Abstract

A amplitude de expressão HER2 por cancros do ovário humanos primários permanece controverso, que questiona a sua adequação como um antígeno universal neste malignidade. Para resolver estas questões, foi realizada a análise de expressão HER2 extensa em uma grande painel de tumores primários, bem como linhas celulares de cancro do ovário humano estabelecida e de curto prazo. imunohistoquímica convencional (IHC) a análise dos vários sites de tumor em 50 casos de carcinomas serosos ovarianos de alto grau revelou HER2 sobre-expressão em 29% dos locais avaliados. No entanto, os métodos de detecção mais sensíveis, incluindo citometria de fluxo, Western blot e Q-PCR revelou a expressão de HER2 em todas as células tumorais frescas derivadas a partir de ascites ou de tumores sólidos primários, bem como todas as linhas celulares de cancro em cultura de curto prazo e estabelecidos. As células cancerosas geralmente expressa HER2 em níveis mais elevados do que a encontrada em células normais do epitélio de superfície do ovário (OSE). Por conseguinte, geneticamente manipulada células T humanas que expressam um receptor específico de antigénio HER2 quimérico (CAR) reconhecido e reagido contra todas as células de cancro do ovário ou estabelecidas primários testados com pouca ou nenhuma reactividade contra as células normais OSE. Em conclusão, todos os cancros do ovário humanos expressam níveis imunologicamente detectáveis ​​de HER2, o que indica que a medição IHC subestima a verdadeira frequência de cancros do ovário que expressam HER2 e pode limitar o acesso dos pacientes às terapias alvo-HER2 de outra forma clinicamente significativas.

Citation : Lanitis E, Dangaj D, Hagemann IS, Song DG, Melhor A, Sandaltzopoulos R, et al. (2012) células primárias de ovário humano cancro epitelial Em termos gerais Expresso HER2 nos Níveis imunologicamente detectável. PLoS ONE 7 (11): e49829. doi: 10.1371 /journal.pone.0049829

editor: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Julho, 2012; Aceito: 17 de outubro de 2012; Publicação: 26 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Lanitis et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O cancro do ovário Fund Research, Sandy Rollman Fundação do cancro do ovário, Institutos nacionais de Saúde (1R21CA152540) eo Joint Fox Chase Cancer Center e da Universidade da Pensilvânia Ovarian Cancer SPORE (P50 CA083638). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o

ERBB2

proto-oncogene codifica um receptor da tirosina-cinase transmembranar proteína envolvida no desenvolvimento e progressão de muitas cancros, incluindo cancro do ovário [1], [2]. Desregulado sinalização HER2 no cancro do ovário (OVCA) resulta de qualquer amplificação ou sobreexpressão do gene e leva ao crescimento rápido de células [3], melhoria da reparação do ADN [4] e aumentou a formação de colónias [5]. Sobreexpressão de Her2 está associado com um maior risco de progressão e da morte entre as mulheres, especialmente com FIGO fase I e II OVCA [6]. No entanto, nenhuma correlação foi encontrada entre a presença da sobreexpressão de Her2 e fase FIGO, sugerindo que a activação de sobreexpressão do Her2 é ampla e pode ocorrer tanto nas fases precoce e tardia da doença [7]. Estas qualidades que aparecem para fazer uma molécula HER2 atraente para imunoterapias específicas em mulheres com câncer de ovário HER2-positivo, em que ocorrem naturalmente CD4

+ e CD8

+ foram observadas respostas de células T [8].

expressão da proteína HER2 é mais comumente detectada através de análise semi-quantitativa IHC em tecidos embebidos em parafina usando protocolos estabelecidos utilizados para a avaliação de pacientes com câncer de mama a ser considerada para o tratamento anti-HER2 Herceptin (trastuzumab) [9]. A medida em que HER2 é expressa por OvCas permanece controverso, como a taxa de OvCas HER2-positivos relatados na literatura varia de 4,9% a 52,5% [6], [7], [10], [11], [12] [13], [14], [15]. No entanto, num estudo realizado por Hellstrom et ai., Todas as linhas de células de tumor que foram estabelecidos

In vitro

de tumor sólido ou ascite expresso de HER2 sugerindo uma vantagem de crescimento selectivo para células cancerosas HER2-positivos em cultura [16 ]. Uma linha de células estabelecida foi demonstrado ser sensível a citotoxicidade celular dependente de anticorpo dirigido-HER2 (ADCC), no entanto, a expressão de HER2 e sensibilidade ADCC não foi avaliada em células derivadas de ovários fisiológicas. Além disso, HER2 análise de expressão de fluxo utilizada citometria como método de detecção única e foi limitado a um número relativamente pequeno de casos, confiando pesadamente sobre in vitro cultura de células.

