Abstract

ósseas (BMPs) são altamente conservadas morphogens que são essenciais para o desenvolvimento normal. BMP-2 é altamente expressa na maioria dos carcinomas não-pequenas do pulmão (NSCLC), mas não em tecido pulmonar normal ou tumores benignos do pulmão. Os efeitos da cascata de sinalização de BMP sobre o crescimento e sobrevivência das células cancerosas é mal compreendida. Nós mostramos que a sinalização de BMP é basalmente activo em linhas celulares de cancro do pulmão, o qual pode ser eficazmente inibida com antagonistas selectivos de receptores do tipo I BMP. linhas celulares de cancro do pulmão expressar alk2, alk3 e alk6 e inibição de um único receptor de BMP não foi suficiente para diminuir a sinalização. A inibição de mais do que um receptor de tipo I foi requerida para diminuir a sinalização de BMP em linhas celulares de cancro do pulmão. antagonistas do receptor de BMP e silenciamento do tipo BMP receptores I com ARNsi morte celular induzida, o crescimento celular inibido, e causou uma redução significativa na expressão de inibidor de diferenciação (Id1, Id2, e ID3) membros da família, os quais são conhecidos para regular o crescimento de células e sobrevivência em muitos tipos de cânceres. antagonistas do receptor de BMP também diminuiu o crescimento de células clonogénicas. Knockdown de Id3 diminuiu significativamente o crescimento celular e morte celular induzida de células de câncer de pulmão. células H1299 que sobreexpressam estavelmente Id3 eram resistentes a supressão do crescimento e indução da morte celular induzida pelo antagonista de BMP DMH2. Estes estudos sugerem que a sinalização BMP promove o crescimento celular e sobrevivência das células de câncer de pulmão, que é mediada através da sua regulamentação dos membros da família Id. Os antagonistas selectivos do tipo BMP receptores I representa um potencial significa tratar farmacologicamente NSCLC e outros carcinomas com uma cascata de sinalização BMP activado

Citation:. Langenfeld E, Hong CC, Lanke G, Langenfeld J (2013) morfogenética óssea Tipo proteína I Antagonistas dos Receptores diminuir o crescimento e induzir a morte celular de linhas celulares de cancro do pulmão. PLoS ONE 8 (4): e61256. doi: 10.1371 /journal.pone.0061256

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 27 Janeiro, 2012; Aceito: 11 de março de 2013; Publicação: 12 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Langenfeld et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores têm o seguinte interesse. As pequenas moléculas utilizadas na experiência representam potenciais fármacos para tratar pacientes com cancro. Um pedido de patente previsionary foi apresentado sobre o uso potencial dessas moléculas no câncer. Não existem outras patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

O Proteínas Ósseas Morfogenéticas (BMPs) são membros da superfamília do factor de crescimento transformante (TGF). BMPs são phytogenetically proteínas conservadas necessários para o desenvolvimento embrionário de insetos a humanos. Aproximadamente 20 BMP ligandos foram identificados e classificados em várias subclasses. BMP-2 e BMP-4 partes de 92% de homologia e têm actividade biológica intercambiáveis. BMPs são proteínas que sinalizam através de serina transmembranar secretada /treonina quinases chamadas tipo I e tipo II receptores [1]. O tipo I são receptores Alk1, Alk2 (ActR-1), alk3 (BMPR-IA), e alk6 (BMPR-IB) [1]. Os receptores do tipo II são BMPR-II e tipo activina II receptores ActR-II e ACR-IIB [1]. receptores de BMP são promíscuos, e pode ser activado por vários ligandos BMP [1], [2]. Cada ligando BMP é também capaz de activar diferentes receptores [1], [2]. A ligação da BMP ligandos para o receptor de tipo I conduz a fosforilação pelo receptor constitutivamente activa do tipo II. O complexo receptor fosforila Smad-1/5, que então activa a transcrição de genes alvo a jusante [3].

