Sumário
Topoisomerases são uma família de enzimas vitais capazes de resolver os problemas topológicas no DNA durante vários processos genéticos. venenos de topoisomerase, bloqueando reencontro de cadeias de ADN clivados e estabilizar complexo de clivagem de DNA mediada por enzima, são agentes antineoplásicos e anti-microbianas importantes clinicamente. No entanto, o rápido aumento da resistência aos medicamentos que impede a eficácia terapêutica destes medicamentos que salvam vidas faz a descoberta de novos compostos de chumbo cada vez mais urgente. Relatamos aqui um sistema de rastreio de alto rendimento fácil para os agentes de segmentação topoisomerase humana IIα (Top2α). O ensaio baseia-se na medição da anisotropia de fluorescência de uma 29 pb marcado com fluoróforo duplex oligonucleótido. Desde DNA Top2α-bound estabilizou-droga tem uma anisotropia maior em comparação com o DNA livre, este ensaio pode funcionar se se pode usar um agente de dissociação para interromper específica da enzima DNA complexos /binários, mas não os complexos ternários estabilizado com a droga. Aqui demonstramos que o NaClO
4, um agente caotrópico, serve um papel crítico no nosso método de rastreio para diferenciar os complexos enzima /de ADN estabilizado-fármaco a partir desses que não são. Com esta estratégia, nós analisamos uma biblioteca química de 100.000 compostos e obteve 54 resultados positivos. Foram caracterizados três delas nesta lista e demonstrar os seus efeitos sobre as reacções Top2α-mediadas. Nossos resultados sugerem que esta nova estratégia de rastreio pode ser útil em descobrir candidatos adicionais de agentes anti-câncer
Citation:. Lin YS, Huang WC, Chen MS, Hsieh Ts (2014) para a descoberta de novos agentes anticancerosos Segmentação Topoisomerase IIα: Uma estratégia de rastreio Facile Adaptável a Plataforma High throughput. PLoS ONE 9 (5): e97008. doi: 10.1371 /journal.pone.0097008
editor: Spies Maria, da Universidade de Iowa, Estados Unidos da América
Recebido: 26 de dezembro de 2013; Aceito: 14 de abril de 2014; Publicado em: 08 de maio de 2014
Direitos de autor: © 2014 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Programa Nacional de Pesquisa para Biopharmaceuticals (ChemBank e High throughput Screening Centro de Recursos, NSC-101-2325-B-001-029) e NSC (NSC102-2325 e NSC103-2811). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
transações de DNA que transmitem e restaurar a informação genética, invariavelmente, envolvem o desenrolamento e rebobinagem de estruturas helicoidais duplas. Por causa da ligação topológica entre as estruturas de DNA ordem secundário e superior, o desenrolamento /rebobinar resultado helicoidal no emaranhado e interligada de cromossomos e DNA. Esses envolvimentos topológicos teria de ser resolvida de uma forma atempada e precisa, sem a qual as células não podem sobreviver. Topoisomerases são solução da natureza para estas complexidades topológicos aparentemente insolúveis [1] – [6]. Eles realizar essas transformações topológicas por um ciclo de transesterificação reversível entre o resíduo site de tirosil ativa e estrutura de fosfato no DNA. O aduto de enzima /de ADN transiente cria um portão de ADN através do qual outro segmento de ADN pode ser transportado e resulta em mudanças topológicas. Com base na estrutura e mecanismo, topoisomerases são classificados em dois tipos: Tipo I enzima medeia o transporte de mecha através de uma única porta, enquanto ADN de cadeia enzima tipo II transporta segmento de ADN através de uma porta de cadeia dupla. Ambos os tipos de topoisomerases são ainda classificados em duas famílias, A e B, e estes enzimas são ubíquas na natureza e têm funções essenciais para o crescimento e desenvolvimento de todos os organismos [7], [8].