No estudo atual, estabelecidas linhas celulares de cancro do ovário, primária linhas de células em cultura de curto prazo e de células de cancro do ovário frescos derivadas a partir de ascites e espécimes de tumores sólidos foram avaliados quanto à expressão de HER2 utilizando vários métodos de detecção, incluindo a PCR quantitativa (Q-PCR), análise de western blot e citometria de fluxo, e os níveis de expressão foram comparados aos níveis em células epiteliais da superfície do ovário normal correspondente. Além disso, os níveis de imunologicamente activas de HER2 foram medidos utilizando células T humanas que foram geneticamente modificadas para expressar um receptor de antigénio quimérico específico do HER2 (CAR). As células anti-HER2 CARRO T foram avaliados quanto à sua capacidade para reconhecer OvCas-expressando HER2 e células normais. Nossos resultados demonstram que todas as amostras OVCA expressão de HER2, e que este nível de expressão é suficiente para provocar o reconhecimento imunológico.

A.

Imunocoloração mostrando a diversidade regional de expressão HER2 em papilar de alto grau serosa adenocarcinoma do ovário. Os níveis de expressão de HER2 foram classificados em uma escala de 0-3 (escore 0 = indetectável, marcar 3 = forte coloração). Ampliação original era de 200 ×.

B.

Ilustração Heatmap do nível de expressão de HER2 em 50 casos de carcinoma de ovário primários e metastáticos, como marcado por coloração IHC.

C

Distribuição de frequência de locais que expressam HER2 em níveis que variam de pontuação de 0 a 3. O número médio de locais avaliados para os casos com expressão indetectável ou detectável HER2 foi semelhante (4,2 vs 3,7, respectivamente;.

P

= 0,19). .

D Distribuição de frequência

de sítios, quer primários ou metastáticos que expressam HER2 em níveis que variam de pontuação de 0 a 3. Uma maior frequência de locais de tumores primários expressa HER2 (36%; 30/84) em comparação com metástases (24 %; 27/111) e teve uma pontuação expressão HER2 maior média (0,37

vs

0,21,

P

= 0,04).. Não houve diferença significativa comparando os níveis de expressão entre os sítios primários e metastáticos que expressaram HER2 em qualquer nível (1,03

vs.

0,86,

P

= 0,26).

valores P

foram calculados usando análise de teste t de Student não pareado.

Materiais e Métodos

Células e linhas de cancro

Os doadores entraram em um University of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB) -aprovado protocolo clínico e assinaram um consentimento informado antes de tumor ou coleta de sangue. Para tumores sólidos ou de amostras normais de ovário, a amostra foi cortada em cubos, em RPMI-1640, lavou-se e centrifugou-se (800 rpm, 5 minutos, 15-22 ° C), e ressuspensas em tampão de digestão enzimática (0,2 mg /ml de colagenase e 30units /ml de DNase em meio RPMI-1640) para a rotação durante a noite à temperatura ambiente. coleções ascite foram lavadas e criopreservadas antes de estudo. linhas primárias em cultura de curto prazo foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Richard Carroll da Universidade da Pensilvânia [17]. As linhas celulares do ovário e cancro da mama humano estabelecidas, a linha celular CEM de células T humanas de linfoblastos-like e da linha celular 293T foram adquiridos (ATCC). Iosé-6 linhas de células normais Iosé-4 e foram gentilmente cedidas pelo Dr. Birrer de Dana-Farber /Harvard Cancer Center [18] e a linha 398 células foi um presente do Dr. Lin Zhang, da Universidade da Pensilvânia [19]. células 293T e linhas celulares tumorais foram mantidas em meio completo; RPMI-1640 (Invitrogen) suplementado com 10% (v /v) de FBS inactivado pelo calor, 2 mM de L-glutamina, e 100 ug /mL de penicilina e 100 U /mL de estreptomicina.

a.

ERBB2

níveis de mRNA em linhas celulares de cancro do ovário por q-PCR.

