Abstract

proliferação descontrolada, uma das principais características das células cancerosas, muitas vezes é desencadeada pelo mau funcionamento dos reguladores do ciclo celular tais como proteínas quinases. Recentemente, proteínas quinases relacionadas com o ciclo celular tornaram-se alvos atraentes para a terapia anti-câncer, porque eles desempenham papéis fundamentais na proliferação celular. No entanto, os fármacos alvo-cinase de proteínas que têm sido desenvolvidos até ao momento não mostram resultados clínicos impressionantes e também exibir efeitos secundários graves; Portanto, não é sem dúvida, uma necessidade de investigar novas drogas dirigidas a outras proteínas quinases que são críticos na progressão do ciclo celular. quinase relacionadas com vaccinia 1 (VRK1) é uma cinase mitótico que funciona na regulação do ciclo celular por fosforilar substratos relacionados com o ciclo celular, tais como o factor de barreira-a-autointegration (BAF), histona H3, e o elemento de resposta a cAMP (CRE) liga�o ao proteína (CREB). No nosso estudo, foram identificados como o inibidor de luteolina de VRK1 por rastreio de uma biblioteca de molécula pequena composto natural. Aqui, foi avaliada a eficácia de luteolina como um inibidor segmentadas VRK1 para o desenvolvimento de uma estratégia eficaz anti-cancro. Confirmou-se que a luteolina reduz significativamente a fosforilação mediada VRK1 dos substratos relacionados com o ciclo de células BAF e histona H3, e directamente interage com o domínio catalítico de VRK1. Além disso, a luteolina regula a progressão do ciclo celular pela modulação da actividade VRK1, que conduz à supressão da proliferação de células cancerosas e a indução de apoptose. Portanto, nosso estudo sugere que a inibição VRK1 induzida por luteolina pode contribuir para estabelecer uma estratégia orientada do ciclo celular novo para a terapia anti-cancro

Citation:. Kim YS, Kim SH, Shin J, Harikishore A, Lim JK , Jung Y, et al. (2014) Luteolin Cancer suprime a proliferação celular por Segmentação Vaccinia-Related Kinase 1. PLoS ONE 9 (10): e109655. doi: 10.1371 /journal.pone.0109655

editor: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute, da Universidade de Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Abril de 2014; Aceito: 02 de setembro de 2014; Publicação: 13 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevent estão dentro do papel e seus arquivos de informação Suppoting

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) (2013-056085), o Programa de Next-Generation BioGreen 21 (No. PJ009503), Administração de Desenvolvimento Rural, República da Coreia. Este trabalho também foi apoiado pelo programa Coreia do Cérebro 21 do Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia da Coreia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Tumorigênese está associada com uma desregulação de divisão celular, o que é muitas vezes desencadeadas por defeitos na regulação de moduladores de proteínas que desempenham papéis críticos em pontos de verificação do ciclo celular e progressão [1]. Entre as proteínas que formam a maquinaria do ciclo celular, as estratégias terapêuticas recentes tentaram tirar proveito da segmentação várias proteína-quinases do ciclo celular para aumentar a selectividade de drogas e a eficácia terapêutica [2], [3]. Por conseguinte, tais cinases de proteína relacionadas com o ciclo das células tornaram-se alvos atractivos para terapia anti-cancro, devido às suas funções fundamentais no controlo do crescimento celular. Por exemplo, os inibidores de moléculas pequenas de proteínas do checkpoint de dano do DNA de Chk 1 e 2 foram usados ​​com a intenção de causar a paragem do ciclo celular e apoptose durante a interfase [4] – [6]. Além disso, alguns inibidores de mitose alvo a família de quinases dependentes da ciclina (CDK), Aurora cinases, e quinases Polo-like foram desenvolvidos para provocar a entrada impedida mitótico, paragem da mitose e catástrofes mitóticas, causando deficiências na condensação cromossomo, o alinhamento cromossomo, formação do fuso, e o ponto de verificação montagem do fuso [1] – [3]. Durante vários inibidores promissores, os ensaios clínicos já foram realizados para desenvolver uma nova classe de fármacos anti-cancro. Nas fases de ensaios clínicos, infelizmente, sua eficácia clínica não mostrou resultados impressionantes, mas induziu respostas limitadas ou efeitos colaterais graves, mesmo inesperados [3]. No entanto, a inibição efectiva de certas fases do ciclo celular é ainda considerado como uma estratégia terapêutica valiosa para o tratamento do cancro, assim a identificação de novos, ciclo-específica de células, proteínas alvo druggable e o desenvolvimento dos seus inibidores selectivos que possam ter potencial para se tornar agentes quimioterapêuticos são sem dúvida, necessário.

