Abstract

O GRP78 chaperona molecular /BiP é um regulador chave de dobramento de proteínas no retículo endoplasmático, e ela desempenha um papel fundamental na sobrevivência de células cancerosas e quimioresistência. A inibição da sua função tem sido, portanto, uma importante estratégia para inibir o crescimento de células de tumor em terapia do cancro. Esforços anteriores para atingir esse objetivo usaram peptídeos que se ligam a GRP78 /BiP conjugado com pró-drogas ou sequências de células de indução de morte. Aqui, nós descrevemos um péptido que induz a morte de células de tumor da próstata sem a necessidade de quaisquer sequências de conjugação. Este péptido é uma sequência derivada do cochaperone Bag-1. Nós mostramos que esta sequência interage com e inibe a actividade de redobramento de GRP78 /BiP. Além disso, demonstrámos que modula a resposta proteína desdobrada em ER stress resultante em PARP e caspase-4 clivagem. células cancerosas da próstata expressando estavelmente esse peptídeo mostrou crescimento reduzido e aumento da apoptose em

In vivo

modelos de tumor xenoenxerto. As substituições de aminoácidos que destruíram a ligação do péptido de Bag-1 para GRP78 /BiP ou a regulação negativa da expressão de GRP78 comprometido o efeito inibitório deste péptido. Esta sequência representa, portanto, um péptido de ligação candidato para terapia anti-tumoral

citação:. Maddalo D, Neeb A, Jehle K, Schmitz K, Muhle-Goll C, Shatkina L, et ai. (2012) A peptidicos não conjugada GRP78 /BiP Ligand modula a resposta proteína Unfolded e induz o cancro da próstata morte celular. PLoS ONE 7 (10): e45690. doi: 10.1371 /journal.pone.0045690

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 20 Janeiro, 2012; Aceito: 23 de agosto de 2012; Publicação: 01 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Maddalo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações da Associação de Câncer Research International, Reino Unido; Fundação Alemã de Ciência, a União Europeia sexto programa-quadro PRIMA, e fundos de arranque do Instituto de Tecnologia de Karlsruhe. Danilo Maddalo foi um destinatário de uma CANCURE bolsa de investigação Marie Curie no programa de sexta-quadro da União Europeia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o GRP78 proteína regulada glucose (também conhecido como BiP, immunoglobuling proteína de ligação de cadeia pesada) é um membro da família de proteínas de choque térmico e desempenha um papel importante na manutenção da homeostase celular [1]. É o regulador chave da resposta de proteínas desdobradas (UPR), uma via activada quando ocorre acúmulo de peptídeos desdobradas em condições estressantes, como choque térmico, acidose, fome de nutrientes e hipoxia [2].

GRP78 regula a UPR ligando as proteínas do sensor transmembrana perk (quinase retículo residente endoplasmático PKR-like), ATF6 (fator ativador de transcrição 6) e IRE1α (-exigindo inositol enzima α) (revisto em [3]), levando de um lado a um aumento da transcrição de chaperonas moleculares, como ela própria GRP78, GRP94 e isomerase da proteína-dissulfureto (PDI) [4], [5] e, por outro lado, para desligar a síntese de proteínas por fosforilação da subunidade alfa do factor eucariótico de iniciação eIF2α [6]. Como consequência destes dois efeitos, as células superar sendo sobrecarregado com peptídeos aberrantes e eles sobrevivem [7]. No entanto, a fosforilação prolongada eIF2α activa o factor de transcrição ATF4 [8], [9], que conduz ao aumento dos níveis do factor de CHOP pró-apoptótica (proteína homóloga C /EBP) [10], [11]. A activação de RE-stress mediada resultados apoptose em clivagem de caspsase 4, uma caspase específico do ER-stress, e de PARP (poli (ADP) polimerase -ribosome) [12], [13].

