Humana

Abstract

A identificação de novas proteínas que potencialmente pode contribuir para a carcinogênese é um risco necessário. Relata-se a primeira caracterização bioquímica do romance F-box e WD40 contendo proteínas, FBXW4. Identificámos parceiros proteínas que interagem e demonstraram que FBXW4 faz parte de um complexo de ubiquitina ligase. Além disso, o locus Fbxw4 é um sítio comum de inserção proviral em uma variedade de modelos de cancro murino mutagénese de inserção retrovirais e Fbxw4 mRNA é altamente expresso na glândula mamária murino involução. Para começar a caracterizar a função bioquímica de Fbxw4, utilizou-se a análise para demonstrar que proteomic Fbxw4 interage com Skp1 (SKP1), Cullin1 (CUL1), anel-caixa1 (RBX1) e todos os componentes do signalosome COP9. Todas estas interacções são dependentes de um domínio da caixa F intacta de Fbxw4. Além disso, Fbxw4 é capaz de interagir com as proteínas ubiquitinadas dentro das células de uma forma dependente da caixa-F. Finalmente, foi demonstrado que FBXW4 está mutado, perdido e sob-expresso numa variedade de linhas de células de cancro humano e amostras clínicas de doentes. Importante, expressão de FBXW4 se correlaciona com a sobrevida dos pacientes com câncer de pulmão não-pequenas células. Tomados em conjunto, sugerimos que FBXW4 pode ser um romance supressor de tumor que regula processos celulares importantes

Citation:. Lockwood WW, Chandel SK, Stewart GL, Erdjument-Bromage H, Beverly LJ (2013) A Novel ubiquitina ligase Complex, SCF

Fbxw4, Interage com o COP9 Signalosome em uma maneira dependente da F-Box, está mutado, Lost e Sub-expresso em cancros humanos. PLoS ONE 8 (5): e63610. doi: 10.1371 /journal.pone.0063610

editor: Deanna M. Koepp, da Universidade de Minnesota, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de fevereiro de 2013; Aceito: 05 de abril de 2013; Publicado em: 02 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lockwood et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH), Molecular Metas COBRE, 8P20GM103482-10 (para LJB), Wendy Will Fundo Caso Câncer, GB220413 (para LJB), concessão Kosair Cancer Research Program Pediátrica (para LJB). Este trabalho também foi apoiado pelo NCI Cancer Center suporte concessão P30 CA08748 para Microquímica e Proteomics Núcleo Laboratory (a HEB), Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Este trabalho também foi apoiado, em parte, pelo NIH Grant CA94060 P01 e PO1 CA129243-01 (a Harold Varmus) e pelo NIH intramural NCI e os fundos NHGRI (para Harold Varmus). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ubiquitina ligase complexos catalisam a conjugação de ubiquitina em proteínas de substrato [1]. Ubiquitinação de proteínas pode ter uma variedade de efeitos sobre a função da proteína com o melhor bem estudado sendo a regulação da estabilidade da proteína [2]. complexos de ubiquitina-ligase (E3 também chamados ubiquitina ligases) interagir com um E1 (enzima de activação da ubiquitina), e um E2 (enzima de conjugação da ubiquitina) [1]. As enzimas E1 e E2 são normalmente partilhados entre muitas ligases E3 E3 e o componente é o factor de especificidade que interage directamente com as proteínas de substrato. Um tipo de complexo de ubiquitina ligase E3, o complexo de SCF ubiquitina-ligase, contém Skp1, Cullin1, anel-caixa1 e qualquer uma de mais de setenta F-box contendo proteínas codificadas nos genomas de eucariotas superiores [3], [4]. O domínio F-box é responsável por interagir directamente com Skp1, ao passo que os outros domínios contidos na proteína são responsáveis ​​por interagir com proteínas de substrato e trazendo para a proximidade da ubiquitina ligase [5]. Importante, proteínas que contêm múltiplos da caixa-F estão bem caracterizados para desempenhar papéis diretos na origem de cânceres humanos [6], [7], [8], [9], [10]. Por exemplo, as mutações que conduzem a uma perda de função de FBXW7 ou BTRCP conduzir à estabilização das suas proteínas de substrato cognatos, Notch, myc e ciclina ou beta catenina, respectivamente, todos os quais são oncogenes bem conhecidos [6], [9] [11], [12], [13], [14], [15].