ERBB2

níveis de ARNm de linhas celulares de cancro do ovário são em relação ao de células CEM-ErbB2 negativo. Todas as linhas de células de câncer de ovário expressam

ERBB2

mRNA. B-actina foi utilizado como um controlo do gene endógeno. Os resultados representam a média ± DP de poços em triplicado. A média relativa

ERBB2

expressão de mRNA entre estabelecido e linhas celulares OVCA de curto prazo não foi estatisticamente diferente (

P

= 0,45).

P

valor foi calculado usando a análise do teste t de Student não pareado.

B

Detecção da expressão da proteína HER2 superfície (histogramas a cheio) por linhas de células de cancro do ovário humano por citometria de fluxo.; controlo de anticorpo de isotipo (histogramas a branco).

C.

Análise Western blot da expressão da proteína HER2 em linhas celulares representativos expressando montantes diferenciais de HER2. proteína HER2 é expresso em níveis variáveis ​​em todos as linhas de células de ovário testadas. B-actina foi utilizada como controle.

Imunohistoquímica

Institutional Review Board aprovação foi obtida. Foram recuperados os registros de 50 pacientes consecutivos com câncer metastático papilar seroso do ovário (FIGO estádio IIB e acima) submetidos a ressecção primária em nossa instituição entre 2005 e 2008. As lâminas foram revistos e anotado e foram selecionados os blocos de tecido embebidos em parafina para construir um tissue microarray de tumores primários e metastáticos. 206 total de depósitos tumorais (sítios primários e metástases) foram representados na matriz. Uma média de 3,7 locais foram incluídos por paciente. Os locais mais comuns das metástases incluídos omento, peritônio (por exemplo, cul-de-sac), serosa uterina, e da parede do intestino. Para cada bloco, em triplicado núcleos de 0,6 mm de tumor foram colocadas sobre uma micromatriz de tecido. 5 uM secções de parafina foram coradas com anticorpo anti-HER2 humana de coelho (Dako) de acordo com protocolos padrão. expressão de HER2 em cada núcleo foi marcado por microscopia de luz a 200 × de ampliação usando uma escala semiquantitativa que varia de 0 a 3. Os núcleos mostram menos do que 10% do tumor não foram marcados. Para cada local do tumor, a pontuação final a média das pontuações de todos os núcleos avaliáveis.

Quantitative PCR

RNA foi isolado usando RNA kit fácil (Qiagen). cDNA foi gerado a partir de 1 ug de RNA usando First Strand Ready-To-Go esferas (GE Healthcare). PCR em tempo real foi realizada em triplicado, utilizando iniciadores da Applied Biosystem para

ERBB2

e B-actina.

ERBB2

níveis de ARNm em células cancerosas foram normalizados para B-actina, e em comparação com aqueles na CEM, e são apresentados como dobra

ERBB2

nível de ARNm. aquisição e análise de dados foi realizada de acordo com as instruções do Applied Biosystem.

A

.

ERBB2

quantificação de ARNm em células cancerosas ascite primária empobrecido-CD45. SKOV-3 e CEM foram utilizadas como linha de células que expressam HER2 controlos positivos e negativos, respectivamente. Barras representam a média ± SD de valores de poços em triplicado.

B

.

ERBB2

quantificação de ARNm em células de tumores sólidos primários com depleção de CD45. Não houve diferença significativa na média

foi observada ERBB2

nível de mRNA entre ascite e tumores sólidos (

P

= 0,46).

C.

Expressão HER2 Superfície (histogramas sólidos) pelo representante Ber-Ep4

+ CD45

– ascite fechados e células cancerígenas derivadas de tumores sólidos monitorados por citometria de fluxo; controlo de anticorpo de isotipo (histogramas a branco). Não foi observada diferença significativa no nível de proteína HER2 entre ascite ou tumores sólidos células derivadas (

P

= 0,95).

D.

Análise Western blot da expressão da proteína HER2 em lisados ​​de tumores sólidos a granel. B-actina foi utilizado como controlo do gene endógeno. OVCAR-3 e CEM foram utilizados como controlos positivos e negativos para a expressão de HER2. Os valores de P foram calculados usando análise de teste t de Student não pareado.

