Abstract

A hipóxia desempenha um papel importante na resistência das células tumorais à quimioterapia. No entanto, os mecanismos exactos subjacentes ao presente processo não são bem compreendidos. Além disso, de acordo com as linhas de células, hipoxia diferente influencia a morte celular. O estudo dos efeitos de hipoxia na apoptose induzida por fármacos quimioterapêuticos 5 em 7 tipos de células cancerosas mostrou que a hipoxia geralmente inibiu a apoptose induzida por drogas. Na maioria dos casos, o efeito de hipoxia foi o mesmo para todas as drogas em um tipo de célula. O perfil de 93 genes envolvidos na apoptose, bem como o nível de proteína das proteínas da família Bcl-2 de expressão foram então investigados. Em células HepG2 que estão fortemente protegidas contra a morte celular por hipoxia, a hipoxia reduziu a abundância de quase todos os pró-apoptóticos proteínas da família Bcl-2, enquanto nenhum deles estão diminuídos em células A549 que não estão protegidas contra a morte celular por hipoxia. Em células HepG2, hipóxia diminuiu Noxa e abundância BAD e modificou a mobilidade eletroforética de BIM

EL. BIM e noxa são importantes mediadores da morte celular induzida por etoposido em células HepG2 e a alteração induzida por hipoxia destas proteínas de abundância ou modificações pós-traducionais, em parte, são responsáveis ​​por quimioresistência. Finalmente, a modulação da abundância e /ou das modificações pós-traducionais da maioria das proteínas da família Bcl-2 por hipoxia envolve dependentes de p53 e independentes de vias e é dependente do tipo de célula. Uma melhor compreensão destas variações célula-célula é crucial, a fim de superar a resistência induzida por hipoxia e para melhorar a terapia do cancro

Citation:. Sermeus A, Genin M, Maincent A, Fransolet M, Notte A, Leclere L, et ai. A modulação da apoptose e Bcl-2 Family Proteins (2012) Hipoxia Induzida em diferentes tipos de células de cancro. PLoS ONE 7 (11): e47519. doi: 10.1371 /journal.pone.0047519

editor: Elad Katz, da Universidade de Edimburgo, Reino Unido

Recebido: 04 de junho de 2012; Aceito: 12 de setembro de 2012; Publicação: 05 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Sermeus et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. AS e AN estão Research Fellow da FNRS (Fonds de la Recherche Scientifique, Bélgica). MG e LL são suportados por FRIA (Fonds pour la Recherche dans l’Industrie et l’Agriculture, Bélgica). HR é beneficiário de uma doação FNRS-Télévie. Este artigo apresenta resultados do Programa belga sobre Interuniversitário pólos de atracção iniciada pelo Estado belga, Gabinete do Primeiro Ministro, Programação Política Science. A responsabilidade é assumida por seus autores. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro é uma das principais causas de morte nos países desenvolvidos. Tratamentos muitas vezes incluem o uso de quimioterapias, mas a resistência aos medicamentos é uma causa comum de falha do tratamento e recaída. A maioria dos fármacos quimioterapêuticos induzem morte celular, desencadeando a apoptose. A apoptose é regulada por proteínas de a (2-linfoma de células B) família Bcl-2 que actuam principalmente ao nível mitocondrial. Esta família de proteínas pode ser subdividida em três categorias, de acordo com a função e estrutura das proteínas [1]. Em primeiro lugar, as proteínas BAX-like, como BAX (BCL-2 associado × proteína) e BAK (BCL-2 homóloga antagonista /assassino), são fatores de morte. Uma vez activados, eles oligomerise nas mitocôndrias e induzir a permeabilização da membrana exterior mitocondrial, o que provoca a morte celular. As proteínas Bcl-2, tais como, como BCL-2, BCL-XL (B-linfoma de células extra-grande), Bcl-w e MCL-1 (leucemia de células mielóides 1), são factores de sobrevivência. Eles formam heterodímeros com BAX /BAK e inibir a sua acção. Finalmente, o BH3 (BCL-2 domínios de homologia 3) proteínas, tais como exigidos apenas BID (BH3-interagindo agonista domínio de morte), mau (BCL-2-antagonista de morte celular), BIM (BCL-2-interagindo mediador de células morte), BIK (BCL-2 interagindo assassino), PUMA (p53 modulador regulada positivamente de apoptose) e noxa, induzir a apoptose por neutralizar as moléculas de BCL-2-como anti-apoptóticos e, para alguns deles, ativando diretamente BAX /BAK. Em células saudáveis, BH3-only proteínas não são presentes ou mantidos inativos ou sequestrado. Seguindo sinais pró-apoptóticos, tornam-se transcricionalmente regulada positivamente e /ou pós-translacionalmente modificado (e /ou relocalizados) para ganhar a sua função pró-apoptótica completo [1], [2].