O signalosome COP9 é um complexo de tamanho mega-dalton composta por pelo menos oito proteínas originalmente identificadas através de uma tela genética em Arabidopsis [16], [17]. O complexo COP 9 é conhecido por regular uma variedade de complexos de ubiquitina ligase. O mecanismo exacto pelo qual COP 9 regula a função de complexos de ubiquitina ligase não é completamente compreendido, mas tem sido sugerido para regular a interacção entre as proteínas F-box e Skp1 regulando a conjugação da pequena NEDD8 proteína para Cullin1 [18], [19 ]. O ciclo de neddylation /de-neddylation facilita a interação ligase-substrato ubiquitina e subsequente turn-over do substrato. Assim, a actividade de muitos destes complexos de ubiquitina ligase foi demonstrado que requerem a interacção com o signalosome COP9 para um funcionamento adequado. Curiosamente, vários componentes do signalosome COP9 são conhecidas por ter funções independentes-COP9 e têm sido mostrados para contribuir para o cancro [20], [21], [22].

O locus FBXW4 foi originalmente mapeado como o região no cromossomo humano 10, que era o locus causal na mão transtorno membro malformação divisão de pés e 3 (SHFM3) [23], [24], [25], [26]. SHFM3 é um defeito no desenvolvimento da crista ectodérmica apical durante a formação do membro que provoca a aplasia dos dígitos central que conduz a que, nos casos mais graves, apenas dois dígitos por membro [27], [28]. Subsequentemente, constatou-se igualmente que Fbxw4 foi também o locus responsável por um defeito de desenvolvimento espontâneo do rato que se assemelhava SHFM3 em seres humanos [29]. Uma variedade de publicações que afirmam que a alteração de FBXW4 é responsável pelos defeitos, seguido por publicações sugerem que o locus que codifica a montante Fgf8 pode ser o culpado [30], [31]. Até à data, não há dados suficientes que desanuviada a questão.

Independentemente de FBXW4 contribui causalmente para SHFM3, até à data, nenhuma função molecular ou bioquímica tem sido atribuída a FBXW4. Através da combinação de mineração de dados, estudos de expressão, proteômica e bioquímica que começaram a expandir nosso conhecimento de FBXW4. Nós demonstramos que Fbxw4 é parte de um complexo ubiquitina ligase contendo Skp1, Cullin1, RBX1 eo signalosome COP9. Montagem deste complexo é dependente do domínio F-box de Fbxw4. Mais importante, mostra-se que FBXW4 locus é normalmente eliminada, sub-expresso e somaticamente mutado em cancros humanos. Além disso diminuição da expressão FBXW4 se correlaciona com pior sobrevida de pacientes com câncer de pulmão de células não-pequenas. Tomados em conjunto, nós supomos que FBXW4 pode ser um supressor de tumor desvalorizado em malignidades humanas em virtude da sua capacidade de regular a função das vias de sinalização críticas.

Materiais e Métodos

RT-PCR de Fbxw4 expressão

qRT-PCR foi realizada no “tecido normal qPCR painel rato I ‘do gato Origene. # MNRT101 (Rockville, MD, EUA), utilizando SYBR Green partir Biosystmes Aplicada (Foster City, CA, EUA) com os oligos GAPDH fornecidas e ‘3 mus Fbxw4 rt’ 5′-GTCCTCATCATGCCCAGAGAAGAC-3 ‘com’ 5 mus Fbxw4 ATG “5 ‘-ATGGCGGAGGACGCGGCGGAGGATGC-3’ ou ‘5 mus Fbxw4 rt’ 5′- GTCCTGTG GTTATGACACCTATG-3 ‘e’ 3 mus Fbxw4 sem parar ‘5’-TGGGTTCTGA AAGTCTAAGACGTG-3′.