Citometria de Fluxo

Mouse anti-humano CD3, CD4, CD8, CD45, CD69, CD107a e CD107b mAbs (

BD Biosciences)

foram utilizados para análise fenotípica. 7-AAD foi usada para coloração de viabilidade. a expressão de superfície de HER2 foi avaliada utilizando biotina-conjugado anti-HER2 affibody (Abcam) seguido de estreptavidina marcada com PE. Anti-HER2 expressão de superfície CAR foi avaliada utilizando quimera HER2 Fc humana recombinante seguido de PE-conjugado anti-HuIgG. Aquisição e análise foi realizada utilizando uma BD FACS CANTO II com software DIVA.

A.

ERBB2

mRNA quantificação em células normais OSE (398, Iosé-4, Iosé -6 e 1744) por Q-PCR. SKOV-3 e CEM foram usadas como HER2 positivo e negativo linhas celulares que expressam, respectivamente. As barras mostram a média ± DP de poços em triplicado.

B

expressão da proteína de superfície de HER2 (histogramas a cheio) por células epiteliais normais de ovário, por citometria de fluxo.; controlo de anticorpo de isotipo (histogramas a branco).

C-D.

Comparação da

ERBB2

níveis de mRNA e proteína entre ascite cancro do ovário, tumor sólido e células OSE normais. (

C

) gráficos de dispersão verticais da

ERBB2

mRNA em ascite, tumor sólido e OSE normais determinados pelo q-PCR. A média de cada grupo está indicada pela linha horizontal.

P

= 0,0498 na comparação

ERBB2

mRNA em ascite vs células OSE normais;

P

= 0,0210 na comparação

ERBB2

mRNA em tumores sólidos vs células OSE normais. (

D

) gráficos de dispersão vertical dos níveis de proteína em ascite, tumor sólido e OSE normal determinado por citometria de fluxo. A média de cada grupo está indicada pela linha horizontal

P = 0,0616

quando comparando proteína HER2 em ascites de células vs OSE normais;

P

= 0,1749 na comparação proteína HER2 em tumores sólidos vs células OSE normais.

valores P

foram calculados usando análise de teste t de Student não pareado.

Western Blot

monocamadas celulares foram lavadas com solução salina de tampão fosfato (PBS) e lisadas em tampão RIPA (Tris-HCl a 50 (pH 7,0), 1,0% de NP-40, 0,1% de ácido desoxicólico, de Na 30 mM

3VO

4, 1 mM PMSF). Os lisados ​​foram clarificados por centrifugação e quantificado usando um kit de Nanoorange (Invitrogen). 15 ug de proteína total por pista foi resolvido por electroforese em gel de poliacrilamida dodecil de sódio (SDS-PAGE) num gradiente de pré-molde (4-15%) geles (Bio-Rad) a 120 V durante 60 minutos. A proteína foi transferido do gel para uma membrana de transferência Immobilon-P durante 30 minutos, bloqueadas durante a noite com 5% leite /PBST e colocados a hibridar com 1 ug /ml de mAb de murganho anti-HER2 humana (clone 3B5, Biosciences BD). As membranas foram lavadas 3 × com PBST e colocados a hibridar com anticorpo secundário anti-ratinho conjugado com HRP durante 1 hora à temperatura ambiente. B-actina foi detectada utilizando anti-humana de B-actina-HRP (1:30,000). As membranas foram incubadas com ECL Plus (GE Healthcare) por 5 minutos e expostos a filmes de 15-30 seg.

A

. Representação esquemática da construção anti-HER2 quimérico Antigen Receptor (CAR) contendo o domínio citosólico CD3ζ sozinho (C6.5-z). C6.5, anti-HER2 de scFv; VL, cadeia leve variável; L, Linker; VH, cadeia pesada variável; TM, região transmembranar. expressão CAR C6.5 scFv (histogramas cinza) foi detectado em CD4 humano

+ e CD8

+ – células T bloqueadas usando proteína humana recombinante HER2-Fc quimérico 10 dias após a transdução, em comparação com células T não transduzidas (histogramas abertas ). Percentagem de transdução CAR é indicado.

B.

Anti-HER2 CAR células T transduzidas produzem IFN-γ especificamente após estimulação com linhas celulares de cancro do ovário humano. CAR transduzidas ou não transduzidas células T foram cultivadas sozinho (nenhum) ou estimulada durante a noite com humano HER2

+ estabelecida e linhas de ovário de curto prazo de células cancerosas ou HER2

– linhas de controle da CEM e MDA468. IFN-γ foi quantificado a partir dos sobrenadantes isentos de células por ELISA. células

C.