Uma das principais causas de resistência à quimioterapia apoptose induzida é a mutação p53. p53 é de facto um papel central para a indução de apoptose em células estressadas [3], [4] Uma outra causa bem conhecida de resistência é hipoxia tumoral [5]. Os efeitos da hipoxia em células cancerosas são do tipo celular dependente e diferem de acordo com a intensidade ea duração da falta de O

2. hipoxia grave e prolongada pode iniciar a apoptose ou necrose enquanto hipóxia leve é ​​protectora [6], [7]. Com efeito, hipóxia leve interfere com vários componentes da via apoptótica no transcricional, assim como ao nível pós-translacional.

resultados anteriores de nosso grupo mostraram que a hipoxia protege as células tumorais a partir apoptose induzida por agentes quimioterapêuticos. A hipoxia protege as células contra a apoptose HepG2 induzida por etoposido, bem como células MDA-MB231 contra a apoptose induzida por paclitaxel [8], [9], [10]. No entanto, noutros tipos de células, hipoxia pode não ter nenhum efeito ou mesmo agravar a apoptose induzida por agentes quimioterapêuticos. É por exemplo o caso para a apoptose induzida por etoposido de A549 e células MCF-7, bem como para a apoptose induzida por epirrubicina de células MDA-MB231 [8], [10]. Estes resultados também salientaram que as respostas celulares a hipóxia é muito complexo, envolvendo diferentes vias de transdução de sinal, bem como vários factores de transcrição. Notavelmente, o factor de transcrição p53 parece desempenhar um papel importante no comportamento das células em condições de hipoxia [8]. O objetivo deste trabalho é compreender como hipóxia pode influenciar de forma diferente da apoptose induzida por fármacos quimioterápicos em células cancerosas. Portanto, primeiro estendido nossas observações anteriores utilizando linhas celulares de cancro 7, originários de vários órgãos e com estatuto de p53 diferentes, expostos a 5 medicamentos indutores de apoptose utilizados na quimioterapia que têm como alvo diferentes vias celulares. Na maioria dos casos, hipoxia parcialmente evitados morte celular e o efeito de hipoxia foi o mesmo para todas as drogas em um tipo de célula. Em segundo lugar, observa-se que a hipoxia modulada a abundância da maioria das proteínas da família Bcl-2 de um modo dependente do tipo de célula. Em terceiro lugar, em células HepG2 que estão protegidos por hipóxia contra a morte celular induzida por etoposido, observou-se uma diminuição no nível de proteína BAD e Noxa, bem como uma alteração na mobilidade eletroforética de BIM

EL (BIM extra long) em hipóxia As células incubadas. Resultados de estudos de invalidação sugerem que a perda combinada de BIM e Noxa durante a hipóxia, pelo menos em parte, responsável por chemoresistance.

Materiais e Métodos

Cultura celular e hipóxia Incubação

Humano As células HepG2 do hepatoma, células humanas de carcinoma do pulmão A549, adenocarcinoma de mama humano células MDA-MB231, células de hepatoma Hep3B humanas, células de sarcoma U2OS osteogénicos humanos, células HT-29, adenocarcinoma do cólon humano e PC-3, células de adenocarcinoma da próstata humano (ATCC) foram mantidas em cultura em 75 cm

2 frascos de poliestireno (Costar) com, respectivamente, D-MEM (baixa glicose) (Gibco), MEM (Gibco), RPMI 1640 (Gibco), RPMI 1640 (Gibco) contendo 50 U /ml de penicilina e 50 ug /ml de estreptomicina (Gibco), meio 5A de Mc Coy (Gibco), RPMI 1640 (Gibco) e o meio de F12 Kaighn (Gibco) contendo 10% de FCS e incubou-se sob uma atmosfera contendo 5% de CO

2.