neste sentido, investigamos se Vaccinia relacionadas com quinase 1 (VRK1) pode ser um alvo molecular adequado, de acordo com a estratégia do ciclo celular alvo. VRK1, que fosforila especificamente resíduos de serina e treonina, é uma cinase mitótico que desempenha um papel importante na progressão do ciclo celular por participar em grande variedade de processos de divisão celular [7], [8]. VRK1 expressão é especificamente abundante em células altamente proliferativas, tais como tecidos fetais e de tumor, e principalmente exibe uma tendência para regular positivamente durante a fase mitótica do ciclo celular [9], [10]. No G1 /fase S, VRK1 promove ciclina D1 (CCND1) para induzir a expressão do G1 /S de transição por fosforilação elemento de resposta a cAMP (CRE) liga�o ao proteína (CREB) e, assim, aumentar a afinidade de ligação de CREB com o promotor CCND1 [11 ]. Além disso, VRK1 participa no envelope nuclear dinâmica (NE) como a montagem NE /desmontagem via fosforilação do fator de barreira-to-autointegration (BAF) durante a interfase e mitose de entrada /saída [12]. BAF é uma função da proteína associada a cromatina, como uma ligação entre o ADN e o NE [13]. O estado dinâmico do BAF durante a progressão do ciclo celular é estreitamente regulada pela atividade VRK1; BAF fosforilação por VRK1 estimula a liberação de cromatina de NE, e recruta proteínas associadas à NE em região central durante telophase [12], [14]. Na fase mitótica, VRK1 afecta modificação da histona por fosforilação de histona H3 [10]. A fosforilação da histona H3 Ser10 por VRK1 e outras várias cinases mitóticas é um código de histona bem conhecido indutor de condensação de cromatina na entrada mitótico ou a transição de fase G2 /M. No ciclo celular, VRK1 mediada por fosforilação de histona H3 é influenciada por outros reguladores. activada por mitogénio proteína cinase da fosfatase 2 (MKP2), uma fosfatase de especificidade dual que inactiva MAP quinases (MAPK), desempenha um papel como regulador negativo da fosforilação da histona H3 VRK1 mediada na fase mitótica [15]. Durante a interfase, macro H2A1.2 histona (MacroH2A1), uma variante do grupo de histonas, suprime a abordagem de VRK1 a histona H3 por sequestro de [16].

Para além disso, estudos recentes também mostraram a importância da na VRK1 processo de proliferação de células. VRK1 tem um papel crítico, não só na proliferação de células somáticas, mas também no desenvolvimento de células germinativas [17], [18]. Além disso, VRK1 também desempenha um papel na manutenção da telomere por fosforilação hnRNP A1, que estimula a telomerase e liga-se a sequência de DNA do telómero [19]. VRK1 é necessária para a saída G0, fragmentação de Golgi, ADN apoptose induzida por danos, e respostas a stress, que são necessários para manter a progressão do ciclo celular [20] – [24]. Assim, considerando as características relacionadas com o ciclo celular das VRK1, a identificação do inibidor VRK1 é necessário para terapias anti-cancerosas. Embora seja relatado que alguns medicamentos para inibir outras proteínas quinases possam inibir a atividade de cinase de VRK1 [25], o mecanismo inibitório e anti-câncer efeitos através da inibição VRK1 ainda estavam indescritível.