Durante o desenvolvimento embrionário, BMPs decisões regula o destino celular, sobrevivência celular, e vasculogénese [4], [5 ], [6], [7], também processos que são comuns na carcinogénese. Na verdade, a BMP-2 é sobre-expresso em 98% de NSCLC e outros carcinomas [8], [9]. expressão de BMP inversamente correlacionada com a sobrevivência [10] e alta expressão está associada com a propagação metastática [11], [12]. BMP-2 aumenta a angiogénese de tumores [13], [14], [15] e estimula a invasão tumoral [8]. A expressão ectópica de BMP-2 em células de cancro do pulmão A549 grandemente aumentada crescimento metastático num modelo murino de cancro do pulmão após injecção na veia da cauda [16]. Estudos utilizando proteínas BMP recombinante ou knockdown de um único receptor de BMP têm sugerido que a BMP sinalização em células de cancro não promove o crescimento celular e pode mesmo actuar como um supressor de tumor (16-19). não foi examinado o efeito de inibição múltiplos receptores de BMP sobre o crescimento e sobrevivência celular em células cancerosas. Por conseguinte, a importância biológica de uma cascata de sinalização de BMP basalmente activo em células de cancro não é conhecido.

Durante o desenvolvimento dos inibidores de ligação de ADN /diferenciação (Id) são mediadores directos de sinalização de BMP. Existem 4 membros da família de identificação (ID 1, ID2, ID3, e ID4). elementos de resposta BMP (BRE) sobre os promotores Id1, ID2 e ID3 são ativados por Smad 1/5/8 (20-23). As proteínas Id inibir compromisso linhagem pela ligação e sequestrando fatores básicos HLH transcrição [17]. membros da família Id têm sido implicados na transformação oncogénica em vários tipos de cancros [18] [19], [20]. ID1 foi reportado para regular a invasão, proliferação, sobrevivência, e a disseminação metastática de células cancerosas [18], [21], [22]. membros da família Id são frequentemente expressas em carcinomas de pulmão não pequenas células [23], [24] e sobre-expressão está associada a uma menor sobrevida livre de doença [25]. Estes estudos sugerem que a segmentação vias de sinalização que regulam a expressão de membros da família Id pode ter importantes implicações terapêuticas. Embora as proteínas recombinantes BMP2 induzir um aumento transitório na expressão de Id1 em células do cancro do pulmão [8], o papel da cascata de sinalização de BMP na regulação dos níveis basais de expressão dos membros da família Id em células cancerosas não tem sido elucidado.

O objectivo deste estudo foi o de determinar em linhas celulares de cancro do pulmão, que não foram estimuladas com uma proteína BMP recombinante, se as células têm uma sinalização de BMP basalmente activo e determinar o seu efeito sobre o crescimento celular, sobrevivência, e a expressão de Id membros da família. Selective BMP tipo I e os antagonistas dos receptores de siRNA alvejando o tipo BMP I receptores revela que a BMP basalmente activa a sinalização em linhas celulares de cancro do pulmão é a promoção do crescimento e um importante regulador da expressão de membros da família Id. sinalização de BMP é mediada através de mais do que um receptor de tipo I de BMP. DMH2 causou a maior inibição da sinalização BMP e induziu a maior redução do crescimento celular e expressão de membros da família Id.

Resultados

BMP Tipo I Antagonistas dos Receptores Diminuir Smad 1/5/8 sinalização

Usando um repórter luciferase BMP-responsive (BRE-Luc), foram examinados os efeitos dos diferentes antagonistas dos receptores tipo BMP sobre Smad 1/5/8 actividade em células H1299. Dorsomorphin, DMH1, DMH2, e LDN todos causaram uma diminuição significativa na expressão do repórter BRE-Luc em células H1299, indicando uma diminuição na actividade de Smad 1/5/8 (Figura 1A). A análise de imunotransferência revelou que tipo BMP seletiva I Antagonistas dos Receptores diminuir a fosforilação de Smad 1/5/8 em H1299 e células A549 (Figura 1B e figura S1). Fosforilação de Smad 1/5/8 foi diminuída dentro de 24 horas de tratamento e persistiu durante pelo menos 48 horas depois.

H1299 células (A) foram transfectadas com o repórter BRE-luciferace. Após 48 horas as células foram tratadas com DMSO, 10 uM Dorsomorphin, ou 1 uM DMH1, 1 uM DMH2, ou 1 uM durante 48 horas LDN. atividade BRE-luciferace é relatado como a percentagem das células tratadas controle DMSO. Os dados representam a média de 3 experiências em triplicado. A média das células de controlo foi comparada com a média das células tratadas. * P 0,05. (B) a análise Immunoblot para fosforilados Smad 1/5/8 de H1299 células tratadas com 1 mM DMSO, DMH1 ou DMH2 para 12, 24 e 48 horas.