Para as experiências de hipoxia, as células foram incubadas em CO isento de soro

meio 2-independente (Invitrogen) suplementado com 0,5 mM de L-glutamina (Sigma), com ou sem etopósido (Sigma), o metotrexato (Sigma), o paclitaxel (Molecular Probes), cisplatina (Sigma) ou camptotecina (Sigma) durante 16 horas. A incubação sob hipóxia foi realizada em incubadoras caseiros contendo 99% N

2 e 1% O

2. O nível de hipóxia no meio em nossas condições experimentais é de 10 mm Hg de oxigénio dissolvido dentro do meio. Este nível de hipoxia é atingida após cerca de 10 minutos de incubação. PO

2 nível foi medido utilizando um medidor de oxigênio dissolvido (Inolab Oxi 730) equipado com uma sonda de 325 Cellox. as células de controlo foram incubadas Normoxic nas mesmas condições, mas em atmosfera normal (21% de O

2)

Transfection siRNA

siGENOME SmartPool humana (Dharmacon; usadas a 50 nM). BCL2L11 ( BIM, H-004383-02), PMAIP1 (noxa, H-005275-03), mau (M-003870-02) ou TP53 (M-003329-03) foram transfectadas com o reagente de transfecção DharmaFECT1 (Dharmacon; utilizado numa 1:500 diluição). Ao combinar e BIM noxa siRNA, cada siARN foi utilizado a 25 nM. O siGENOME RISC-Free ARNsi de controlo (D-001220-01, Dharmacon; usadas a 50 nM) ou siGENOME não-Targeting siARN conjunto # 1 (D-001206-13, Dharmacon; usadas a 50 nM) foram usados ​​como controlos negativos. As células foram incubadas durante 24 horas com meio de transfecção e o meio foi então substituído por meio fresco com 10% de FCS. 6 horas mais tarde (ou 30 horas mais tarde para BIM siRNA), as células foram incubadas em condições de hipoxia ou normoxia com agentes quimioterapêuticos ou não.

subcelular Fracionamento

Células, semeadas em 75 cm

2 frascos, foram colhidos em sacarose M /4 e homogeneizada por 3 golpes de um êmbolo B em um Dounce. O homogenado foi centrifugado 10 minutos a 1418

g

(Labofuge 400R Heraeus Instruments). O sobrenadante foi recuperado e centrifugado a 81085

g

(Beckman L7-35, rotor 50 Ti) por um período dependente do volume. O sedimento foi ressuspenso em sacarose M /4 e chamado a fracção MLP. O sobrenadante foi concentrado por centrifugação em Amicon Ultra-4 tubos (Millipore) e a fracção denominada S. Todas as amostras foram finalmente homogeneizada por ultra-sons.

Foi realizada

Análise Western Blot

Extracção de proteínas, tal como descrito em [9]. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE em gel de poliacrilamida a 15%, em 4-12% de gel NuPAGE Bis-Tris com tampão de MES (Invitrogen) ou em 3-8% de gel NuPAGE tris-acetato (Invitrogen) e, em seguida, transferidos para uma membrana de PVDF (Hybond-P, Amersham para a detecção de quimioluminescência ou Immobilon-FL, Millipore para detecção por fluorescência). detecção de quimioluminescência foi realizada como descrito em [11] usando a incubação durante a noite com anticorpos primários específicos. Para a detecção da fluorescência, as membranas foram bloqueadas 1 hora à temperatura ambiente em tampão de Odyssey (LI-COR) e em seguida durante a noite a 4 ° C de bloqueio em tampão de bloqueio Odyssey com Tween 0,1% contendo um anticorpo específico. Após 4 × 5 minutos lavagens em PBS-Tween 0,1%, a incubação com o anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho ou anti-ratinho marcado com IRDye, LI-COR, 1:10,000 diluição) foi realizada durante 1 hora em Odyssey bloqueando de tampão com 0,1% de Tween seguido de 4 lavagens de 5 minutos em PBS-Tween e 2 lavagens em PBS. A membrana foi, em seguida, secou-se 1 hora a 37 ° C e digitalizados utilizando sistema de imagem de infravermelhos Odyssey (LI-COR).

A coloração de imunofluorescência

células HepG2 foram semeadas a 40000 células /poço na tampa de vidro as lâminas em placas de 24 poços. Depois de incubação com ou sem paclitaxel ou etoposido, imunofluorescência foi realizada como descrito em [11]. O anticorpo primário para a coloração de alfa-tubulina foi rato anti-alfa-tubulina (Sigma # T5186) (diluição 1/100). Alexa Fluor-647 conjugado de ratinho anti-IgG de anticorpo (Molecular Probes) foi utilizado a 1 /1.000 de diluição.