Curiosamente, o quebras de DNA transitórias e reversíveis mediadas por topoisomerases, tão crítico para as suas funções bioquímicas e biológicas, também criam um calcanhar de Aquiles para as células. Muitos agentes citotóxicos, ou produzidos em natureza, alvo neste passo da reacção da topoisomerase e estabilizar a clivagem feita pelo homem intermédios gerando potencialmente letais quebras na cadeia de ADN [5], [9] – [14]. Alguns destes agentes de direccionamento de topoisomerase têm provado ser clinicamente importante drogas e antibióticos anti-cancro. A eficácia terapêutica destes medicamentos que salvam vidas é frequentemente comprometida por causa do aumento da resistência aos medicamentos em células tumorais ou microbianas. Procura de novas modalidades e drogas se torna cada vez mais urgente, se quisermos manter o ritmo com a ameaça da resistência aos medicamentos. Por causa dos papéis essenciais de topoisomerases na proliferação celular e porque eles são alvos de drogas clinicamente úteis comprovada, é razoável esperar que intensos esforços devem ser dedicados a descobrir mais drogas que alvejam topoisomerases. No entanto, os ensaios bioquímicos que são mais frequentemente utilizados para monitorar as atividades da topoisomerase não são facilmente adaptáveis para automação e plataforma de alto rendimento. Para os ensaios de ensaios bioquímicos mais versáteis baseiam-se na utilização de electroforese em gel de agarose, uma vez que pode detectar ADN transições estruturais associadas com as actividades de clivagem de cadeia e a passagem de topoisomerases. A natureza de trabalho intensivo e complicado processo em adquirir os dados fazem eletroforese em gel improvável que um método de escolha para automação e quantificação.
Para corrigir esta dificuldade, há uma série de abordagens desenvolvidas recentemente que são adaptáveis para automatizado plataforma de alto rendimento para identificar compostos-alvo topoisomerase [15] – [18]. Eles são todos os ensaios de actividade de topoisomerase-baseados em fluorescência, assim, mais favorável para a quantificação automatizado. No entanto, eles são também caracterizados com a utilização de um plasmídeo de ADN no processo de ensaios. Relatamos aqui o nosso esforço no desenvolvimento de uma nova abordagem utilizando um duplex de oligonucleótido marcado com fluoróforo como substrato para ensaiar a formação de complexos de topoisomerase /ADN estabilizados na presença de um agente candidato específico. Nós descrevemos nossa tela inicial usando esta técnica ensaio de uma biblioteca química com 100.000 compostos e caracterização de três dos hits positivos. Este método de rastreio pode fornecer uma abordagem alternativa para descobrir novos agentes de metas de topoisomerase e enriquecer o nosso arsenal para combater tumores e patógenos microbianos.
Materiais e Métodos
Purificação de Top2α Humano
Foi utilizado um YEpWob6 engenharia, um vetor com Top2α humano marcado com hexa-histidina sob um
GAL1
promotor induzido, para expressar Top2α humana recombinante em levedura [19]. As células de levedura após a indução de galactose foram recolhidas, ressuspensas em tampão hipertónico (1 M de sorbitol, 20 mM de fosfato de potássio pH 7,4, 20 mM de 2-mercaptoetanol) e lisadas pela adição de enzima lítica (Zymolyase 100T, Amsbio). Os núcleos foram colhidas por centrifugação (20 min a 55,000X
g
), ressuspensas num tampão de 20 mM de fosfato de potássio pH 7,4, 0,2% de Triton X-100, 5 mM de 2-mercaptoetanol com um cocktail inibidor de protease incluindo PMSF a 1 mM, 2 ug /ml de leupeptina, e 1 ug /mL de pepstatina A, e homogeneizado. Foram extraídos Top2α de núcleos, aumentando a concentração de NaCl para 500 mM e removido pelete nuclear por centrifugação a 15,000X
g
durante 25 min. O sobrenadante foi fraccionado por 3 passos cromatográficos (GE Healthcare). O primeiro foi um produto bruto HisTrap FF coluna de Ni-quelante e Top2α foi eluída em imidazol a 40 mM com um gradiente de imidazol 20-200 mM, em 20 mM de fosfato de potássio pH 7,4, 500 mM de NaCl e 0,1% de Triton X-100. As fracções reunidas foram diluídas por três vezes por 20 mM de fosfato de potássio pH 7,4, e ainda mais purificado através de uma coluna de HiTrap SP. Top2α eluiu a 500 mM de NaCl com um gradiente de NaCl de 200-800 mM. As fracções reunidas foram diluídas por três vezes por 20 mM de fosfato de potássio pH 7,4, e carregado para a coluna Mono S 5/50 GL. Top2α foi eluído a NaCl 500 mM e as fracções foram reunidas, dialisadas durante a noite contra 50% de glicerol, 15 mM de fosfato de sódio pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,1 mM de EDTA, 1 mM de PMSF e 5 mM de 2-mercaptoetanol, e armazenadas a -20 ° C. A fracção final de Top2α é mais de 90% puro e tem uma actividade específica de pelo menos 10
6 unidades /mg, com uma unidade definida como a quantidade de enzima necessária para relaxar 0,5 ug de ADN pUC19 em 30 min.