GRP78 é sobre-expresso em vários tipos de tumores tais como o da próstata [14], da mama [15], [16] e do cólon e muitas vezes a sua expressão correlaciona-se com prognóstico pobre [17], [18], [19]. No entanto GRP78 regulação negativa por siARN aumenta a apoptose e sensibiliza células para fármacos quimioterapêuticos [20], [21]. Em células transformadas gerais upregulate nível GRP78 [15] para sobreviver às condições adversas do microambiente do tumor [22], [23], [24]. Vários agentes terapêuticos têm, portanto, sido alvo contra o UPR ou contra GRP78 /BiP para conter o crescimento de células tumorais [25], [26], mas verdadeiramente inibidores selectivos estão ainda a ser identificadas [15]. Em busca de mais inibidores de GRP78 /BiP que seriam de relevância terapêutica, usamos informações sobre a regulação do estresse ER pela cochaperone Bag-1 [27] para identificar uma sequência de Bag-1 que se liga e inibe a ação da GRP78 /BiP.

Bag-1 é uma família de quatro polipeptídeos (Bag-1D, -1m, -1 e -1S) com domínios multifuncionais que interage e regula as atividades de diversas proteínas celulares [ ,,,0],28]. Estas proteínas possuem sequências divergentes N-terminal, mas um domínio ubiquitina-like localizado centralmente comum que forma uma ligação para a HSC /Hsp70 para o proteassoma [29] e um domínio de ligação do terminal C da Hsp70 conservado (de outra forma conhecido como o domínio saco) que se liga a Hsp70 /Hsc70 e funciona como um factor de troca do nucleótido [30], [31]. Bag-1 também tem sido demonstrado que regulam retículo endoplasmático (ER) de apoptose induzida por stress [27] e de se ligar GADD34, um componente do ER stress [32], mas os detalhes da sua acção não são conhecidas.

nesta comunicação nós mostramos que Bag-1 liga-se a GRP78 /BiP através de um péptido sobrepondo seu domínio ubiquitina-like. Mostramos ainda que o /péptido de ligação BiP GRP78 de Bag-1 inibe a acção de GRP78 /BiP e interfere com a RPU levando à indução de apoptose. Nós reduzimos este péptido e identificou um motivo central de sete aminoácidos que parece ser essencial para a ligação a GRP78 /BiP e para a regulação negativa de crescimento de células tumorais da próstata. Esta sequência núcleo poderia ser o ponto de partida de terapias futuras voltadas para a inibição da GRP78 /BiP ação e do UPR.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

Human benigna prostática linha celular hiperplasia BPH-1 foi cultivada em Dulbecco modificado meio de Eagle (DMEM) suplementado com glutamina. células PC3 e DU145 foram também cultivadas em DMEM sem glutamina, mas 22Rv.1, LNCaP e células PNT-2 foram cultivadas em meio RPMI 1640. Todos os meios de cultura acima foram suplementados com soro fetal bovino a 10%. células RWPE-1 foram cultivadas em meio livre de soro de queratinócitos. Todos os meios de cultura foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2.

Anticorpos

anticorpo monoclonal de cabra GRP78 (N20), anticorpos policlonais de coelho contra Bag-1 (C-16), eIF2α e fosfo-PERK foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha. Policlonal de coelho anti-GRP78 (ab21685), anti-GCN2 (ab37674), anti-PERK (ab65142), anti-fosfo-IRE1α (ab124945) anticorpos, monoclonais de coelho anti-phopsho-GCN2 (ab75836) anticorpo e anticorpo monoclonal de ratinho anti-β anticorpo actina (ab8226) foram adquiridos a Abcam, Cambridge, Reino Unido. Rato anticorpo contra HA-tag (HA.11 clone 16B12) foi adquirido a partir de Covance, Munique, Alemanha. anticorpo monoclonal de rato contra HA (3F10) foi adquirido a partir de Roche, Mannheim, Alemanha. Os anticorpos contra IRE1α, fosfo-eIF2α CHOP, PARP e ATF4 foram adquiridos da Cell Signaling Technology, Frankfurt am Main, Alemanha. O anticorpo anti-ATF6 foi comprado de Imgenex, Hamburgo, Alemanha. anticorpo caspase 4 foi comprado de MBL, Munique, Alemanha.