A caspase-3/7 Ensaio de Actividade

O substrato fluorogénico Ac-DEVD-AFC (BD Pharmingen) foi utilizado para medir a actividade da caspase-3/7 de acordo com [12]. Os extractos celulares foram preparados como descrito em [13]. As células foram semeadas em 25 cm

2 frascos. O ensaio para a actividade da caspase-3/7 foi realizada de acordo com [8], utilizando 20 ug de extractos.

Lactato Desidrogenase Ensaio de Libertação de

Lactato desidrogenase (LDH), libertação foi medido com o “Citotoxicidade Detection Kit “a partir de Roche Applied Science, tal como descrito em [9]. O meio de cultura a partir de células incubadas foram removidas e centrifugadas para sedimentar os fragmentos de células e corpos apoptóticos. A fim de lisar as células, Triton X-100 (Merck) a 10% em PBS foi adicionado a este sedimento, bem como sobre as células restantes em anexo no fundo dos poços. A percentagem de libertação de LDH foi calculada como se segue: [actividade de LDH no meio de (1) + LDH actividade de fragmentos de células e corpos apoptóticos (2)] /[(1) + (2) + LDH actividade das células remanescentes nos poços].

transiente e Ensaio da luciferase transfecção

transfecção das células foi realizada em placas de 24 poços (50.000 células por poço em células HepG2 e MDA-MB231; 30000 para as células A549; 40000 e para as células Hep3B) com o reagente SuperFect (Qiagen). 923 ng (1385 ng para as células MDA-MB231) do plasmídeo repórter pGL3- (PGK-HRE6) -tk-luc, o qual contém 6 HRE elementos cis a partir do gene PGK ligado ao promotor basal de timidina quinase e para a luciferase de pirilampo gene de [14], foram co-transfectadas com 577 ng (115 ng para as células MDA-MB231) de vector de normalização (pCMVp vector que codifica para o β-galactosidase, Clontech) em meio sem soro durante 6 horas (ou 3 horas para células Hep3B antes de substituir o meio com meio fresco). Em seguida, as células foram incubadas em condições de hipoxia ou normoxia durante 16 horas. Após a incubação, as células foram lisadas em tampão de lise passiva (Promega) e β-galactosidase foi ensaiado em paralelo com a actividade de luciferase de pirilampo, ensaiada utilizando o Sistema de Ensaio de Luciferase (Promega).

Taqman baixa densidade do conjunto

Após a incubação, o RNA total foi extraído usando TRI Reagent Solução (Applied Biosystems). ARNm contido em 2 ug de RNA total foi transcrito de forma reversa utilizando o “High Capacity cDNA kit de transcrição reversa” da Applied Biosystems de acordo com as instruções do fabricante. 100 ng de ARN total em 50 uL retrotranscrito foram então misturados com 50 ul do “Taqman Universal PCR master mix” (Applied Biosystems) e foram carregados para um dos portos 8 de preenchimento da matriz de microfluidos. “Painel de Apoptose TLDA humano” são de 384 poços que contêm cartões de microfluidos ensaios para 96 ​​genes humanos. Eles permitem realizar 96 reações PCR em tempo real simultaneamente para 4 amostras. nível de expressão de mRNA foi quantificado usando o método de ciclo limiar, com 18S como gene de referência.

TA em tempo real-PCR para mRNA de Quantificação

Após a incubação, o RNA total foi extraído usando TRI Reagent Solução (Applied Biosystems). ARNm contido em 2 ug de RNA total foi transcrito de forma reversa utilizando Superscript II da Transcriptase Reversa (Invitrogen). Avanço e retrocesso sequências de primers estão disponíveis na Tabela S1 e foram projetados usando o software Primer Expresso 1.5 (Applied Biosystem). Os ensaios de reacção de amplificação continha 1 × SYBRGreen mistura de PCR Master (Applied Biosystem) e iniciadores (Applied Biosystems, 300 nM). RPL13A foi utilizado como o gene de referência e para a normalização do nível de expressão de mRNA foi quantificado usando o método de ciclo limiar.

heatmap e Estatísticos As análises

mc_ui_heatmap foram gerados com os dados transformados em logaritmo de base 2 do resultados para TDLA (n = 1) e dos meios de três valores de resultados de qRT-PCR. As análises estatísticas foram realizadas com ANOVA 1 e Tukey testes de comparações múltiplas utilizando GraphPad Prism.