Anti-HER2 CAR T secretam IFN-γ após a estimulação por HER2

+ ascite primário (esquerda) ou células de tumores sólidos ovário (meio). quantidades mínimas de IFN-γ foram detectados após a estimulação com as células epiteliais da superfície do ovário normais 398, Iosé-4, 6-Iosé ou 1744 (para a direita). As concentrações de citoquinas (pg /ml) são relatados como a média ± SEM dos poços em triplicado.

anti-HER2 CARRO Construção

produtos de PCR contendo a C6.5Y100KA HER2 scFv [20] foram gentilmente cedidas por Silvana Canevari (Instituto Nazionale Tumori dei, Itália) e, em seguida clonado no vector pCR2.1-TOPO, utilizando o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen). A sequência de ADN de scFv C6.5 [21] foi desenvolvido a partir do plasmídeo acima utilizando multi QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). O plasmídeo final foi utilizado como um molde para a amplificação por PCR de um fragmento scFv C6.5 795 pb utilizando os seguintes iniciadores: 5′-GCGGGATCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGGCA-3 ‘(BamHI está sublinhado) e 5′-GCGGCTAGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCC-3’ (está sublinhada Nhel ). O produto de PCR resultante foi digerido com BamHI e Nhel e ligado nos pCLPS vector de terceira geração de auto-inactivação de expressão lentiviral contendo uma sequência de sinalização CD3ζ CAR, com a expressão do transgene dirigida pelo promotor de CMV. A construção resultante foi designada pCLPS-C6.5-Z.

C6.5 CARRO células T desgranulam e expressam marcadores de activação de células T em resposta à estimulação específica do HER2. células C6.5 CAR T foram cultivadas sem células alvo (nenhum) ou com as metas HER2-negativo ou -positivo estabelecida e células do tumor primário indicados ou células OSE normais para 5 h ao ser manchado por um anti-CD107a, b anticorpo conjugado com FITC. Após o período de incubação, as células T foram coradas para CD8 e CD69 e analisados ​​por citometria de fluxo.

recombinante Lentivírus Produção

de título elevado vectores lentivirais defeituosos na replicação foram produzidos e concentrou-se quanto previamente descrito [22]. Resumidamente, as células 293T foram transfectadas com 7 ug pVSV-G plasmídeo, 18 ug de plasmídeo pRSV.REV, o plasmídeo 18 ug pMDLg /p.RRE, e 15 ug do plasmídeo de transferência pCLPS-C6.5-z usando Express em (Open Biosytems). sobrenadante viral foi colhido 24 h e 48 h pós-transfecção. As partículas virais foram concentrados por ultracentrifugação durante 3 h a 25.000 rpm com um rotor Beckman SW28 (Beckman Coulter) e ressuspensas em 0,4 ml de RPMI.

A transdução de células T

células T humanas primárias adquiridos a partir da Human Immunology Núcleo da Universidade da Pensilvânia foram isoladas de doadores voluntários saudáveis ​​após leucaferese por seleção negativa. Todas as amostras foram recolhidas no âmbito de um protocolo Universidade Institutional Review Board-aprovado, e consentimento informado por escrito foi obtido de cada doador. As células T foram estimuladas em meio completo com anticorpo anti-CD3 e anti-CD28 mAb grânulos revestidos (Invitrogen) e transduzidas com lentivírus que codifica CARRO recombinante a uma MOI de ~5-10 como descrito [22].

libertação de citoquinas ensaios

1 × 10

5 t as células foram co-cultivadas com 1 × 10

5 células alvo por poço, em triplicado, em placas de 96 poços de fundo redondo num volume final de 200 ul de meio completo. Após 20~24 h, os sobrenadantes isentos de células foram ensaiados quanto à presença de IFN-γ usando um kit de ELISA (BioLegend) ou citocinas do grânulo Array (BD Biosciences), de acordo com as instruções dos fabricantes.