BMP Tipo I Antagonistas dos Receptores Diminuir expressão da família ID membros

RT-PCR quantitativa foi usada para determinar se a cascata de sinalização de BMP regula a expressão de membros da família Id em linhas celulares de cancro do pulmão. Dorsomorphin, DMH1 e DMH2 diminuiu significativamente a expressão Id1, Id2, e ID3 em A549 e linhas de células H1299 (Figura 2A-B). Os antagonistas de BMP causado uma redução maior dos membros da família Id nas células H1299 comparação com células A549. Por análise de Western blot, Dorsomorphin, DMH1, DMH2 e LDN causou uma diminuição nos níveis de proteína de Id1 e ID3 em A549 e células H1299 (Figura 2C-D e figura S2). Os antagonistas de BMP diminuiu a expressão de membros da família ID dentro de 12 a 24 horas que persistiram durante pelo menos 48 horas. DMH1 e DMH2 causou uma maior redução da ID1 H1299 células em comparação com células A549. DMH2 consistentemente causado uma maior redução da expressão da proteína Id1 que DMH1.

(A-B) RT-PCR quantitativo para Id1, Id2, e ID3 em (A) A549 e (B) H1299 células tratadas com DMSO, 10 uM Dorsomorphin, 1 uM DMH1, ou 1 uM durante 48 horas DMH2. Os dados representam a média de pelo menos 3 experiências realizadas em duplicado e apresentados como a percentagem de células de controlo tratadas. A média das células de controlo foi comparada com a média das células tratadas. * P 0,05. (C-D) A análise de Western blot para Id1 e ID3 em (C) e A549 H1299 células tratadas com DMSO 1 uM ou 1 uM de tipo BMP selectivo antagonista do receptor I de 12, 24, e 48 horas (D). Estes estudos foram realizados pelo menos 3 vezes.

Multiple BMP Tipo I receptores medeiam a sinalização

Em seguida, avaliou-se um receptor específico do tipo I BMP medeia a sinalização BMP basally ativa no câncer de pulmão linhas de celular. Por RT-PCR quantitativo, foi examinada a expressão de BMP receptores do tipo I. Alq1 não foi expressa em células quer H1299 (Figura 3A) ou A549. Como esperado, alq1 foi expresso em células endoteliais humanas (dados não apresentados). ARNm alq2, alk3, e alk6 são expressos em A549 e linhas de células H1299 (Figura 3A). Usando siRNA, a expressão de cada receptor de tipo I foi reduzida em aproximadamente 40% ou superior (figura 3B). Para testar a especificidade de ARNsi, knockdown de cada receptor de tipo I e foi realizada RT-PCR realizada para alq2, alk3, e alk6. Knockdown de alq2 causou um aumento significativo na expressão de alk6 (Figura 3C). Knockdown de alk3 e alk6 causou uma ligeira diminuição na expressão de outros receptores de tipo I (Figura 3C). RT-PCR quantitativa mostrou que o silenciamento de alq2 ou alk3 nas células H1299 causou um decréscimo aproximadamente de 20-25% da expressão de ARNm Id1 (figura 3D), enquanto que o silenciamento de alk6 tendeu a causar um aumento na expressão Id1. Silenciando tanto alk2 e alk3 causou uma redução significativamente maior na expressão Id1 de knockdown de qualquer receptor sozinho (figura 3D). A análise Western blot mostrou que knockdown de um único receptor de tipo IA sozinho não diminuir a expressão Id1 (Figura 3E). O silenciamento de ambos alq2 e alk3 ou silenciamento de alq2, alk3, e alk6 causou uma diminuição na expressão da proteína Id1 (Figura 3E). RT-PCR quantitativa demonstrou que knockdown de múltiplos receptores levou uma redução em todos os receptores de BMP tipo, que foi maior do que a observada para receptores individuais knockdowns (figura 3F).