Em nosso estudo, nós analisamos uma pequena molécula biblioteca de compostos naturais e luteolina identificado (3 ‘, 4’, 5,7-tetrahydroxyflavone) como a pequena molécula para inibir a actividade de quinase VRK1. Luteolina é um flavonóide que ocorre naturalmente que é normalmente distribuído em plantas e é bem conhecido por actuar como um antioxidante potente [26]. Em remédios tradicionais asiáticos, ervas luteolina-abundante têm sido utilizados como remédios tradicionais para o tratamento de muitas doenças, tais como condições dolorosas, doenças inflamatórias, hipertensão, cancro e [27]. Hoje em dia, muitas linhas de evidência demonstraram numerosos efeitos farmacológicos de luteolina incluindo anti-cancro, anti-inflamatório, e actividades anti-alérgicos [27], [28]. Embora tenha sido verificado que as propriedades anti-cancro de luteolina estão associados com efeitos pró-apoptóticos, efeitos anti-proliferativos, e a inibição da angiogénese e metástases, os mecanismos moleculares subjacentes às suas actividades anti-cancerígenas não foram totalmente determinada [29] , [30].

Aqui, confirmou-se que exibe luteolina reduziu significativamente a fosforilação da histona H3 substratos relacionados com o ciclo celular e BAF, e interage directamente com VRK1, especificamente encaixe no seu domínio catalítico. Além disso, demonstrou-se que a luteolina poderia induzir a paragem do ciclo celular por inibição da actividade de quinase VRK1, que conduz à supressão do crescimento de células cancerosas e a apoptose. Portanto, sugerimos que a luteolina é um inibidor da VRK1, que é um dos bons candidatos para o tratamento de câncer.

Materiais e Métodos

produtos químicos e reagentes

Luteolin foi de analítica grau e adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Eupatilin e Wogonin foram fornecidos a partir do laboratório do Dr. Baek na Universidade Kyung-Hee. Estes compostos foram preparados em DMSO (Sigma-Aldrich). [

32P-γ] ATP foi comprado de Perkin Elmer /NEN (Waltham, MA, EUA) e histona H3 recombinante foi adquirida a partir de Roche Applied Science (Indianapolis, IN, EUA). Outras proteínas recombinantes tais como glutationa sulfotransferase (GST), GST-VRK1, GST-quinase Aurora B (AURKB) e His-BAF foram expressos em

E. coli (BL21) e foram purificados por cromatografia de afinidade. Lamina B, anticorpo desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (GAPDH) e GST foi adquirido a partir da tecnologia de Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EUA) e anticorpo fosfo-Ser10 histona H3 foi comprado de Abcam (Cambridge, Reino Unido) e os contra a histona H3, fosfo-CREB e CREB foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). VRK1 e fosfo-BAF (presente de Robert Craigie, NIH, EUA) anticorpo foram gerados em coelhos utilizando proteínas purificadas VRK1. Hoechst 33342 foi adquirida a Sigma-Aldrich. CNBr-Sepharose 4B foi adquirido de Sigma-Aldrich.

Cultura de células e transfecção

células BEAS-2B foram obtidos a partir de ATCC (Manassas, VA). Anteriormente descrito HeLa [31], HEK293A [16], SH-SY5Y [32], U2OS [32], e A549 [31] as células foram usadas neste estudo. A linha celular de adenocarcinoma cervical humano HeLa, a linha celular de rim embrionário humano HEK293A, o brônquica linha celular epitelial humana BEAS-2B e a linha celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de fetal de bovino soro e 1% de penicilina-estreptomicina. A linha de células de osteossarcoma humano e U2OS de adenocarcinoma do pulmão humano A549 linha de células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% e 1% de penicilina-estreptomicina. Estas linhas de células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2. transfecção transiente de células HeLa e U2OS foi levada a cabo usando uma MP-100 de microporos (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.

Proteína quinase ensaio

Uma cinase in vitro ensaio foi realizado de acordo com os métodos anteriormente descritos [31]. Em resumo, um ensaio de cinase in vitro foi levada a cabo no tampão de quinase contendo GST-VRK1, GST-AURKB, His-BAF, histona H3, e [32P-γ] ATP. As misturas de ensaio de cinase foram incubadas a 30 ° C durante 30 min e a incorporação radioactiva foi detectada por autoradiografia. As quantidades de proteínas utilizadas em ensaios de quinase foram medidos por utilização de nitrato de prata (Sigma-Aldrich) ou com azul de Coomassie (Sigma-Aldrich).