Resultados

A hipoxia tem efeitos diferentes sobre a morte celular induzida por drogas em diferentes tipos celulares

a fim de obter uma visão mais dos mecanismos iniciadas por hipoxia que levam à resistência de células de cancro, que alargado nossas observações anteriores utilizando outras linhas de células de cancro provenientes de diversos órgãos e com o estado de p53 diferente e outros fármacos quimioterapêuticos indutores de apoptose que têm como alvo diferentes vias celulares . As linhas celulares utilizadas são HepG2 (células p53 de tipo selvagem de hepatoma), A549 (p53 de tipo selvagem de células de carcinoma do pulmão), U2-OS (p53 do tipo selvagem, células de sarcoma osteogénicas), MDA-MB231 (células p53 de adenocarcinoma da mama mutante), , Hep3B (células de hepatoma de p53 nulo) HT-29 (p53 mutantes células de adenocarcinoma do cólon), e células PC-3 (p53 nulo células de adenocarcinoma da próstata). Os agentes quimioterapêuticos são escolhidos etoposido (um inibidor da topoisomerase II), o metotrexato (um inibidor da síntese de ADN e ARN), o paclitaxel (um inibidor da dinâmica dos microtúbulos), cisplatina (um agente alquilante) e camptotecina (um inibidor da topoisomerase I).

primeiro, a concentração de droga para usar em cada tipo de célula foi escolhido por ensaio de caspase-3/7 actividade após 16 horas de incubação com a droga. Em cada caso, foi escolhida uma concentração que induz apoptose moderada. Para os agentes que induzem nenhuma actividade de caspase, a sua toxicidade geral foi avaliada através da medição da lactato desidrogenase (LDH) a libertação de 40 horas após a incubação com os agentes. Uma vez que as concentrações foram escolhidas, o efeito de hipoxia (1% de O

2) sobre a morte celular induzida por cada agente em cada tipo de célula foi monitorizada por as duas mesmas técnicas (Figura 1).

HepG2 , A549, U2OS, MDA-MB231, HT-29, Hep3B e células PC-3 foram incubadas sob normoxia (21% de o

2) ou hipoxia (1% de o

2) na ausência (CTL) ou presença de etopósido (ETO), paclitaxel (Tax), cisplatina (CIS) ou camptotecina (CPT) para 16 (a, C, e, G, J) ou 40 horas (B, D, F, H, I, K) . A concentração utilizada para cada molécula é indicado nos gráficos (em uM). (A, C, E, G, J), a actividade da caspase-3/7 foi ensaiada através da medição da fluorescência de AFC livre libertado a partir da clivagem do substrato /7 específico de caspase-3 Ac-DEVD-AFC. Os resultados são expressos em unidades fluorescentes relativas (RFU) como média ± 1 SD (n = 3). (B, D, F, H, I, K) a libertação de LDH foi avaliada. Os resultados são apresentados em percentagens como média ± 1 SD (n = 3). A análise estatística (A-K) foi realizada com ANOVA 1. ns: não significativo; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001. Símbolos acima de uma coluna normóxica são uma comparação com o controlo e os símbolos normóxica acima de uma coluna de hipóxia são uma comparação com a condição normóxica correspondente (com a mesma droga).

Observou-se que, em geral, o p53 mutado ou células nulas são mais difíceis de matar do que as células do tipo selvagem de p53. Na maioria dos casos, o efeito de hipoxia em morte celular foi a mesma para todas as moléculas de um tipo de célula. No entanto, este efeito variou de acordo com o tipo de célula. Observou-se também que a hipóxia teve mais frequentemente um efeito protetor contra a morte celular do que um efeito agravante. Por exemplo, a hipóxia protegido células HepG2 e MDA-MB231 contra a morte celular induzida por todas as moléculas testadas, enquanto foi observado nenhum efeito ou um agravamento da morte celular induzida por drogas por hipoxia em células Hep3B e A549. A hipoxia pode, por conseguinte, proteger o p53 do tipo selvagem, bem como células p53 mutada. No seu conjunto, estes resultados gerada uma matriz de dados sobre o efeito de hipoxia na apoptose induzida por 5 moléculas em 7 tipos de células (Tabela 1). Os resultados mostraram que o efeito de hipoxia é diferente de acordo com o tipo de célula, mas constante para todas as drogas sobre um tipo de célula. Para o melhor de nosso conhecimento, esta observação nunca foi feito antes.