(A) RT-PCR quantitativo da A549 e H1299 células que apresentam expressão de alq2, alk3, e alk6 mas não alq1 (n = 3). (B) As células H1299 foram transfectadas com ARNsi de segmentação cada tipo I receptor de BMP e quantitativa de RT-PCR foi realizada para esse receptor de BMP. (C) Queda de cada tipo BMP eu receptor nas células H1299 e foi realizada RT-PCR quantitativa realizada para todos os 3 receptores do tipo I. (B-C) Os dados representam a média de 2 experiências efectuadas em duplicado. (D) knockdown no células H1299 de um único tipo BMP eu receptor ou ambos alq2 e alk3. Após 48 horas, a expressão da Id1 foi examinado por RT-PCR quantitativo. Os dados representam a média de 3 experiências realizadas em duplicado. (E) Análise de Western blot para ID1 células H1299 com o knockdown de um único receptor de tipo I ou BMP knockdown combinação de alq2 e alk3, ou todos os três receptores tipo I BMP. Os estudos foram feito, pelo menos, 2 vezes. Estudos mostram silenciamento mais do que um receptor é necessário para diminuir a expressão Id1. (F) RT-PCR quantitativa do tipo I BMP receptores de knockdown após alq2 e alk3, ou todos os três receptores tipo I BMP. Estudos realizados 3 vezes em duplicado apresentados como percentagem de controlo. (L) H1299 células foram co-transfectadas com o vector sem inserção, alk3 constitutivamente activa vectores de expressão (Ca-alk6) (CA-alk3), ou alk6 constitutivamente activa e o repórter BRE-luciferase. As células foram então tratadas com DMSO a 1 uM ou antagonista do receptor de BMP 1 uM durante 24 horas e a actividade luciferace medido. Os dados demonstram a média de pelo menos 3 experiências independentes como sua percentagem de controlo.

Um segundo conjunto de siRNA segmentação cada receptor BMP tipo I foi utilizado para avaliar ainda mais a sinalização BMP. Estes siARN também causou uma redução significativa da expressão do receptor alvo na A549 e células H1299 (figura S3). Examinando a especificidade destes siRNA também demonstrado que knockdown de um único receptor causou alguma regulação negativa do outro tipo de receptores que BMP (figura S3). Estes dados sugerem que não há regulação cruzada entre o tipo diferente I BMP receptores. Mais uma vez, knockdown de um único tipo I receptor de BMP não foi suficiente para diminuir a expressão ID1, quer a A549 e as células H1299 (figura S3). Para examinar melhor a sinalização do receptor BMP, cada receptor foi silenciado e 1/5/8 atividade Smad determinada utilizando o ensaio BRE-luciferase. Silenciamento apenas um receptor de BMP tipo I não causou uma diminuição na Smad-1 /8/5 actividade (figura S3). Por qRT-PCR, knockdown de todos os três receptores do tipo I BMP nas células A549 causou uma redução significativa na expressão de Id1 (figura S3). O knockdown de todo tipo I BMP receptores (alq2, alk3, e alk6) foi confirmada por qRT-PCR (figura S3). A análise de transferência de Western mostrou novamente que knockdown de um único receptor nas células H1299 não foi suficiente para reduzir a expressão de Id1 (figura S3). Consistente com nosso outro conjunto de siRNA, knockdown de alk2 + alk3 ou alk2, alk3 e alk6 causou uma redução na expressão da proteína de Id1 (figura S3). Estes dados sustentam que a sinalização de BMP é mediada através de mais do que um tipo I receptor de BMP em linhas celulares de cancro de pulmão.

na linha celular de mioblastos C2C12 de rato, DMH1 inibida alq2 e actividade alk3 mas foi relatado como tendo efeitos inibidores negligenciáveis alk6 em [26]. DMH2 é conhecido por inibir alq2 e LDN inibe eficazmente alq2, alk3, e alk6 [26]. Para testar a selectividade do receptor de DMH1, DMH2, e LDN em células de cancro de pulmão, alk3 constitutivamente activo (CA-alk3) ou alk6 (CA-alk6) foi co-transfectado com o repórter BRE-luciferace em células H1299 (figura 3G). DMH2 causou uma maior redução da atividade alk3 que DMH1 e LDN nas células H1299. Os antagonistas de BMP causado alguma inibição de alk6 mas menos do que a observada para alk3 (figura 3G).