A viabilidade celular ensaio

As células foram tratadas durante 24 h ou 48 h com flavonóides (luteolina, eupatilin, e wogonin) ou com sulfóxido de dimetilo (DMSO) como um controlo. A viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenyltetarazolium (MTT) de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração inibitória de metade do máximo (CI50) foi determinada usando Graphpad Prism (GraphPad, San Diego, CA, EUA).

preparação luteolina-Sepharose 4B e in vitro suspenso ensaio

Sepharose 4B pó grânulo foi suspenso em solução de activação para a reacção de acoplamento. Activado esferas de Sepharose 4B foram incubadas em solução de acoplamento com luteolina num agitador rotativo a 4 ° C durante a noite. Para a puxar para baixo in vitro de ensaio, GST e GST-VRK1 foram incubados com esferas de Sepharose 4B-luteolina na solução de reacção durante 12 h. As proteínas ligadas às esferas foram analisados ​​por imunotransf erência. Foram realizados os procedimentos detalhados que foram descritos anteriormente [33].

Superfície Plasmon Resonance (SPR) ensaio

Os parâmetros cinéticos da interação entre VRK1 e luteolina foram avaliados por um ensaio SPR utilizando o sistema SR7500DC automático (Reichert Technologies, Depew, NY, EUA). Para a preparação do chip de ouro VRK1-conjugado, VRK1 foi imobilizado num chip CMDH (# 13206066) e, em seguida, a luteolina, eupatilin e wogonin foram injectadas sobre a superfície do chip de, nas concentrações indicadas, diluído em 10 soro fisiológico tamponado com fosfato mM (PBS ) contendo 1% de DMSO como um tampão de corrida. A análise dos dados coletados foi realizada por software scrubber2 (BioNavis, Tampere, Pirkanmaa, Finlândia).

Ligand encaixe ensaio

Um modelo de homologia desenvolvido a partir da estrutura de raios-X de VRK1 foi empregado para avaliar a interacção molecular e do modo de ligação das ligações VRK1 recentemente identificados. No presente estudo, a estrutura do modelo foi de 5.000 passos por o método do gradiente CHARM força-campo e um conjugado no 3.0 Suíte Discovery Estúdio [34] minimizado energia. As coordenadas 3-D de luteolina foram preparadas utilizando o módulo Ligand e por 2.000 etapas usando o algoritmo inteligente Minimizer na suíte Descoberta Studio 3.0 minimizado energia Prepare. O programa de encaixe molecular OURO 5.0 foi utilizado para avaliar o modo de ligação dos cabos VRK1. Nossos estudos de ligação de RMN anteriores identificaram os resíduos chave que são perturbados sobre a ligação do ligando; estes foram utilizados para definir o local activo [34]. configurações padrão e funções de pontuação, a função PLP OURO e pontuação OURO, foram empregadas para marcar interações de encaixe e sua provável modo de acoplamento da ligação.

citometria de fluxo de ensaio

Para análise do ciclo celular, células HeLa foram transfectadas com GFP, GFP-VRK1, GFP-BAF e, em seguida, tratada com DMSO (veículo) e 10 uM de luteolina. Depois, as células foram fixadas com etanol a 70% contendo 0,4% de Tween-20 e coradas com iodeto de propidio em PBS. O conteúdo do ciclo celular e de ADN celulares foram analisadas por citometria de fluxo num citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA). A aquisição de dados foi realizada com o programa celular Quest (BD Biosciences). Para a análise da apoptose, as células HeLa foram tratados com luteolina de um modo dependente da concentração e duplamente coradas com iodeto de propodium e anexina-V aloficocianina. As células foram analisadas por citometria de fluxo.