plasmídeo constrói

Fbxw4 e Fbxo46 construções foram adquiridos a Origene (Rockville, MD, EUA) e utilizados como moldes de PCR. (. Fbxw4 Cat # MMM1013-7512491; Fbxo46 Cat # MMM98477851.). Fbxo46 foi amplificado com os seguintes oligos de ADN utilizando polimerase de respiradouro (NEBL, Ipswich, MA, EUA): Mus Fbxo46 ATG RI, 5′-GCGCGAATTCACCATGGACAGGGGCAGCCTCCTGCCC-3 ‘; mus Fbxo46 sem parar Sall, 5’- GCGCGTCGACCCTCCCCTCTTCCCGGCCAGC-3 ‘. PCR fragmentos amplificados foram clonados no kit de clonagem TOPO romba (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O full-length Fbxo46 foi então digerido com EcoRI e Sall e clonado no vector pBABE-FLAG, digerido com EcoRI e Xhol, que contém um epítopo tag “bandeira 3 a jusante e na mesma grelha de local Xhol, o epitopo de FLAG é então seguido por códons de terminação e um local Sall. Fbxo46 com um marcador FLAG 3 ‘em grelha foi em seguida digerido de pBABE com EcoRI e Sall e clonado no local EcoRI e XhoI do vector retroviral MIGRX.

Fbxw4 foi amplificado a partir do clone de ADN com OriGene respiradouro polimerase com os seguintes oligos: Mus Fbxw4 ATG RI, 5′-GCGCGAATTCACCATGGCGGAGGACGCGGCGGAGGATG-3 ‘; bandeira mus Fbxw4 parar XhoI, 5’- GCGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTATAATCCATTGGGTTCTGAAAGTCTAAG-3 ‘. PCR fragmentos amplificados foram clonados em romba TOPO. comprimento total Fbxw4 contendo um no-frame tag ‘BANDEIRA 3 foi depois recuperado por digestão EcoRI e XhoI. Este fragmento foi então clonado nos locais EcoRI e Xhol de MIGRX

Fbxw4

-fbox foi amplificado a partir do clone de comprimento completo Fbxw4 TOPO, utilizando os seguintes oligos:. Bandeira Fbxw4 parar XhoI, 5′-GCGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTATAATCCATTGGGTTCTGAAAGTCTAAG -3 ‘, Mus Fbxw4 -fbox EcoRI, 5-GCGCGAATTCACCATGGCCCGGGCCTCGCTCAACACC-3’. O fragmento amplificado por PCR foi clonado nos locais EcoRI e Xhol de MIGRX.

pRK5-HA-ubiquitina Addgene # 17608 depositado por Ted Dawson [32].

cultura celular

293 células T foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA, EUA) e cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10%. transfecções de ADN em 293 células T foram realizados utilizando PEI, a uma razão de 2,5 microgramas de PEI /micrograma de ADN. Todos os extractos celulares foram preparados seguindo a colheita de raspagem 293 T células utilizando tampão de lise de CHAPS (1% de detergente CHAPS, NaCl 150 mM, Tris 50 mM, pH 7, EDTA 5 mM). As concentrações de proteína foram determinadas usando o reagente de ensaio de proteína BCA da Thermo Scientific (Rockford, IL, EUA) Gato # 23225. 30 ug de proteína total foi utilizada para o procedimento de transferência de western padrão. detecção quimioluminescente foi realizada usando SuperSignal WestFemto da Thermo Scientific (Rockford, IL, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.

imunoprecipitações

200 ug de proteína foi incubado em 400 ul de tampão CHAPS totais e incubadas com 15 ul de matriz de afinidade indicada durante uma hora a 4 graus Celsius. Após a incubação, a matriz foi lavada três vezes em tampão e depois CHAPS SDS tampão de carga foi adicionado directamente à matriz lavada, cozidos, e carregou-se directamente nas cavidades de um gel de PAGE. Os tratamentos medicamentosos foram realizadas conforme descrito no texto usando 25 uM MG132.

Os anticorpos

Tubulin # B512, FLAG M2 agarose conjugada, FLAG poli-clonal # F7425 (Sigma, St. Louis, MO, EUA); matriz de afinidade HA HA e # 3F10 (Roche, Indianapolis, IN); A ubiquitina # 3933 (Cell Signaling Technologies, Beverly, MA, EUA); cat SKP1. # Ab10546 e gato COPS2 /TRIP15. # Ab4537 (Abcam, Cambridge, MA, EUA); COPS5 cat /JAB1. # Sc-9074 (biotecnologia Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EUA).