Expression perfil de mRNA e proteínas envolvidas na apoptose em diferentes tipos celulares

A fim de entender por hipóxia protegida algumas linhas celulares contra a morte induzida pela droga, mas não outros, foram selecionados quatro linhas de células que abrigam o estado de p53 diferente e para o qual o efeito da hipóxia é diferente: as células HepG2, A549, MDA-MB231 e Hep3B. Utilizou-se o etoposido como indutor de morte celular, uma vez que é forte em todas as quatro linhas celulares e o seu modo de acção é bem conhecida. O efeito da hipóxia sobre a morte induzida por paclitaxel de células HepG2 também foi estudada.

Etoposide e paclitaxel são ativos e HIF-1 está em condições de hipoxia em todos os tipos de células

A hipoxia é frequentemente descritos para inibir o efeito prejudicial dos agentes quimioterapêuticos [15]. A fim de verificar se a hipóxia inibe danos no ADN induzida por etoposido e /ou estabilização de microtúbulos induzida por paclitaxel ou se actuar a um nível a jusante dos danos causados ​​pelo fármaco, ATM (Ataxia-telangiectasia mutada) fosforilação foi estudada 1 hora após a incubação etoposido e a morfologia das fibras de microtúbulos foi estudada após 16 horas de exposição paclitaxel. Etoposide desencadeia a morte celular por induzindo quebras de filamento duplo do DNA que levam ao ATM ativação. Os resultados mostraram que, de facto induziu a fosforilação da ATM nas quatro tipos de células. Não se observou qualquer efeito de hipoxia na indução da P-ATM, mesmo em células HepG2 e MDA-MB231 hipoxia em que diminuiu a apoptose (Figura 2A) induzida por etoposido. Em células HepG2 que estão protegidos por hipoxia contra a morte celular mediada pelo paclitaxel, a hipoxia não parece impedir a formação de fibras de microtúbulos induzida por paclitaxel espessas (Figura 2B e dados não mostrados). No seu conjunto, estes resultados mostram que a hipoxia protege as células a jusante do dano induzido por drogas.

(A) Efeito de hipoxia, etoposide e paclitaxel sobre a quantidade e a fosforilação da ATM. As células HepG2, A549, MDA-MB231 e Hep3B foram incubadas 1 hora sob normoxia (N, 21% de O

2) ou hipoxia (H, 1% de O

2) na presença ou não (CTL) de etoposido (ETO, 100 uM em células Hep3B e 50 uM em outros tipos de células), ou o paclitaxel (TAX, 10 | iM) em células HepG2. ATM e P-ATM foram detectados em extractos de proteína nuclear através de Western blotting utilizando anticorpos específicos. representante Um experimento de três. As transferências de Western não cortadas são apresentados na Figura S1. (B) Efeito de hipoxia, etoposide e paclitaxel em microtúbulos. As células HepG2 foram incubadas 16 horas sob normoxia (21% de O

2) ou hipoxia (1% de O

2) na presença ou não de etoposido (50 uM) ou paclitaxel (10 uM). Após a incubação, as células foram fixadas, permeabilizadas e coradas para a alfa-tubulina, utilizando um anticorpo específico. A observação foi realizada usando um microscópio confocal com um fotomultiplicador constante.

Muitos efeitos protectores de hipóxia são mediadas pelo HIF-1 factor de transcrição (hipoxia-inducible factor-1), que é um heterodímero composto de uma subunidade constitutivamente expresso, HIF-1 beta, e uma subunidade estabilizada somente sob condições de hipoxia, HIF-1 alfa [5]. Por conseguinte, investigado se este factor foi eficazmente activado por hipoxia nas linhas celulares em que a hipoxia não tem um efeito protector (Figura 3). A hipoxia induzida a acumulação de HIF-1alfa etoposido mas diminuiu esta acumulação em células A549, MDA-MB-231 e Hep3B. Em células HepG2, etoposido ou não tinha um efeito inibidor ligeiro de acordo com a experiência. O efeito do etoposido no nível de proteína HIF-1alfa já foi observado [16]. Conforme avaliado pelo repórter luciferase, HIF-1 era ativo em cada tipo de célula durante a hipóxia e isso se correlaciona com a abundância de mRNA de dois de seus genes-alvo (LDHA e BNIP3).