Imunofluorescência coloração

As células HeLa foram transfectadas com a proteína fluorescente vermelha (RFP), RFP-VRK1, GFP e GFP-BAF utilizando formação de microporos, e, em seguida, tratada com 10 uM de luteolina durante 24 h. Subsequentemente, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 20 min e bloqueadas com 10% de FBS em PBS durante 1 h à temperatura ambiente. As células foram coradas com Hoechst 33342 em PBS durante 20 min à temperatura ambiente e visualizado usando um microscópio confocal de varrimento laser-(FluoView FV1000; Olympus, Tóquio, Japão). As células HeLa foram tratadas com ou sem luteolina (10 uM) durante 24 h. Posteriormente, realizou-se procedimentos detalhados que foram descritos, e, em seguida, as células foram coradas com anticorpo lamin B e visto usando Zeiss microscópio de fluorescência (Carl Zeiss Ltd., Jena, Alemanha) ou microscopia de varredura a laser confocal.

quantitativa de transcrição reversa (RT) -PCR

o ARN total a partir de células HeLa foi preparado utilizando o agente de TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, EUA) de acordo com as instruções do fabricante e, em seguida, a transcrição reversa para gerar ADN complementar. Quantitativa de RT-PCR foi realizada utilizando a mistura SYBR Green PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japão) e um sistema de tempo real do detector (Applied Biosystems, Foster City, CA EUA). nível GAPDH foi utilizada para normalizar os níveis de transcrição.

Resultados

Luteolin é um potente inibidor da atividade VRK1 quinase

Para examinar se a luteolina pode efetivamente suprimir a atividade enzimática da VRK1, foi realizada uma

in vitro de ensaio de cinase

e comparou os efeitos inibitórios de luteolina com os de outros compostos flavonóides como. Luteolina inibiu significativamente a fosforilação mediada VRK1 de BAF e histona H3 de uma forma dependente da dose. Além disso, a actividade de auto-fosforilação de VRK1 foi atenuada por tratamento com luteolina de um modo dependente da dose (Fig. 1A e B). Embora eupatilin e wogonin, compostos químicos flavonóides como que exibem semelhança estrutural com luteolina (Fig. 1C), fracamente inibir a actividade VRK1 quinase (Fig. 1D, E), a luteolina mostrou os efeitos inibitórios mais proeminentes na fosforilação BAF e VRK1 auto-fosforilação , sugerindo que a especificidade de luteolina. A especificidade de luteolina para VRK1 foi ainda confirmado pelos seus efeitos inibitórios sobre a fosforilação BAF normalizados e VRK1 auto-fosforilação (Fig. 1F e G). Estes resultados indicam que a luteolina é um potente inibidor da actividade de quinase VRK1, que é necessária para a modulação da progressão do ciclo celular.

(A) e (B),

In vitro

medições da actividade cinase para VRK1 com BAF (a) ou VRK1 com histona H3 (B) foram realizadas por concentrações crescentes de luteolina (0.0, 1.0, 10, 50, 100, e 250 ^ M), e, em seguida, VRK1 e proteínas de substrato foram corados com nitrato de prata. (C), estruturas químicas e pesos moleculares de luteolina, eupatilin, e wogonin. (D) e (E),

In vitro

ensaio de quinase para VRK1 com FAB foram realizados por concentrações crescentes (0,0, 1,0, 10, 50, 100 e 250 uM) de eupatilin (D) ou (wogonin proteínas e), e, em seguida, VRK1 e BAF foram corados com nitrato de prata. (F) e (G), Quantificação de VRK1 auto-fosforilação (F) ou BAF fosforilação (g), descrita em (B), (D) e (E). Dados em (F) e (G) representam meio de três experimentos independentes ± SEMs.

Luteolin interage diretamente com VRK1

Porque luteolina suprimida a ação de VRK1 para com os seus substratos, nós a hipótese de que a luteolina pode inibir a atividade da quinase por meio de ligação directa ao VRK1. Para investigar a interação entre luteolina e VRK1, foi realizado um ensaio de pull-down usando esferas de sepharose luteolina conjugado. GST não pode ligar-se a pérolas de Sepharose quer luteolina-conjugado ou de pérolas de controlo. No entanto, GST-VRK1 ligado com êxito a pérolas de Sepharose conjugadas com luteolina, mas não se ligou para controlar os grânulos que não foram conjugados com luteolina (Fig. 2a). A seguir realizado um ensaio suspenso com lisados ​​de células SH-SY5Y para inspeccionar se liga a luteolina VRK1 endógeno para além VRK1 recombinante (Fig. 2B). Endógena VRK1 também podia ligar-se a pérolas de Sepharose conjugadas com luteolina. Estes resultados sugerem que a luteolina interage diretamente com VRK1

in vitro

.