Imunoprecipitação e Identificação de proteínas por casal nano-Líquido cromatografia para Tandem Espectrometria de Massa (LC-MS /M)

10-150 mm placas de 293 células T foram transfectadas transientemente utilizando FuGENE6, de acordo com o protocolo do fabricante (Roche, Indianapolis, IN). 48 horas após a transfecção as células foram colhidas por raspagem no frio. CHAPS lisados ​​foram preparados e quantificada como descrito acima. 50 mg de lisado total de foram incubadas com a bandeira conjugado agarose (Sigma, St. Louis, MO, EUA) durante a noite a 4 graus com balanço suave. pérolas de agarose foram adicionados a uma coluna e lavou-se com 10 vezes o volume da coluna de fluxo por gravidade. Coluna foi tapado e um volume de leito de gota de péptido FLAG (dissolvida em PBS a uma concentração de 5 mg /mL e depois diluiu-se 1:10 em tampão CHAPS) foi adicionado à coluna e incubados durante 30 minutos a 4 graus. A tampa foi removida e -100 frações ul foram recolhidos como a eluição fluiu através pela gravidade. 50% de cada fracção (~ 5 fracções) foi western colocados a hibridar com anticorpo anti-FLAG. Tipicamente, a primeira fracção era desprovido da proteína alvo e qualquer fracção 2 ou 3 teve a maior parte da proteína alvo. ~ 40% da fracção que contém a maioria da proteína purificada FLAG-tag foi parcialmente resolvido utilizando SDS-poliacrilamida de electroforese em gel; as misturas foram concentradas em uma única 3 mm de largura “pilha”, por electroforese através de um SDS ‘empilhamento gel’ até entrar no ‘gel de separação “, seguido por breve coloração com Coomassie Blue e excisão da banda de proteína empilhados. preparação de amostras e espectrometria de massa foi realizada exatamente como descrito anteriormente [33].

andaime (Proteome Software Inc., Portland, OR), versão 3_6_1 foi usado para validar ainda mais e cross-tabular os baseada em MS MS /peptídicos e proteicos identificações. Proteína e peptídeo probabilidade foi fixado em 95%, com uma exigência mínima de peptídeo de um.

Resultados

Fbxw4 é um local comum de inserção proviral e é expressa variavelmente em tecidos murinos normais

a identificação e caracterização de novos genes e produtos de genes conduziu a uma quantidade enorme de dados e bases de dados publicamente disponíveis. Nós se perguntou se a mineração desses conjuntos de dados disponíveis poderia produzir observações de geração de hipóteses que cercam genes potencialmente interessantes. Uma tal base de dados é o “banco de dados de gene do cancro marcado retroviral ‘, que é um repositório de provirais locais de inserção de clones de vários investigadores em busca de novos genes que podem contribuir para leucemogênese (e, mais recentemente, estudos de mutagénese mediada por transposon em hematopoiéticas e tumores sólidos). locais comuns de integração proviral são loci que proporcionam uma vantagem selectiva às células por disregulating a expressão de genes celulares. Como suporte, a maioria dos locais mais comuns de inserção proviral são bona fide oncogenes ou supressores tumorais. Nós interrogado este banco de dados e descobriram que o locus do gene Fbxw4 foi o único locus do 30 loci de inserção mais vulgarmente identificado que não tenha sido sugerido para desempenhar um papel no cancro ou sido caracterizados bioquimicamente. Tem sido, até à data, 13 locais de inserção clonado a partir de dentro do gene codificado Fbxw4 e inserções foram clonadas em ambos orientação directa e inversa (Figura 1A). Estes dados podem sugerir que a inserção no locus proviral pode levar à perda da função Fbxw4.

. Exame de navegador genoma do UCSC (genome.ucsc.edu) e a base de dados Cancer Gene retroviral Tagged (https://variation.osu.edu/rtcgd/index.html) mostra que múltiplas inserções retrovirais têm sido clonados a partir de dentro do transcrito Fbxw4 lócus. As setas indicam a direção dos provirus inseridos. Os exons são indicados na parte inferior e a posição ea escala do cromossomo murino 19 é mostrado no topo. Nomes dados aos provirais inserções clonadas são indicados à esquerda. locais de inserção começando com ‘mmt’ foram clonados a partir de vírus de tumor mamário de rato carcinomas mamários induzidos. locais de inserção começando com ‘Dkm’, ‘248’ e ‘B5’ foram clonados a partir de leucemias de vírus da leucemia murina cancros hematopoiéticos acelerados. B. FBXW4 é variável de murino expresso em tecidos normais. Oligos específicos para Fbxw4 murino foram utilizados para realizar RT-PCR quantitativa sobre a «ratinho normal matriz ADNc TissueScan ‘. Os valores foram normalizados para a RT-PCR quantitativa para GAPDH. C. esquemático da proteína Fbxw4. Os números representam os aminoácidos da proteína. Domínios contidos Fbxw4 são indicados.