Os substratos de ADN
substrato de ADN fluorescente (Tecnologias de ADN integrado, Inc., Coralville, IA) foi concebido semelhante ao que foi descrito anteriormente (smiley, Collins et al., 2007), uma cadeia dupla de oligonucleótidos 29-pb que contém um local de clivagem top2 no centro e Alexa Fluor 488 na extremidade 3 ‘. Plasmídeo pUC19 DNA purificado por CsCl double-bandas, extração de fenol-clorofórmio e precipitação de álcool foi usado para ensaios de relaxamento e de clivagem (Sander e Hsieh, 1983).
Pré-HTS (High throughput screening) Anisotropy Ensaio
em 50 ul de tampão de reacção Top2 contendo 10 mM Tris-HCl pH 7,9, MgCl 5 mM de
2, 50 mM de NaCl, 0,1 mM de EDTA, 0,5 mM de ATP. 50 nM de Alexa Fluor 488 de ADN marcado, 1,25 uM Top2α humano, e teniposido (VM26) numa gama de concentrações de 60-300 uM, a mistura de reacção foi incubada a 37 ° C durante 30 minutos. Antes de medir a anisotropia, NaClO
4 foi adicionado para dar uma concentração final de 250 mM. Experiências de testar os efeitos de NaClO
4 mostrou que as concentrações no intervalo de 100-750 mm, tem um efeito semelhante na modulação da anisotropia de fluorescência (a ser detalhado na secção de resultados).
Para testar os efeitos de ordem de adição, 50 nM de Alexa Fluor 488 de ADN marcado, 250 nM Top2α humano, e NaClO mM 250
4, com ou sem 300 uM VM26 foram introduzidos de forma diferente para tampão de reacção de 50 uL. O tempo de reacção total foi de 30 min a 37 ° C, salvo indicação em contrário.
Para examinar os resultados positivos por ensaio de anisotropia sob condições em massa, a reacção foi realizada em 50 ul de tampão de reacção contendo 50 nM de Alexa Fluor 488 ADN marcado com, 250 nM Top2α humano, e o composto de teste de 15 uM. A mistura de reacção foi incubada a 37 ° C durante 30 minutos antes da adição de NaClO
4.
ensaios de anisotropia sob condições em massa foram medidos por Fluorolog-3 Espectrofluorímetro (hiroba Scientific) equipado com dois polarizadores nos caminhos de excitação e de emissão usando o método de G-formato. A excitação e emissão de comprimentos de onda foram 492 nm e 515 nm, respectivamente, cada um com uma largura da fenda de 2 nm, e o valor de ganho G fixado em 1.
High Throughput Screening Anisotropy
Para HTS , exames foram realizados no Centro de Pesquisa Genômica da Academia Sinica, em Taiwan, seguindo o protocolo publicado anteriormente, e usando a biblioteca química gerada e aí recolhidos, [20]. Resumidamente, exames foram realizados em placas de 1536 poços utilizando o sistema de rastreio de alto rendimento (HTS), produzido pelos sistemas GNF (GNF, San Diego, CA). O sistema de HTS é integrado com dispensadores, uma ferramenta de transferência de pinos 1536, incubadoras e um leitor de placas Viewlux (Perkin Elmer Inc.). O volume de reacção foi de 4 ul por poço contendo 100 nM de Alexa Fluor 488-ADN marcado com 150 nM Top2α humano no tampão de reacção. Após 30 minutos de incubação a 37 ° C, 100 mM de NaClO
4 foi adicionado a cada poço para parar a reacção e o valor de anisotropia foi medida. A triagem foi realizada com uma biblioteca representativa de 100.000 produtos químicos a uma concentração de 12,5