(A), ensaio de pull-down usando sepharose luteolina conjugado 4B grânulos ou controlo sepharose 4B contas com proteína recombinante VRK1. proteínas GST purificada e GST-VRK1 são incubadas com contas indicadas e, em seguida puxar para baixo ensaio foi realizado. Cada proteínas foram detectados por imunotransf erência com o anticorpo GST. (B), Pull-down ensaio utilizando luteolina conjugado sepharose 4B grânulos com ligado de células SH-SY5Y. ligado de células são incubadas com contas indicadas e, em seguida suspenso foi realizada. As proteínas foram detectadas por imunotransf erência com anticorpo VRK1. (C), de deteco RPS para a interacção de luteolina com VRK1. Os dados foram obtidos pelo método de titulação com cinética de injecção sequencial de analitos, sem passos de regeneração. Os dados para eupatilin e wogonin foram obtidos por métodos clássicos.

A interação direta entre a luteolina e VRK1 foi ainda analisada por ressonância de plasma de superfície (SPR) para monitorar a cinética de ligação. As proteínas recombinantes foram VRK1 covalentemente imobilizado num chip sensor como um ligando; subsequentemente, luteolina, eupatilin wogonin e foram adicionados de uma forma dependente da concentração, tal como um objecto de análise (Fig. 2C). Parâmetros cinéticos da interacção entre o chip sensor revestido VRK1 e estes analitos foram avaliadas pelo software e estão representados na Tabela 1. Constantes calculados destes analitos no sentido de que exibem VRK1 luteolina tem mais forte afinidade de ligação entre eles. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a luteolina se liga directamente a VRK1 com elevada afinidade de ligação.

O efeito inibitório de luteolina é mediada pela sua ligação directa ao domínio catalítico de VRK1

Para determinar a região de ligação de VRK1 para a luteolina, a interacção entre a luteolina e VRK1 foi avaliada por experiências de titulação de RMN e

in silico

modelagem. Os resíduos de aminoácidos afectadas pela interacção com luteolina mostrou dramaticamente aumentada perturbações dos desvios químicos (Fig. 3A). Estes resíduos são representados no espectro de perturbações do deslocamento químico e também atribuído no mapa molecular de VRK1 (Fig 3B), sugerindo que estes resíduos estão localizados essencialmente na vizinhança do domínio catalítico, que está envolvida na ligação de ATP [34].

(A), foram realizadas experiências de titulação de RMN. Espectro de perturbações dos desvios químicos em comparação com os resíduos de aminoácidos da proteína VRK1 após a ligação de luteolina. (B), Mapeamento de perturbações dos desvios químicos na proteína VRK1. A maior parte dos resíduos perturbados (mostrados em vermelho) estão localizados próximo do domínio catalítico de VRK1. (C),

in silico

modelagem do modo de ligao de luteolina à proteína VRK1. Luteolina está previsto para caber nas imediações do G-loop, local catalítico, e α-C lóbulo.

in silico

modelagem do modo de ligação de luteolina em direção VRK1 , luteolina está previsto para se encaixar na vizinhança do G-loop, o sítio catalítico, e α-C lóbulo (Fig. 3C). As fracções 2, 3-di-hidroxilo do grupo 2-fenil sobre o andaime cromeno interagir com o resíduo de E83 α-C lóbulo. Além disso, o grupo 2-hidroxilo também interage com o resíduo D197 da ansa catalítica. Do mesmo modo, o grupo 4-ceto no andaime cromeno interage com S181 por meio de uma interacção de ligação de hidrogénio-. A porção 7-hidroxil no cadafalso cromeno também faz interações de ligação de hidrogênio com os resíduos I43 e Q45 do G-loop. Além destas interacções de ligação de hidrogênio, o andaime cromeno também tem fortes interacções hidrófobas empilhamento com o resíduo F48 do G-loop e os resíduos hidrófobos que rodeiam o local activo (não mostrado). Luteolina tem a maioria de suas interações importantes com o G-loop e resíduos no local catalíticos, que estabilizam firmemente a molécula luteolina no sítio activo e inibem a sua actividade quinase.

luteolina induz a paragem do ciclo celular através da inibição da fosforilação BAF por VRK1