O fato de que Fbxw4 nunca foi caracterizado nos levou a examinar a expressão desse lócus em mais detalhes. Primeiro nós determinamos o que o padrão de mRNA Fbxw4 expressão é através de tecidos murinos normais. Utilizando ADNc preparado a partir de vários tecidos de rato foi observado um nível notável de expressão especificamente na glândula mamária involução (Figura 1B). Isto sugere a possibilidade que a expressão Fbxw4 é aumentada e pode contribuir durante um processo apoptótico.

Fbxw4 interage com os componentes de uma ubiquitina-ligase E3 e o COP 9 signalosome

Um algoritmo motivo de proteína que mostra o Fbxw4 proteína contém um domínio da caixa F, um motivo que é normalmente implicados em interacções com um complexo de ubiquitina ligase E3 e cinco WD-40 motivos, que são conhecidos módulos de interacção proteína-proteína (Figura 1C). Apesar do trabalho realizado genética no locus de Fbxw4, não tem havido estudos examinando a função bioquímica de Fbxw4. Como uma primeira tentativa de compreender a possível função de Fbxw4 realizamos imunoprecipitação em Fbxw4 marcado com FLAG seguido por espectrometria de massa para identificar, de forma imparcial, Fbxw4 interagindo proteínas (Figura 2A). Dois controles foram realizadas para ajudar na interpretação dos dados; imunoprecipitação de lisados ​​de células que expressam apenas o epitopo marcador FLAG (cont.) ou imunoprecipitação de lisados ​​de células que expressam uma caixa F marcado com FLAG “apenas” foram realizadas contendo proteína (Fbxo46). Os dados destas experiências mostraram que Fbxw4, e não controlar, componentes imuno de uma ubiquitina ligase E3 (SKP1 e CUL1) e os componentes do signalosome COP9, ao passo que tanto F-box contendo proteínas interagiram com SKP1. Curiosamente, um péptido que corresponde aos RBX1 também foi identificada no FLAG-imunoprecipitação de lisados ​​Fbxw4 expressando e não a partir dos lisados ​​outros (não mostrados)

. Tabela representando o número de péptidos únicos identificados a partir de experimento espectrometria de massa um representante seguintes imunoprecipitação FLAG a partir de lisados ​​de células de controlo que expressam FLAG apenas “contr.”, Ou células que expressam FLAG-Fbxw4 ou FLAG-Fbxo46. Coluna à esquerda indica o tamanho da proteína que interage, em quilo-Dalton (kDa). nomes dos genes das proteínas que contêm os péptidos identificados são mostrados na coluna da direita. Componentes de um complexo ubiquitina ligase E3 estão com fundo cinza claro; componentes do signalosome COP9 são sombreadas cinza escuro. B. validação dos dados de dados de espectrometria de massa por imunoprecipitação seguido de western blot. 293 T células foram transfectadas com plasmídeos contendo FLAG- Fbxw4, FLAG-Fbxo46 ou um vector vazio (v). 48 horas lisados ​​de células após a transfecção foram preparados e as imunoprecipitações foram realizadas com os anticorpos anti-Flag-mono clonal (M2) (para imunoprecipitar complexos Fbxw4- ou Fbxo46 interactuantes). Western blot foram realizados para detectar Fbxw4 ou Fbxo46 (rb FLAG anticorpo FLAG policlonal; painel superior), SKP1, COPS5 ou COPS2. C. Expressão de Fbxw4 altera a migração de SKP1 endógeno por meio de cromatografia de filtração em gel. 293 células T foram transfectadas com um vector vazio (painéis esquerdos) ou uma cplasmid contendo FLAG-Fbxw4 (painéis da direita). 48 horas lisados ​​de células após a transfecção foram preparados e separados numa coluna de filtração em gel superpose6. Western blot foram realizados em todos os outros fração de detectar Fbxw4 (painéis superiores) ou SKP1 (painéis inferiores). Na ausência de Fbxw4 SKP1 elui com um pico a fracção de 23, enquanto que quando é expressa Fbxw4 há co-eluição de Fbxw4 com picos a fracção 15 e no volume vazio. padrões de tamanho que eluem a partir de fracções indicadas são mostrados.