A inibição de Receptores de Tipo I BMP Diminui o Crescimento celular

Em seguida, os efeitos do bloqueio de BMP tipo I receptores sobre o crescimento celular foi examinado através da realização de contagens de células. BMP tipo I Antagonistas do Receptor causou uma redução significativa no número de células após 7 dias em ambas as linhas de células A549 e H1299 (Figura 4A). Os antagonistas selectivos do receptor de BMP causou uma redução maior no crescimento de células em que as células H1299 em comparação com células A549. DMH2 causou, significativamente mais do que a inibição do crescimento DMH1 em ambas as linhas celulares (Figura 4A). Para remover ligandos potenciais BMP no meio de cultura celular, as células H1299 foram cultivadas em meio livre de soro e tratadas com DMH2. DMH2 também causou uma inibição significativa do crescimento de células H1299 de células cultivadas em meio isento de soro (SFM) (figura 4B), o que sugere que a BMP Maio de sinalização ocorre de uma maneira auto-autónomo. A proliferação foi analisada por determinação da incorporação de bromodesoxiuridina (BrdU). DMH2 causou uma diminuição dependente da dose na proliferação das células H1299 em 24 horas (Figura 4C) e um efeito mais profundo foi observada às 48 horas (Figura 4C). Knockdown de todos os 3 receptores do tipo I (BMP alq2, alk3, e alk6) nas células H1299 também causou uma redução significativa na incorporação de BrdU (Figura 4D). Knockdown de alq2, alk3, e alk6 utilizando o segundo conjunto de siRNA também causou uma redução significativa da proliferação das células H1299 (figura S3). RT-PCR quantitativa mostrou que com este segundo conjunto de siRNA dirigido a todos os I receptores de BMP 3 Digite as células H1299 causada downregulation de alk2 e alk6 mas não alk3 (figura S3). Isto sugere que a inibição de alq2 e alk6 é suficiente para diminuir a sinalização de BMP em células H1299.

(A) e A549 H1299 células cultivadas em DMEM 5% FCS foram tratadas com DMSO, 10 uM Dorsomorphin, 1 uM DMH1, 1 uM DMH2, ou 1 uM LDN durante 7 dias e as contagens de células realizadas. (B) H1299 células cultivadas em SFM foram tratadas com DMSO a 1 uM ou 1 uM DMH2 durante 7 dias e contagem das células realizada. incorporação (C) BrdU de células H1299 tratadas com DMSO ou 1 uM ou 5 uM DMH2 durante 24 e 48 horas. incorporação (D) BrdU de H1299 células transfectadas com siRNA alvo de todo o tipo I receptores de BMP ou controle de siRNA. (C-D) de dados é a média de 3 experiências em triplicado, relatados como a percentagem de células de controlo tratadas. (E-G) O crescimento de colônias de A549 e H1299 células tratadas com DMSO 1? M ou 1? M de antagonista selectivo do receptor de BMP. (E) A fotografia de uma experiência representativa. (F-G) Os dados mostram a média de pelo menos 3 experiências independentes relatados como a percentagem do controlo. (G) DMH1 diminui ancoragem crescimento independente de linhas de células de câncer de pulmão. A549 e células H1299 em agar mole foram tratados com DMS0 1 uM ou 1 uM DMH1 durante 2 semanas e o número de colónias contadas. Os dados apresentados são a média de 3 experiências independentes relatados como a percentagem do controlo.

BMP receptoras do tipo I Antagonistas diminuir o crescimento clonogénico

O efeito de antagonistas de receptores de BMP no crescimento de células clonogénicas foi examinada. DMH1, DMH2, e todos LDN causou uma redução significativa do crescimento clonogénico tanto na A549 e linhas de células H1299 (Figura 4E-G). crescimento clonogênica foi inibida mais por DMH2 e LDN do que DMH1 (figura 4E-G). Para avaliar ainda mais os efeitos sobre o crescimento de DMH1 clonogénicas, examinou-se o crescimento independente de ancoragem. DMH1 reduziu significativamente o crescimento independente de ancoragem em ambas as células H1299 (figura 4H) A549 e. Estes dados mostram que a sinalização de BMP basalmente activa estimula a proliferação e aumenta o crescimento clonogénico de células de cancro do pulmão.

