valores de p 0,05 considerado significativo

Informações de Apoio

Figura S1..

análise Western blot de expressão HSP70 em células de hamster chinês do ovário (CHO-K1). O inibidor de ADN-PK, 10 uM de NU7441 diminuiu a expressão de HSP70 em células CHO-K1 6 h após a exposição a stress térmico a 44 ° C durante 60 min

doi:. 10.1371 /journal.pone.0058325.s001

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Figura S2.

análise Western blot de expressão HSP70 em células de roedores. Duas variantes de células de ovário de hamster chinês, células CHO-K1 com células funcionais de ADN-PK e V3 com DNA-PKcs defeituosos foram expostas a stress térmico a 44 ° C durante 60 min e, em seguida, a extensão da expressão de HSP70 foi ensaiada 6 h mais tarde. HSP70 foi regulada para baixo na ausência de funcional DNA-PK em células V3

doi:. 10.1371 /journal.pone.0058325.s002

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Figura S3.

análise Western blot de expressão HSP70 e Hsp40 em linhas celulares de glioma maligno humano. Em duas variantes de células de glioma maligno, células M059K com o funcionamento de ADN-PK e a DNA-PKcs variante M059J defeituoso, a expressão de HSP70 e Hsp40 foi semelhante em ambas as células, independentemente do estado de ADN-PK

doi:. 10.1371 /Journal .pone.0058325.s003

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Figura S4.

Verificação da eficácia knockdown de NR1D1 e BIRC3 em tempo real por qPCR. As células HeLa foram transfectadas por 50 nM de qualquer siNR1D1 ou siBIRC3. As células transfectadas foram incubadas a 37 ° C durante 24 h. Os níveis de expressão de ARNm de (a) NR1D1 e (b) BIRC3 normalizados para o nível de expressão de GAPDH. Os dados são expressos como a média ± DP (**, P 0,01; N. S., não significativa)

doi: 10.1371 /journal.pone.0058325.s004

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figura S5..

análise Western blot de caspase-3 em células siNR1D1 e siBIRC3 transfectadas seguintes estresse por calor. A análise Western blot mostrou que a caspase-3 clivada bandas de 24 h após tratamento aumentou em siNR1D1- e células siBIRC3-transf

doi:. 10.1371 /journal.pone.0058325.s005

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Figura S6 .

cromatina análise de condensação na siNR1D1 e siBIRC3 células transfectadas após estresse de calor. Após a exposição a stress térmico, as células com NR1D1 revogada exibida aumento significativo na condensação da cromatina em comparação com células transfectadas com siLuc, enquanto que ab-rogação da BIRC3 tendeu a aumentar o grau de condensação da cromatina sem exibir significância estatística. Os dados são expressos como a média ± SD (*, P 0,05; NS, não significativo)

doi: 10.1371 /journal.pone.0058325.s006

(EPS)

Agradecimentos

os autores agradecem Prof. Akihisa Takahashi, da Universidade Gunma pelo dom da maligna linha de células de glioma M059K e M059J.