Para validar os dados da espectrometria de massa foi realizada imunoprecipita�es seguido por Western blot com anticorpos específicos para as proteínas identificadas. Foram preparadas novas lisados ​​que expressa quer FLAG-Fbxw4, FLAG-Fbxo46, ou somente o controle FLAG (Figura 2B). Os dados obtidos demonstram que tanto Fbxw4 e Fbxo46 interagir com SKP1, mas apenas Fbxw4 interage com componentes da signalosome COP9.

Para fortalecer ainda mais a constatação de que Fbxw4 pode interagir com SKP1 endógena foi realizada cromatografia de filtração em gel em lisados ​​de células transfectadas com um vecotor vazio ou um vector de expressão FLAG-Fbxw4 (Figura 2C). As fracções obtidas a partir da cromatografia foram ocidental colocados a hibridar com anticorpo anti-SKP1. As células que não expressam exógeno Fbxw4 conter SKP1 que elui numa fracção correspondente a menos de 67 kDa, enquanto que a expressão de Fbxw4 leva a co-eluição de SKP1 com Fbxw4 em dois novos complexos de mais de 200 kDa e um complexo que elui no vácuo . A migração alterada de SKP1 em duas novas frações que co-eluir com Fbxw4 apoia a encontrar o Fbxw4 interage com componentes de um complexo ligase E3.

Fbxw4 interage com SKP1 eo signalosome COP9 em uma forma dependente F-box

para começar a determinar a função bioquímica precisa da Fbxw4, queríamos saber quais interações dependia do domínio F-box. Para este fim, nós desenvolvemos um construto FBXW4 que não possui os primeiros 71 aminoácidos, denominado Fbxw4

-fbox (Figura 3A). Mais uma vez, imunoprecipitação seguida por espectrometria de massa foi realizada a partir de lisados ​​de células que expressam a FLAG-Fbxw4, FLAG- Fbxw4

-fbox, ou FLAG somente, para determinar o que proteínas interagem com as respectivas proteínas. Sem péptidos correspondentes a componentes da ligase ou componentes do signalosome COP9 ubiquitina E3 foram identificados com Fbxw4

-fbox, ao passo que estas proteínas foram encontradas mais uma vez para interagir com Fbxw4 (Figura 3B). Para validar os dados da espectrometria de massa foi realizada imunoprecipi seguido por Western blot com anticorpos específicos para as proteínas que interagem Fbxw4 identificados. Foram preparados lisados ​​que expressa quer FLAG-FBXW4, FLAG- Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46 ou FLAG único controle. Os dados mostram que Fbxw4 e Fbxo46, mas não Fbxw4

-fbox interagem com SKP1 (Figura 3C).

A. Esquemática do Fbxw4

proteína -fbox. Os números representam os aminoácidos da proteína. Domínios contidos Fbxw4

-fbox são indicados. B. Tabela representando o número de péptidos únicos identificados a partir de experimento espectrometria de massa um representante seguintes imunoprecipitação FLAG a partir de lisados ​​de células de controlo que expressam FLAG apenas “contr.”, Ou células que expressam FLAG- Fbxw4 ou FLAG- Fbxw4

-fbox. Coluna à esquerda indica o tamanho da proteína que interage, em quilo-Dalton (kDa). nomes dos genes das proteínas que contêm os péptidos identificados são mostrados na coluna da direita. Componentes de um complexo ubiquitina ligase E3 estão com fundo cinza claro; componentes do signalosome COP9 são sombreadas cinza escuro. C. validação dos dados de dados de espectrometria de massa por imunoprecipitação seguido de western blot. 293 T células foram transfectadas com plasmídeos contendo FLAG-Fbxw4, FLAG-Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46 ou um vector vazio (v). 48 horas lisados ​​de células após a transfecção foram preparados e as imunoprecipitações foram realizadas com os anticorpos anti-Flag-mono clonal (M2) (para imunoprecipitar Fbxw4-, Fbxw4

-fbox-, ou interagindo Fbxo46-complexos). Western blot foram realizados para detectar Fbxw4, Fbxw4