A inibição da BMP Tipo I receptores origina morte celular

O efeito de BMP de sinalização sobre a sobrevivência celular foi examinada . A morte celular foi quantificado utilizando um ensaio de absorção de brometo de etídio. O brometo de etídio é apenas absorvido pelas células que perderam a integridade da membrana, o que ocorre quando as células estão a morrer por necrose ou apoptose [27]. BMH2 induzida morte celular nas células H1299 no prazo de 12 horas, e 48 horas por todos os antagonistas causou um aumento significativo na percentagem de células mortas (Figura 5A). Dentro de 48 horas, Dorsomorphin, DMH1, e DMH2 causou um aumento significativo na morte celular nas células A549 (Figura 5B). Para avaliar ainda mais a morte celular, as células H1299 cultivadas em DMEM 5% FCS foram tratadas com DMH2 durante 4 dias e a percentagem de células mortas determinada por coloração com Azul de Tripano. DMH2 causou um aumento significativo na morte de células, que era dependente da dose (Figura 5C). A percentagem de células mortas foi ainda mais elevada em células H1299 cultivadas em SFM (Figura 5D). Um corante fluorescente reactivo com amina foi usada para detectar a morte celular, que também mostrou que DMH2 induzida morte celular nas células H1299 (Figura 5E). Para comprovar que os antagonistas de BMP induzir a morte celular por inibição da BMP sinalização, knockdown tripla de alk2, alk3 e receptores alk6 foi realizada. Knockdown de alq2, alk3, e receptores alk6 causou um aumento significativo na percentagem de células mortas em comparação com células de controlo tratadas siRNA (Figura 5F). Um segundo conjunto de siRNA alvejando alq2, alk3, e alk6 também provocou um aumento significativo na percentagem de células mortas (Figura S3). Estes estudos mostram que antagonizar a actividade de receptores do tipo BMP I induz a morte celular em células do cancro do pulmão.

(A-B) e A549 H1299 cultivadas em DMEM 5% FCS foram tratadas com DMSO ou um antagonista do receptor de BMP (10 uM ou 1 uM Dorsomorphin de antagonista selectivo). Determinou-se então a percentagem de células que ocupam brometo de etídio. Os dados são apresentados como a média de pelo menos 3 experiências independentes. (C) H1299 células cultivadas em DMEM 5% FCS foram tratadas com DMSO, 1 uM e μ5 M de DMH2 durante 7 dias, coradas com azul Typan, e as contagens de células realizadas. Os dados representam a média de 4 experiências relatadas como as células mortas por cento. (D) H1299 células cultivadas em SFM foram tratadas com DMSO ou 1 uM de DMH2 durante 7 dias, coradas com azul Typan, e as contagens de células realizadas. Os dados representam a média de 5 experiências relatadas como células mortas por cento. (E) A morte celular foi determinada utilizando citometria de fluxo detectar a absorção de um corante fluorescente reactivo com amina em células H1299 tratadas com DMS0 ou DMH2 durante 4 dias. Os dados representam a média de 3 experiências independentes. células (F) O H1299 foram transfectadas com siRNA controle e siRNA alk2 segmentação, alk3 e alk6. Após 2 dias foi determinada a percentagem de células coradas por brometo de etídio. Os dados são relatados como a média de 6 experiências independentes.

BMP sinalização é regulada em um auto-autônoma Manner

A indução de morte celular e supressão do crescimento induzida por antagonistas do receptor de BMP de câncer de pulmão linhas celulares que crescem em SFM sugeriu que a sinalização BMP ocorre de uma maneira auto-autónomo. Estudos anteriores demonstraram que as linhas celulares de cancro de pulmão produzem a proteína BMP-2 madura, que é a forma activa [8]. Para assegurar que as células de cancro do pulmão segregar BMP-2, uma ELISA do meio de cultura de células foi realizada. proteína BMP-2 não foi detectada em DMEM com 5% de vitelo fetal (FCS) ou em meio isento de soro (SFM) (Figura 6A). BMP2 foi detectada no meio em que as linhas celulares de cancro de pulmão foram cultivadas em qualquer SFM ou DMEM com 5% de FCS (Figura 6A). Uma vez que outras BMPs poderia estar em FCS, os efeitos dos antagonistas do receptor de BMP na regulação da sinalização de BMP foi examinada em SFM. Fosforilada Smad 1/5 e expressão Id1 H1299 foi detectada em células cultivadas em meio isento de soro (figura 6B). BMP tipo I Antagonistas do Receptor diminuiu pSmad 1/5 e Id1 expressão de células H1299 cultivadas em SFM (figura 6B).