vectores de expressão e plasmídeos

O vector de expressão pcDNA3.1-HA-Bag-1 que codifica saco-1 foi previamente descrito por [ ,,,0],33]. A construção que codifica Bag-1Δ68mer (Bag-1 sem aminoácidos 202-269) foi criado por substituição do fragmento SacII-Xbal do ADNc do Bag-1 numa construção pcDNA3-Bag-1. A construção pcDNA3-HA Bag-1 peptídeo (Bag1-G 202-269), N-terminal (Bag-1L 202-241), C-terminal (241-269 Bag-1 L), 19-mer (Bag-202 1L -220), ΔUbi (Bag-1L 220-269) e 19-mer mutante (Bag-1L 202-220) peptídeos foram criados por amplificação por PCR com uma sequência de HA. Como um controlo, que introduziu a sequência de HA em pcDNA3 vector para gerar o vector de expressão vazio pcDNA3.1-HA. Saco pcDNA3.1-1ΔC47 (Bag-1 sem os últimos 47 aminoácidos) foi clonado nos locais Bam Hl-Xho I do vector pcDNA3.1-HA após a amplificação por PCR usando pcDNA3.1-HA Bag-1 como molde. Para experiências GST-pull-down, pGEX4T.1-Bag-1 de sequência 68mer, pGEX4T.1-N-terminal de peptídeos, peptídeos pGEX4T.1-C-terminal, pGEX4T.1 Bag-1Δ Ubi, pGEX4T.1-19mer e pGEX4T.1-19mer mutantes foram criados por fusão de produtos de amplificação por PCR da sequência respectiva Bag-1L em quadro com a GST no vector de pGEX4T.1. GST plasmídeos que codificam para GRP78 GST-fundido, GRP78-ATPase (GRP78 1-408), GRP78-SBD (GRP78 409-651) e Bag-1 isoformas foram gerados por PCR e clonado em pGEX4T.1 após digestão com BamHI-XhoI. O plasmídeo pCMV6-GRP78 [34] foi adquirido a partir de OriGene Technologies (Darmstadt, Alemanha).

A transfecção celular, siRNA knock-down e Western Blotting

A menos que indicado de outra forma, a transfecção estável foi efectuada em 22Rv.1 ou células com 10 ug de ADN de plasmídeo utilizando FuGene 6 1 HBP-™ (Roche Diagnostics Mannheim, Alemanha) transfectadas estavelmente 22Rv.1 células foram seleccionados com 0,8 mg /mL, enquanto os clones de células BPH-1 foram seleccionados com 1,2 mg /ml de G418. LNCaP, PC3, DU145, os clones de células PNT-2 e RWPE-1 foram seleccionados com 1 mg /ml de G418. regulação negativa de expressão específica GRP78 foi conseguida por transfecção de siRNA-dúplex (GRP78:5′-GGAGCGCAUUGAUACUAGATT-3 ‘), duas vezes, em 72 h, usando HiPerfect ™ (Qiagen Hilden, Alemanha). ARNsi contra GFP (5’-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3 ‘) foi utilizada como um controlo. A análise por Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [35].

Co-imunoprecipitação

22Rv.1 células foram usadas para estudos de interacção de Bag-1 endógeno e GRP78 /BiP, enquanto que para a

in vivo

interação do péptido Bag-1 e GRP78 /BiP, células HEK-293 foram transfectadas com um plasmídeo que codifica marcada com HA-1 Saco péptido. Vinte e quatro horas antes da experiência, as células em ambos os casos foram lavadas com solução salina de fosfato tamponada (PBS) e tratadas com 20 mM de Ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP) em PBS durante 30 min à temperatura ambiente. A reacção foi parada com Tris 20 mM e as células foram lisadas em 50 mM de Tris-HCl a pH 7,4, NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, NP40 a 0,4% e 1% de cocktail inibidor de protease. A imunoprecipitação de GRP78 /BiP foi realizada durante a noite a 4 ° C com anticorpo anti-GRP78 acoplado a sepharose grânulos (Abcam, ab21685). A ligação do Bag-1 endógena ou de HA-peptídeo foi determinado por transferência de Western utilizando um saco-1 ou um anticorpo específico HA.