-fbox ou Fbxo46 (rb FLAG anticorpo FLAG policlonal; painel superior). ou SKP1

FBXW4 interage com proteínas celulares ubiquitinados

Temos demonstrado conclusivamente que Fbxw4 interage com um complexo ubiquitina ligase E3 eo signalosome COP9. Nós Fbxw4 postulou que interagem com proteínas ubqiuitinated dentro da célula. Sabe-se que, para muitos substratos de ubiquitina ligases E3, ubiquitinação da proteína substrato conduz a uma libertação rápida do complexo. Por conseguinte, a hipótese de que a inibição do proteassoma iria levar a uma acumulação dessas proteínas celulares ubiquitinadas pelo complexo ligase Fbxw4. Assim, a acumulação de proteínas ubiquitinadas iria, por sua vez, conduzir a um enriquecimento das interacções entre Fbxw4 e substratos ubiquitinados. As células foram transfectadas com um vector vazio (v), HA-ubiquitina, ou HA-ubiquitina e FLAG-Fbxw4. 36 horas após a transfecção as células foram tratadas com o inibidor de proteassoma, MG132, durante seis horas. Os extractos celulares foram preparados e imunoprecipitados com anticorpo anti-HA seguido por Western blot para Fbxw4 (Figura 4A, painel superior). Um aumento da quantidade de Fbxw4 foi encontrada para interagir com as proteínas a seguir ao tratamento ubiquitinadas MG132. Este Fbxw4 parecia ser o peso molecular normal, sugerindo um aumento da associação de proteínas com FBXW4 ubiquitinadas e não um aumento na Fbxw4 ubiquitated. Além disso, o aumento da quantidade de Fbxw4 que imunoprecipitadas com anti-HA antiobody não foi devido a um aumento na quantidade total de Fbxw4 uma vez que houve uma ligeira diminuição na quantidade total de Fbxw4 após o tratamento MG132 (Figura 4A, painel inferior). Como mais apoio a esta noção, houve um aumento nos níveis totais de proteínas ubiquitinadas e um aumento na quantidade de proteínas ubiquitinadas que imunoprecipitada com Fbxw4 após imunoprecipitação de Fbxw4 a partir dos mesmos lisados, após o tratamento MG132 (Figura 4A, os painéis do meio).

A. Fbxw4 pode ser imunoprecipitada por proteínas ubiquitinadas e Fbxw4 podem imunoprecipitar proteínas ubiquitinados. 293 T células foram transfectadas com vector vazio (v), HA-ubiquitina, ou HA-ubiquitina e FLAG-Fbxw4. 36 horas após a transfecção as células foram tratadas com MG132 (+) ou deixada sem tratamento (-) durante seis horas. Os lisados ​​celulares foram preparados e as imunoprecipitações foram realizadas tanto com anticorpos anti-HA (dois painéis superiores) ou anticorpos anti-Flag-mono clonal (M2) (parte inferior dois painéis). Western blot foram realizados em ambos os conjuntos de imunoprecipita�es com anticorpos anti-FLAG e anti-HA. B. FBXW4 associados com proteínas celulares que estão endogenamente ubiquitinadas. 293 T células foram transfectadas com plasmídeos contendo FLAG-Fbxw4, FLAG- Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46 ou um vector vazio (v). 36 horas após a transfecção as células foram tratadas com MG132 (+) ou deixada sem tratamento (-) durante seis horas. Os lisados ​​celulares foram preparados e as imunoprecipitações foram realizadas com os anticorpos anti-Flag-mono clonal (M2) (para imunoprecipitar Fbxw4-, Fbxw4

-fbox-, ou interagindo FBXO46-complexos). Western blot foram realizados para detectar Fbxw4, Fbxw4

-fbox ou Fbxo46 (rb FLAG anticorpo FLAG policlonal; painel superior). ou ubiquitina

Nós queríamos saber se resultados semelhantes seriam obtidos procura a ubiquitina endógeno, em oposição a sobre-expressa HA-ubiquitina. Além disso, queríamos determinar se os resultados observados anteriormente eram dependentes de um domínio F-box intacta. Para este fim, as células foram transfectadas com FLAG-Fbxw4, FLAG- Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46, ou a bandeira única de controle de vetores (v). As células foram tratadas com veículo ou MG132 durante seis horas e os lisados ​​celulares foram preparados. A imunoprecipitação com anticorpos anti-FLAG e foram realizadas transferências de Western foram realizados para detectar a ubiquitina endógena ou proteínas marcado com FLAG. Observou-se um aumento dramático na quantidade de ubiquitina que associado com Fbxw4. Este resultado não foi simplesmente devido à sobre-expressão de Fbxw4 uma vez que nem Fbxw4