Luteolin foi demonstrado anteriormente para induzir a paragem do ciclo celular no G1 /S e G2 /transições de fase M [35] – [39]. No entanto, o mecanismo molecular de paragem do ciclo celular por luteolina é desconhecida, com excepção para a possibilidade de que a Aurora B cinase pode ser um alvo molecular de luteolina para regular a progressão do ciclo da célula, com base na evidência de que a Aurora B é inibida por luteolina e desempenha um papel como um mediador chave da progressão mitótica [40]. VRK1 é outra cinase mitótico que tem sido conhecida para levar a cabo funções de coordenação na progressão do ciclo celular pela fosforilação de várias substratos relacionados com o ciclo celular, tais como BAF, histona H3, e CREB [10] – [12]. Assim, avaliamos se luteolina induz a paragem do ciclo celular através da inibição VRK1. as células marcadas com PI tratadas com DMSO ou luteolina foram analisadas por citometria de fluxo para avaliar o ciclo celular. Após o tratamento com a luteolina, a população em fase G1 foi significativamente aumentada comparada com a de células tratadas com DMSO (Fig. 4A, painel da esquerda). Em contraste, o aumento da população de fase G1 desaparecido após a sobre-expressão de VRK1 GFP (figura 4A, painel da direita), indicando que a luteolina provoca a paragem nas fases iniciais do ciclo celular por inibição de VRK1.

( A), a análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo. As células HeLa transfectadas com GFP ou GFP-VRK1 foram tratados com luteolina durante 24 horas, e 10.000 células foram fechado para a análise. Os dados quantitativos estão abaixo dos histograma. (B) e (C), células HeLa tratadas com o veículo ou luteolina foram coradas com anticorpo lamina B para visualizar envelope nuclear com Hoechst 33342 e de ADN visualizados. Alexa 488 anticorpo conjugado com corante foi usado como anticorpo secundário. As lâminas foram visualizadas por microscopia de fluorescência (B), ou por microscopia confocal de varrimento laser (C). (D), a coloração fluorescente de VRK1, BAF, e ADN para análise da re-localização mediada por fosforilação de BAF. As células co-transfectadas com GFP ou GFP-BAF com RFP ou RFP-VRK1 foram tratadas com DMSO ou 10 | iM durante 24 horas a luteolina.

Como acima mencionado, VRK1 participa na re- mediada por fosforilação localização de BAF para o citoplasma, condensação da cromatina através da fosforilação da histona H3 e expressão CCND1 por fosforilação de CREB para facilitar a progressão do ciclo celular [10] – [12]. Para explicar melhor o mecanismo de parada do ciclo celular por interferência induzida por luteolina com a atividade VRK1, avaliamos se luteolina perturba estes processos. Uma vez que foi demonstrado que VRK1 aumenta a expressão de CCND1, que está correlacionada com G1 progressão /S, através de um aumento da actividade do elemento CRE no promotor CCND1 por fosforilada de ligação a CREB, especulamos que a fosforilação de CREB e o nível de ARNm de CCND1 pode ser afectada pelo tratamento com luteolina. No entanto, não houve diferenças significativas na fosforilação de CREB e o nível de ARNm de CCND1 entre DMSO e tratamento luteolina (Fig. S1), o que implica que G1 induzida por luteolina /S de captura pode ter sido uma consequência de defeitos de outros processos, em vez de supressão de CREB fosforilação.

a seguir, testou o possível envolvimento de BAF no G1 S prisão /causada por luteolina. Em