A desgranulação Ensaio

O ensaio foi realizado como descrito [23], com modificações menores. 1 × 10

5 t as células foram co-cultivadas com 1 × 10

5 100 células-alvo em meios ul por poço numa placa de 96 poços em triplicado. As culturas de controlo continham células T sozinho. Anti-CD107a e CD107b anti-Ab (10 ul /cavidade) ou IgG1 conjugado com FITC (BD Biosciences), e 1 ul /amostra de monensina (BD Biosciences) foram adicionadas à cultura e incubadas durante 5 h a 37 ° C. As células foram lavadas duas vezes com PBS, coradas para expressão de CAR, CD8 e CD69 e analisados ​​por citometria de fluxo como descrito acima.

crómio Ensaio de Libertação de

foram realizados ensaios de libertação de 51Cr tal como descrito [24]. As células alvo foram marcadas com 100 uCi

51Cr, a 37 ° C durante 1,5 horas. As células alvo foram lavadas três vezes em PBS, ressuspensas em meio de cultura a 1 × 10

5 células viáveis ​​/ml e 100 ul adicionados por cavidade de uma placa de 96 poços de fundo em V. As células efectoras foram lavadas duas vezes em meio de cultura e adicionados a poços com as proporções dadas. As placas foram rapidamente centrifugadas para resolver as células, e incubou-se a 37 ° C num CO 5%

2 incubadora durante 18 horas depois do que os sobrenadantes foram colhidos, transferidas para um lumar-placa (Packard) e contadas usando um 1450 Microbeta Contador de Cintilação líquida (Perkin-Elmer). Espontânea

liberação 51Cr foi avaliada em células alvo incubadas apenas com meio. Máximas

51Cr de libertação foi medida em células alvo incubadas com SDS a uma concentração final de 2% (v /v). lise específica percentual foi calculada como (experimental – espontânea lise /máxima – lise espontânea) vezes 100.

Análise Estatística

GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software) foi utilizado para os cálculos estatísticos.

P Art 0,05 valores foram considerados significativos. valores de R-quadrado (R

2) foram calculados utilizando regressão linear através do Microsoft Excel.

Resultados

Detecção imunohistoquímica de HER2 Expressão em Ovarian Cancer

expressão HER2 foi avaliada em 50 casos de alto grau de carcinomas serosos ovarianos utilizando análise imuno-histoquímica (IHQ) em um tissue microarray (TMA). Casos individuais variou no que diz respeito ao número de locais de tumor disponíveis para análise. Todos os casos continha pelo menos um local da lesão primária, enquanto a maioria dos casos (96%) teve tanto primário e metastático ≥1 local disponível. Para muitas amostras, houve ≥2 (62%) ou ≥3 (42%) metastáticas locais disponíveis na TMA. De acordo com IHC pontuação, HER2 foi expressa em vários níveis entre os 50 casos que vão desde indetectável (pontuação 0) a coloração forte (escore 3+; Figura 1A). expressão HER2 positivo em qualquer nível foi detectada em 26 casos (52%), enquanto não HER2 foi detectado em qualquer local em 24 casos (Figura 1B). Dos 26 casos que expressam HER2 em um ou mais locais, apenas 6 (23%) expressaram HER2 em todos os locais por IHC; Nesses casos foram ponderados para a maior expressão de HER2. A maioria dos casos que expressaram HER2 em qualquer local (20/26) apresentaram expressão discordante (detectável contra indetectável) em um ou mais locais de tumor. O número médio de locais avaliados foi similar entre os 26 casos com HER2 detectável e 24 casos sem HER2 detectável (4,2 vs 3,7, respectivamente; meio de cultura

P

= 0,19). Heterogeneidade na padronização da expressão da proteína HER2 entre os diferentes sites em casos individuais esteve presente com vários padrões: detectável em todos (6/50); detectável no primário, mas indetectável no metastático tumor (8/50); detectável em metastático, mas indetectável no primário do tumor (5/50); em, pelo menos, um primário e outro metástases detectáveis ​​(7/50). De 195 locais de tumor avaliados, 138 (71%) não mostraram expressão de HER2 detectável (Figura 1C). Cinquenta e sete (29%) tiveram expressão HER2 positivo; 25% (49/195) com um 0≤1 pontuação HER2; 2,5% (5/195) com um 1≤2 pontuação HER2; e 1,5% (3/195) com um pontuação 2≤3 HER2. A maior frequência de locais de tumores primários expressa HER2 (36%; 30/84) em comparação com metástases (24%; 27/111) e tinha uma maior média de pontuação expressão HER2 (0,37

vs

0,21,

P

= 0,04; Figura 1D). Entre sítios primários e metastáticos que expressaram HER2 em qualquer nível, não houve diferença estatisticamente significativa no nível de expressão (1,03

vs.