HepG2, A549, MDA-MB231 e células Hep3B foram incubadas 16 horas sob normoxia (N, 21% de o

2) ou hipoxia (H, 1% de o

2) (dC) na presença ou não (CTL) de etoposido (ETO, 100 uM em células Hep3B e 50 uM em outros tipos de células), ou o paclitaxel (TAX, 10 | iM) em células HepG2 (a, C, D). (A), HIF-1 alfa foi detectada em extractos celulares totais por Western blotting utilizando um anticorpo específico. Alfa-tubulina foi utilizada como controlo de carga. representante Um experimento de três. As transferências de Western não cortadas são apresentados na Figura S1. (B) antes da incubação, as células foram co-transfectadas com o pGL3- (PGK-HRE6) plasmídeo repórter -tk-luc que codifica a luciferase de pirilampo e o plasmídeo pCMVß normalização. Os resultados são expressos como a média da relação entre a actividade da luciferase do pirilampo e a actividade beta-galactosidase ± 1 SD (n = 3). A análise estatística foi realizada com ANOVA 1. ***: P 0,001. Os símbolos são uma comparação entre as condições de normóxia e de hipóxia do mesmo tipo de célula. (C, D) Após a incubação, o RNA total foi extraído, submetido a transcrição reversa e, em seguida, a amplificação na presença de SYBR Green e iniciadores específicos para BNIP3 (c) ou LDHA (D). RPL13A foi usado como gene de manutenção para a normalização de dados. Os dados são apresentados na dobra-indução como a média ± 1 SD (n = 3). A análise estatística foi realizada com ANOVA 1. ns: não significativo; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001. Símbolos acima das colunas de hipóxia são uma comparação com a condição normóxica correspondente (com a mesma droga).

Em conclusão, o fato de que a hipóxia protege as células HepG2 e MDA-MB231 contra a morte, mas não A549 e Hep3B células não pode ser explicado por uma diferença de danos etoposide- ou induzida por paclitaxel ou na activação de HIF-1.

Expressão do perfil de mRNAs envolvidos na apoptose

os resultados da Figura 2 indicam que o diferencial efeito de hipoxia na morte celular ocorre a jusante da indução de danos celulares. Nós, assim, a hipótese de que a hipoxia influencia as vias de transdução de sinal que desencadeiam apoptose. Estas vias são em função designadamente da p53, mas também de outros factores de transcrição. Estudos de expressão do gene foram assim realizados para encontrar genes cuja expressão é regulada por hipóxia diferencialmente em células protegidas em comparação com células não-protegido. Taqman foram usadas matrizes de baixa densidade (Applied Biosystems) que permitem o estudo da abundância de ARNm de 93 conhecidos por estarem envolvidos no processo de apoptose (3, bem como ARNm de limpeza). Os resultados são apresentados como um mapa de calor na Figura 4, enquanto os valores numéricos são apresentados na Tabela S2. Como esperado, observou-se a indução de genes alvo de HIF-1 (BNIP3, BNIP3L e GAPDH) após 16 horas de hipoxia em quatro tipos de células. A indução de genes alvo p53 (APAF-1, BAK1 e BAX) foi observada em células HepG2 e células A549 depois de 16 horas de incubação etoposido, mas não no mutante p53 (células MDA-MB231) ou células nula (células Hep3B). O PMAIP1 gene alvo p53 (noxa) foi induzida por etoposido em todos os tipos de células.

Os resultados foram obtidos usando “Painel de TLDA humano apoptose” (Applied Biosystems) (TLDA). HepG2, A549, células Hep3B MDA-MB231 e foram incubadas 16 horas sob normoxia (N, 21% de O

2) ou hipoxia (H, 1% de O

2) na presença ou não de etoposido (E, 100 uM em células Hep3B e 50 uM em outros tipos de células), ou o paclitaxel (t, 10 | iM) em células HepG2. Após a incubação, o RNA total foi extraído, submetido a transcrição reversa e, em seguida, à análise TLDA. 18S foi usado como gene de manutenção para a normalização de dados. valores numéricos reais são fornecidos na Tabela S2. Os genes mostradas em negrito são os genes cuja expressão foi validado por qRT-PCT.