Drosophila

e

C. elegans

, está bem estabelecido que BAF tem papéis fundamentais na organização da estrutura nuclear e a progressão do ciclo celular [13], [41]. Além disso, a localização nuclear de BAF influencia a progressão do ciclo celular em células humanas; VRK1, a única quinase a montante identificado de BAF, pode alterar BAF localização por fosforilação para induzir a liberação de BAF a partir de proteínas, tanto DNA e LEM-domínio, como LAP2, emerin e MAN1 [12], [14], [31], [42]. VRK1 mediada BAF re-localização é um processo essencial para a liberação do DNA durante a transição G1 /S. Para detectar eventuais perturbações causadas por luteolina na dinâmica envelope nuclear na progressão do ciclo celular, que manchou o envelope nuclear com o anticorpo lâmina nuclear B. Lamina B é separado da cromatina na mitose, no entanto, a perda de expressão de VRK1 ou BAF mutante perturba separação da cromatina de NE [12], [42], [43]. Observou-se a lâmina nuclear B não foi dispersa por tratamento com luteolina. Nuclear lamina B foi libertada para o citoplasma na tarde anafase como mostrado nas células tratadas com o veículo, enquanto lamina B é preso em cromossomas na mesma fase, como mostrado nas células tratadas com luteolina (Fig. 4b), o que sugere que induziu-luteolina VRK1 distúrbios de inibição VRK1 mediada BAF fosforilação.

Além disso, verificou-se ainda que a luteolina causou alterações morfológicas envelope nuclear, como invaginação e bolha (Fig. 4C), que é um fenômeno a ser induzida por esgotamento de VRK1 [44] . Assim, sugerimos que a atenuação mediada por luteolina de BAF fosforilação pode dar origem a morfologias nucleares anormais induzida por depleção VRK1. Para confirmar que a luteolina perturba fosforilação BAF VRK1 mediada, observou-se nível de fosfo-BAF usando immunoblotting. nível Phospho-BAF foi diminuída em 10 � ligado de células tratadas com luteolina (Fig. S2), indicando que a atividade catalítica VRK1 é reduzido em luteolina

in vivo

.

Um estudo anterior mostrou que ectópica expressão dos resultados VRK1 em BAF re-localização para o citoplasma [12], [31]. Assim, investigou também se o fenômeno da BAF re-localização foi afetada pela inibição mediada pelo luteolina de VRK1. Quando ambos RFP e GFP-VRK1-BAF foram introduzidos em conjunto, BAF apareceu a ser disperso ao longo da célula, como foi reportado anteriormente [31]. No entanto, constatou-se que este fenómeno foi interrompido por tratamento com luteolina (Fig. 4D). A localização de GFP-BAF foi restrito ao nucleoplasma apesar de VRK1 sobre-expressão, o que sugere que o tratamento luteolina eficazmente reduzida pela inibição da fosforilação BAF VRK1, seguido de paragem do ciclo celular. Para examinar o papel do BAF durante o ciclo celular, analisamos o conteúdo de DNA após o tratamento luteolina. A expresso ectópica não BAF não influenciar a progressão do ciclo celular (Fig. S3A). Após a administração luteolina, ectópica expressa BAF não pode resgatar acumulação G1 induzida por luteolina (Fig. S3B), sugerindo que a paragem em G1 induzida por luteolina não é por inibição resultou BAF mas por inibição da fosforilação mediada por BAF VRK1.

luteolina induz a viabilidade celular reduzida e apoptose subsequente

Uma vez que o efeito inibitório de luteolina mediada pela ligação ao domínio catalítico de VRK1 foi confirmada, foi avaliada seus efeitos anti-tumorais em proliferação de células tumorais e sobrevivência. Os efeitos da luteolina sobre a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT em diferentes concentrações. Observou-se que a luteolina tratamento reduziu significativamente o crescimento do tumorigénico linhas de células HeLa e U2OS em comparação com as linhas de células não tumorigénicas BEAS-2B e HEK293A (Fig. 5A). A IC

50 valores em células HeLa e U2OS foram determinadas como 15,41 uM e 36,35 uM, respectivamente, ao passo que aqueles em células BEAS-2B e HEK293A foram aumentadas várias vezes em comparação com células tumorigénicas (74,41 uM e 263,3 uM, respectivamente) . Este resultado mostra que o efeito inibitório de luteolina sobre a proliferação celular é mais pronunciada em células tumorigénicas que as células não tumorigénicas, embora o nível de proteína VRK1 em linhas celulares não está correlacionada com tumorigenicidade (Fig. S4). Além disso, a luteolina inibe a viabilidade celular das células HeLa de uma forma dependente do tempo (Fig. 5B).

(A), os efeitos da luteolina sobre a viabilidade das células de HeLa (tumorigénicas e U2OS) e não-tumorigénico (BEAS-2B e HEK293A) linhas celulares.