0,86,

P

= 0,26). Em conclusão, IHC permite a detecção de expressão HER2 em 29% de todos os sites e aproximadamente metade de todos os casos OVCA avançados testados.

HER2 é expresso por todas as linhas celulares do cancro do ovário

O relativamente baixa sensibilidade da análise IHC pode influenciar a detecção de proteínas de baixa abundância e, portanto, deturpar a verdadeira frequência de cancros que expressam HER2. Para melhor avaliar a expressão de HER2 em OVCA, 12 estabelecida e 7 de curto prazo OVCA linhas celulares foram medidos para

ERBB2

níveis de ARNm por Q-PCR, e comparada com a detectada a partir CEM, uma célula T humana de linfoblastos semelhante A linha de células que não possui expressão de HER2 [25]. Todas as linhas de células OVCA expresso

ERBB2

mRNA, embora a diversos níveis (Figura 2A). Aumento

ERBB2

expressão de ARNm, em relação ao controlo a CEM, variou de 63- a 6614 vezes em linhas estabelecidas e de 40 a 1088 vezes em linhas celulares primárias de curta duração. Média relativa

ERBB2

expressão de ARNm entre os estabelecida (815 vezes) e linhas de células OVCA de curto prazo (372-vezes) não foi estatisticamente diferentes um do outro (

P

= 0,45).

ERBB2

ARNm não foi detectado na linha CEM de controlo, mas foi detectada em níveis baixos na linha de cancro da mama de controlo, MDA468, que expressa

ERBB2

ARNm, mas não a superfície da proteína HER2 [25] .

a expressão da proteína HER2 foi examinada em linhas de células estabelecidas e de curto prazo do tumor primário por coloração de células não-permeabilizadas com uma altamente sensíveis anti-HER2 affibody [25], um ligando de alta afinidade contra o domínio extracelular de HER2 , seguido por análise de citometria de fluxo. histogramas representativos mostram linhas celulares estabelecidas que expressam níveis elevados OVCA, intermédios ou de baixo da superfície da proteína HER2, e linhas de células de controlo negativo sem expressão detectável de HER2 (Figura 2B). Todos os estabelecida (N = 12) e curto-prazo (n = 7) linhas celulares OVCA testadas mostraram expressão de HER2 superfície da proteína (Tabela 1). A maioria das células em estabelecida (97,7 ± 1,3%) e as linhas de curto prazo (88,9 ± 4,8%) expressaram proteína HER2, com uma percentagem mais elevada nas linhas estabelecidas (

P

= 0,03) (Tabela 1). Os níveis médios de proteína HER2 medidos pela intensidade específica média de fluorescência (MFI) tenderam no sentido de ser mais elevada em linhas celulares estabelecidas (1906 ± 1221 FIU; unidades intensidade de fluorescência) em comparação com linhagens de células de curto prazo (594 ± 165 FIU), mas não foram significativamente diferentes (

P

= 0,43) (Tabela 1), consistente com resultados de ARNm. proteína HER2 e

ERBB2

níveis de expressão de mRNA de todas as linhas de células OVCA foram significativamente correlacionados (R

2 = 0,83; calculada utilizando regressão linear). a expressão da proteína HER2 celular foi confirmada por análise de Western blot (amostras representativas mostrado; Figura 2C).

Broad HER2 Expressão na Primária do cancro do ovário Os espécimes

Desde

in vitro

cultura pode enriquecer selectivamente para células OVCA-expressando HER2 [16], nós medimos a expressão HER2 nas células tumorais sem cultura derivadas diretamente de ascite OVCA peritoneal primário ou tumores sólidos recém-ressecados. As células tumorais de ascite ou de tumores sólidos espécimes foram enriquecidas por depleção magnética de CD45

+ leucócitos e avaliadas para o parente

ERBB2

níveis de ARNm através de Q-PCR (Figura 3A, B). Todas as células tumorais sem cultura primária testados (n = 22), expressa

ERBB2

ARNm em níveis que variam de 35 a 1225 vezes mais elevada do que as células CEM. Não houve diferença significativa na média

ERBB2

foi observado nível de mRNA entre ascite e tumores sólidos (477

v

s 583, respectivamente;.