-fbox ou Fbxo46, que foram expressas a níveis mais elevados, demonstraram uma maior interação com proteínas ubiquitinated seguintes inibição induzida por MG132 do proteassoma. Estes dados indicam que um domínio da caixa F intacto é necessária para a associação de proteínas com Fbxw4 ubiquitinadas e não todos os F-box contendo proteínas são capazes de tal aumento dramático interacções com proteínas celulares ubiquitinados seguintes inibição do proteassoma. Embora a interação entre Fbxw4 e proteínas ubiquitinados celulares é dependente de um no tato f-box de domínio mais trabalho é necessário para determinar se estas proteínas são substratos bona fide do complexo ubiquitina ligase SCFFbxw4 ou simplesmente proteínas que interagem com o complexo através de mecanismos alternativos.

FBXW4 é mutado, perdido e sub-expresso em cancros humanos

para começar a abordar a possibilidade de que FBXW4 é importante no câncer humano examinamos se o gene está mutado em cancros humanos. Consultando bancos de dados públicos disponíveis (o projeto Cancer Genome Atlas (TCGA) eo Catálogo de Somatic Mutações em Câncer (COSMIC) do Instituto Sanger) descobrimos que FBXW4 é somaticamente mutado em sete dos ~470 tumores que têm sido sequência, até agora (Figura 5A). Duas das mutações são silenciosas e não levam a alterações na sequência de aminoácidos da proteína, mas, curiosamente, as quatro mutações missense (R96, G106, R145 e R367) são evolutivamente conservada todo o caminho para algumas espécies de Drosophila. Na verdade, R96L, G106W e R367C foram previstos para perturbar a função da proteína com um significado muito alta (p = 0,0003) usando o algoritmo ProPhylER. Em adição a estas mutações prejudiciais preditos, um deslocamento do quadro de mutação, E245fs *, foi observada em um paciente de carcinoma da mama que levaria à produção de uma proteína FBXW4 que falta os últimos três motivos WD-40 (Figura 5A). A constatação de que mutações somáticas encontradas em cancros humanos estão previstas para perturbar aspectos críticos da função FBXW4 reforça a possibilidade de que FBXW4 regula processos homeostáticos importantes.

A. FBXW4 é somaticamente mutado em cancros humanos. O projeto Cancer Genome Atlas (TCGA) eo Catálogo de somáticas Mutações em Câncer (COSMIC) do Instituto Sanger foram consultados para mutações somáticas no FBXW4. ~470 De tumores que foram analisadas para a mutação no FBXW4, cinco mutações somáticas foram observadas em aminoácidos indicados no esquema. Curiosamente, os quatro aminoácidos individuais que são alvos de mutações (R96, G106, R145 e R367) são evolutivamente conservada em Drosophila. R96L, G106W e R367C estão previstas para perturbar a função da proteína (significância p = 0,0003, usando o algoritmo ProPhylER) e os E245fs * mutação produz uma proteína que não tem a última dois anos e meio WD-49 motivos. B. FBXW4 é frequentemente perdido em cancros humanos. A frequência da perda do número de cópias de DNA /exclusão através de 719 linhas de células cancerosas humanas representando diversos tecidos de origem a partir do Projeto Genoma do Câncer Sanger Institutos são apresentados juntamente com a frequência dos tipos de câncer individuais com n ≥ 5. C. FBXW4 é underexpressed no câncer linhagens de células com perda de número de cópias. Os diagramas de caixa que ilustram os níveis de expressão de mRNA para linhas de células com perda /exclusão e aqueles sem perda /eliminação para todas as linhas celulares de cancro do B. com perfis de expressão microarray correspondente gene são apresentados juntamente com expressão nos quatro tipos de câncer individuais com a maior frequência de perda /exclusão (pele, mama, sistema nervoso central (SNC) e cancro do pulmão). Os níveis de expressão foram comparados entre os dois grupos utilizando o teste-U de Mann-Whitney e um p 0,01 foi considerado significativo. Bigodes representam os percentis 10-90 com pontos exibindo os valores atípicos. D. FBXW4 está perdido e sub-expressos em tumores adenocarcinoma pulmonar clínicos de projeto TCGA.