(A) Um BMP2 ELISA foi realizado em DMEM a 5% de FCS e SFM, na ausência de células (médio). Um BMP2 ELISA foi realizado em DMEM a 5% de FCS e meio de cultura celular contendo SFM A549 e células H1299 durante 48 horas. Experiências representam a média de pelo menos 5 experiências realizadas em triplicado. antagonistas (B) BMP diminuir BMP sinalização de células de câncer de pulmão cultivadas em SFM. células H1299 cultivadas em SFM foram tratadas com 1 uM de DMSO, 1 uM de DMH2 ou 1 uM de LDN durante 48 horas e análise por Western blot realizado. (C) RT-PCR quantitativo para a expressão de BMP-2 após 48 horas de transfecção de células H1299 com ARNsi de controlo ou ARNsi segmentação BMP2. Os dados representam a percentagem de controlo da média de 4 experiências independentes. (D) Análise de transferência de Western de células H1299 em SFM 48 horas depois de terem sido transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi segmentação BMP2. BMP2 knockdown provoca um decréscimo na expressão de pSmad 1/5 e Id1. (E) Queda de BMP-2 induz a morte celular. células H1299 em SFM foram transfectadas com ARNsi de controlo ou siRNA segmentação BMP2. Após 48 horas a percentagem de células mortas foi determinada por coloração com brometo de etídio. Os dados representam a média de 4 experiências independentes realizadas em triplicado.

Para examinar melhor sinalização de auto-autônoma da cascata de sinalização BMP, expressão BMP2 foi derrubado usando siRNA. RT-PCR quantitativa mostrou que o siRNA alvejando BMP2 causou uma redução maior que 60% na expressão de BMP-2 (Figura 6C). Knockdown de BMP2 H1299 de células de cultura em SFM causou uma diminuição na expressão da proteína fosforilada de Smad 1/5 e Id1 (figura 6D). BMP2 knockdown causou um aumento significativo na percentagem de células mortas de cancro do pulmão de crescimento em SFM (Figura 6E). Estes estudos sugerem que a atividade BMP basal de linhas de células de câncer de pulmão é estimulado de forma auto-autónomo, que pode ser inibida por antagonizar o tipo BMP receptores I.

Knockdown de Id1 e ID3 Diminui o crescimento celular e induz celular morte

Em seguida, examinamos se Id1 e /ou Id3 regula a sobrevivência da célula e crescimento de células de câncer de pulmão. Knockdown de Id1 utilizando siRNA causou uma redução no nível da proteína de Id1 mas não Id3 (figura 7A). Knockdown de Id3 provocou uma redução dos níveis de proteína ID3 sem afectar a expressão de Id1 (figura 7A). RT-PCR quantitativa, também mostraram uma redução na Id1 e ID3, respectivamente (Figura 7B). Knockdown de Id1 ou ID3 em células H1299 causou um aumento significativo na percentagem de células mortas, como determinado por coloração com brometo de etídio (Figura 7C). As contagens de células usando coloração com Trypan Blue demonstrou que knockdown de Id1 diminuição do crescimento celular e a morte celular induzida, mas não alcançaram significância estatística (figura 7D, F). Knockdown de Id3 causou uma morte altamente significativa no crescimento celular e a indução de morte celular quando comparado com os controlos (Figura 7D, F). Estes estudos sugerem que a redução da expressão Id é, pelo menos em parte, o mecanismo pelo qual os antagonistas do receptor de BMP induzem a morte celular e decréscimo do crescimento de células. Em H1299 células, Id3 pode ter um papel mais importante na regulação da sinalização BMP que Id1.

(A) Análise de Western blot para Id1 e ID3 48 horas após H1299 células foram transfectadas com ARNsi de controlo e siRNA segmentação Id1 ou ID3. (B) RT-PCR quantitativo para Id1 e ID3 após H1299 células foram transfectadas com ARNsi de controlo e ARNsi segmentação Id1 ou ID3. Os dados representam a percentagem de controlo da média de 2 experiências. (C) H1299 células foram transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi segmentação Id1 ou ID3. Após 48 horas determinou-se a percentagem de células coradas por brometo de etídio. Os dados são apresentados como a média de 4 experiências independentes. células (D-F) H1299 foram transfectadas com ARNsi de controlo e ARNsi segmentação Id1 ou ID3. Após 7 dias as células foram coradas com Azul de Tripano e foi determinado o número de células vivas e mortas. Os dados representam a percentagem de alteração a partir de ARNsi de controlo de (D) vivo ou células mortas (F). (E) Representa a percentagem de células que foram mortos. Os dados representam a média de 4 experiências independentes.