P

= 0,46). A citometria de fluxo efectuada utilizando affibody anti-HER2 mostrou que as células não-permeabilizadas tumorais (BerEp4

+ CD45

-) em todas as ascite primários (N = 22) e amostras de tumores sólidos (n = 10), expressa a proteína HER2 superfície, se bem que a níveis variáveis, de acordo com a detecção de

ERBB2

ARNm por Q-PCR (Tabela 2; dados representativos mostrados na Figura 3C). Não foi observada diferença significativa no nível de proteína HER2 entre ascite ou tumores sólidos células derivadas (7209 ± 1197 FIU

vs

7407 ± 2531 FIU, respectivamente;.

P

= 0,95), de acordo com resultados de ARNm. análise de Western blot realizada em lisados ​​tumorais integrais também mostraram expressão ubíqua de HER2 nos tumores sólidos primários (amostras representativas mostrado na Figura 3D).

detectável expressão HER2 em condições normais de ovário células epiteliais

Três ovário imortalizado linhas de superfície de células de epitélio (OSE) e uma amostra de células não cultivadas primárias (1744) derivadas de ovários normais foram testadas para a expressão HER2. Todas as células normais OSE expressa níveis baixos de

ERBB2

ARNm que variou de 35 vezes a 217 vezes maior do que as células CEM de controlo (128 ± 5,5; Figura 4A). A citometria de fluxo (Figura 4B) e a análise Western blot (não mostrados) indicaram que todas as células normais OSE expressam baixos níveis ainda detectáveis ​​de proteína HER2. Iosé-6 e linhas de células Iosé-4 expressa níveis de proteína mais elevadas do que a linha 398 e 1744 espécime ovário normal, de acordo com resultados de mRNA.

Em seguida, compararam os níveis de

ERBB2

de mRNA e proteína em células normais, OSE ascites malignas primárias e células de tumor derivadas de tumores sólidos (Figuras 4C-D). Ascite e amostras de tumores sólidos geralmente expressa níveis mais elevados de

ERBB2

mRNA e proteína em comparação com células OSE, embora uma sobreposição em nível de expressão existia entre os grupos. Ascite e tumores sólidos expressa significativamente mais

ERBB2

mRNA de OSE células (ascite, 483 ± 319 vezes,

P

= 0,0498; tumor sólido, 583 ± 330 vezes,

P

= 0,0210; OSE, 128 ± 93 vezes). Os níveis de proteína HER2 tendeu a ser maior em ascite (5825 ± 1202 vezes) e amostras de tumores sólidos (7407 ± 2531 vezes) em comparação com OSE normal (1429 ± 111 vezes), mas a significância estatística baixa (ascite

. v

s OSE

P

= 0,0616;. Sólidos

vs

OSE

P

= 0,1749). A variação nos níveis de expressão de HER2 em amostras OSE foi limitada, permitindo uma discriminação fiável de amostras de tumores que sobre-expressam HER2. Por comparação, 75% (9/12) de ascite e 90% (9/10) de tumores sólidos expressaram níveis mais elevados de HER2 em comparação com OSE e 91% (20/22) de ascite e 80% (8/10) sólido tumores tinham níveis mais elevados de proteína HER2 OSE células normais.

células T específicas para HER2 reconhecer todas as linhas celulares do ovário, carcinoma

receptores de antigénios quiméricos (CARs) combinam a especificidade de anticorpo para um antigénio de superfície com o efector actividade de linfócitos T [26]. As células T que expressam carro específico-HER2 pode exercer uma actividade potente, dependente da dose

in vitro

anti-tumor contra células alvo HER2-positivo [20], [25]. Para investigar a extensão na qual a expressão de HER2 por largo OVCA confere sensibilidade à imunoterapia alvo-HER2, as células T do doador humano foram geneticamente modificadas para expressar um carro anti-HER2 (C6.5) [27], redireccionando-os assim contra HER2 superfície, e testados quanto à actividade específica contra OvCas. A construção C6.5 carro é constituído por o scFv C6.5 ligada a uma dobradiça e transmembranar região CD8a, seguido por um domínio intracelular CD3ζ sinalização (C6.5-Z; Figura 5A). + células primárias CD4 humana

+ e CD8

T foram eficientemente transduzidas com carro usando vetores de lentivírus com eficiências de transdução reproducibly 60% (Figura 5A). Em co-cultura, as células anti-HER2 carro t reconhecido e respondeu à estimulação por todos os estabelecida (N = 10) ou a curto prazo (n = 4) células OVCA humanos, mas não contra a CEM e linhas de células MDA-468 sem expressão de HER2 (Figura 5B).