então procurado para genes cuja expressão perfil é paralela ao perfil, a morte celular em cada um dos quatro tipos de células, ou seja, genes cujos expressão foi regulada negativamente por hipóxia em HepG2 e células MDA-MB231 e não afetado ou aumento no A549 e células Hep3B, ou vice-versa. No entanto, tal perfil de expressão pode ser observada. Curiosamente, a expressão de BCL2L11 (também chamado BIM), BIK, CASP10, CASP3, DEDD2, NALP1 e TRADD foi diminuída por hipoxia em células HepG2 incubou-etoposido, enquanto a sua expressão foi aumentado ou não modificado em células A549, correlacionando-se com o perfil apoptótica de estes dois tipos de células. Além disso, BIRC3 e MCL1 perfil de expressão foi inversa do perfil apoptótico para as células HepG2 e A549. O perfil de expressão destes genes foi validado por reacções individuais em tempo real de RT-PCR. Os resultados são apresentados como um mapa de calor na Figura 5 enquanto que os valores numéricos são apresentados na Tabela S3. O perfil de BAK1, BAX, BBC3 (também chamado PUMA) e PMAIP1 (também chamado noxa) também foi validado uma vez que são mediadores bem conhecidos da morte celular induzida por etoposido. A maioria dos resultados obtidos utilizando Taqman matrizes de baixa densidade foram confirmadas. Deve no entanto notar-se que a expressão de genes quase todos estudados foi diminuída por hipoxia em todas as células expostas ao etoposido.

HepG2, A549, células Hep3B MDA-MB231 e foram incubadas 16 horas sob normoxia (N, 21% o

2) ou hipoxia (H, 1% de o

2) na presença ou não de etoposido (e, 100 uM em células Hep3B e 50 uM em outros tipos de células), ou o paclitaxel (t, 10 | iM) em células HepG2. Após a incubação, o RNA total foi extraído, submetido a transcrição reversa e, em seguida, a PCR em tempo real na presen de SYBR Verde e iniciadores específicos. valores numéricos reais são fornecidos na Tabela S3. Genes mostradas em negrito são genes cuja expressão foi avaliada no nível de proteína por análises de Western blot.

Expression perfil de proteínas envolvidas na apoptose

Além de ser regulada por alterações no gene expressão, a maior parte das proteínas envolvidas em apoptose são conhecidos por ser também regulada ao nível pós-traducional [2]. O etoposido e o paclitaxel induz a apoptose através da activação da via intrínseca, principalmente, [17], [18], [19], a qual é regulada pela abundância e a localização subcelular de proteínas da família Bcl-2. Por isso, estudaram a abundância de proteínas de proteínas da família Bcl-2 em quatro tipos de células, bem como a localização subcelular de alguns deles em células HepG2 e as células A549 (Figura 6).

HepG2, A549, MDA-MB231 e células Hep3B foram incubadas 16 horas sob normoxia (N, 21% de o

2) ou hipoxia (H, 1% o

2) na presença ou não (CTL) de etoposido (ETO, 100 uM em Hep3B células e 50 pM em outros tipos de células), ou o paclitaxel (TAX, 10 | iM) em células HepG2. Proteínas (A) foram detectadas em extractos celulares totais por transferência de Western, utilizando anticorpos específicos. alfa-tubulina foi utilizada como controlo de carga. representante Um experimento de três. As transferências de Western não cortadas são apresentados na Figura S1. (B) Após a incubação, o fraccionamento subcelular foi executado e as proteínas foram detectadas nos MLP (mitocôndrias-lisossoma-peroxissoma) e S (citosólica) fracções por transferência de Western, utilizando anticorpos específicos. TOM20 e β-actina foram utilizados como controlos de carga para o PTM e S fracções, respectivamente. representante Um experimento de três. Western blot não cortadas são apresentados na Figura S1.

Em primeiro lugar, estudou as proteínas BAX e BAK pró-apoptóticos. nível de proteína total BAX foi ligeiramente aumentada por etoposídeo em HepG2, células A549 e Hep3B mas permaneceram inalterados em células MDA-MB231. Hipóxia diminuiu ligeiramente BAX abundância em células HepG2, mas não teve nenhum efeito em outros tipos de células. Esta proteína estava presente na fracção MLP (mitocôndrias-lisossoma-peroxissoma), bem como no citosol de células HepG2 e células A549. O etoposido aumento BAX abundância no citosol de células HepG2 e na fracção MLP de células A549; Este aumento foi impedido por hipoxia.