Células superexpressão Id3 são resistentes a DMH2

Para definir ainda mais se Id1 e ID3 medeiam a sinalização BMP, ID 1 e ID3 vetores de expressão foram estavelmente transfectado para células H1299. A expressão forçada de Id1 causou um aumento na expressão da proteína de Id1 mas não Id3 (figura 8A). A expressão forçada de Id3 causou uma expressão aumento de Id3 mas não Id1 (figura 8B). Houve um pequeno aumento na expressão de actina nas células H1299 /ID3. Desde actina poderia ser-se regulamentada pelo Id3 superexpressão, foi examinada a expressão de GAPDH. Através de análise de transferência de Western demonstrou que a expressão de GAPDH foi o mesmo entre as células de controlo do vector e as células H1299 /ID3. DMH2 causou uma redução semelhante no crescimento celular das células H1299 /Id1, em comparação com as células de controlo do vector (figura 8c). DMH2 não causou inibição do crescimento (Figura 8C) ou induzir a morte celular (Figura 8D) das células H1299 /ID3. Estes dados suportam ainda que os efeitos biológicos mediados pelos antagonistas do receptor de BMP envolve proteínas Id.

H1299 células foram transfectadas de forma estável com Id1 ID3 e vectores de expressão ou o vector sem inserção. (A-B) A análise de Western blot que mostra o aumento da expressão de (A) Id1 ou (B) Id3 na linha celular transfectada. (C-D) /H1299 H1299 células ID 1 e /ID3 foram tratadas com 1 uM de DMSO ou 1 uM DMH2 durante 7 dias e a percentagem de células mortas e vivas determinados. (C) DMH2 causou supressão do crescimento de células H1299 /Id1 controle do vetor e, mas não as células H1299 /ID3. morte (D) DMH2 celular induzida nas células de controlo do vector (H /con), mas não nas células H1299 /ID3 (H /Id3). Os dados representam a média de pelo menos 3 experiências relatados como a percentagem de células de controlo tratadas. (E) DMH2 deceases crescimento celular de células imortalizadas humanas normais epiteliais brônquicas (HBEC), mas não as células endoteliais da aorta humana (HAEC). As linhas celulares que crescem em SFM foram tratadas com DMSO 1 uM ou 1 uM DMH2 durante 7 dias e de célula contagens realizadas. Os dados representam a média de pelo menos 3 experiências relatados como a percentagem de células de controlo tratadas. (F) a análise Western blot mostrando maior expressão de pSmad 1/5 e ID1 HBEC comparação com HAEC. 1 M de DMH2 por 48 horas diminuição da expressão de pSmad 1/5 e ID1 em HBEC mas não HAEC.

DMH2 suprime o crescimento de células normais epiteliais brônquicas, mas não células endoteliais

A BMP2 cascata de sinalização é essencial para o desenvolvimento precoce de pulmão com elevada expressão em células epiteliais e vasculares progenitoras [28]. Na conclusão de quedas de sinalização morfogénese pulmonar BMP com expressão dificilmente detectável no tecido pulmonar normal adulto [9], [28], [29]. sinalização de BMP é re-activada em células epiteliais brônquicas normais de adultos por inflamação e lesão dos tecidos [28], [29]. Para definir ainda mais a especificidade dos antagonistas do receptor de BMP, examinamos se as células normais humanas epiteliais brônquicas (HBEC) imortalizadas sem oncoproteínas virais [30] e células aórticas humanas normais endoteliais (AHCE) são sensíveis a DMH2. Como esperado DMH2 causou uma redução significativa no crescimento de células H1299 (57%) e uma redução semelhante na HBEC (42%) (Figura 8E). DMH2 causou apenas uma redução de 15% no crescimento celular de HAEC (figura 8E). HBEC tinha um nível mais elevado de expressão de pSmad 1/5 e Id1 de HAEC (Figura 8F). DMH2 causou uma redução na expressão de pSmad 1/5 e ID1 HBEC, mas não no HAEC. antagonistas de BMP também diminuiu expressão Id1 e inibição do crescimento induzida das células brônquicas humanas normais epiteliais imortalizadas com T grande de SV40 do gene do antigénio (células BEAS-2B) [31] (figura S4 e os dados não mostram).