Protein Expression e Preparação de Amostras

A TEV GB1 protease clivável -fused Bag-1 peptídeo foi expressa no

Escherichia coli

estirpe BL21 rotulagem uniforme (DE3) pLys S. com

15N para espectroscopia de RMN foi conseguida por crescimento das bactérias em meio mínimo suplementado com 0,5 g /l

15NH

4Cl. O GB1-His

proteína 6-tag foi purificado sobre uma coluna de Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Alemanha), subsequentemente digerido com protease de TEV recombinante e passado através de uma segunda coluna de Ni-NTA para remover tanto o tag de fusão eo sua protease

6-tag. Finalmente, o tampão de proteína foi alterado para fosfato de potássio 20 mM, NaCl 100 mM, pH 6,8. A concentração de proteína foi estimada por comparação da intensidade de um espectro de RMN de 1D com a de uma substância de referência (ácido DSS, 2,2-dimetil-2-silapentane-5-sulfónico).

O GST-marcada com HA péptidos N-terminais e C-terminais foram produzidos utilizando o protocolo padrão. A porção GST foi clivado por digestão com trombina de acordo com o protocolo do fabricante (Roche, Mannheim, Alemanha). A preparação de péptido em bruto resultante foi adicionalmente purificado por HPLC de fase reversa (coluna C18; 250 × 10 mm, Grace) com um gradiente linear de água /acetonitrilo. A identidade e a pureza das fracções recolhidas foram analisadas por espectrometria de massa MALDI-TOF (Bruker Autoflex III). O pH foi neutralizado antes da liofilização. O péptido foi dissolvido em 20 mM de KPO

4, pH 6,8. A concentração de proteína foi calculado a partir da densidade óptica a 275 nm, utilizando a absorvância das tirosinas na HA-tag.

CD Espectroscopia

O CD espectros dos péptidos foram registados num Jasco J- 810, (Jasco Co., Tóquio, Japão) a 20 ° C, usando um suporte de célula termostatizada-água. As concentrações dos péptidos Bag-1, N-terminais e C-terminais foram de 17 uM, 12 uM e 11 uM, respectivamente. Os espectros de CD são as médias de três verificações, a uma taxa de varrimento de 10 min nm

-1, 4 s tempo de resposta e uma largura de banda nm, e eles foram suavizadas pelo método de suavização adaptativa, que é parte do software Jasco Análise Espectros . A contribuição tampão foi subtraído.

Experimentos de RMN

A concentração de proteína para o experimento de RMN foi de 0,5 mM. Para a calibração de desvio químico e para comparar intensidades de sinal relativas, DSS a 0,2 mM (2,2-Dimetil-2 silpentane-5-sulfónico) foi adicionado.

espectros 15N-HSQC foram adquiridas a 23 ° C em um Bruker Avance II 600 espectrômetro (Bruker, Karlsruhe), equipado com uma cabeça de sonda de ressonância tripla de banda larga com 4 varrimentos por incremento e um total de 128 incrementos na dimensão indireta. Os dados foram processados ​​com NMRPIPE [36] e analisados ​​utilizando VISTA RMN.

fluorescência polarizada Assays

ensaios de polarização de fluorescência foram realizadas utilizando um Infinito F-200 leitor (Tecan) com excitação a 490 nm e emissão a 535 nm.

Tumor Xenoenxerto Estudos

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os regulamentos legais europeus e alemães. Para a geração de modelos de xenoenxerto de 5 × 10

6 células LNCaP foram ressuspensas numa solução de 50% de Matrigel® (BD Bioscience, Heidelberg, Alemanha) em PBS ou 5 × 10

6 22Rv.1 células em 100 ul de PBS foram injectados por via subcutânea em ambos os flancos de ratinhos nus atímicos de 6-8 semanas de idade. O tamanho do tumor foi medido com um calibrador semanalmente. Tumores derivados da injecção de clones estáveis ​​que sobre-expressam o péptido Bag-1 foram analisados ​​durante um período de 9 semanas enquanto que os tumores a partir de células transfectadas com o vector de expressão vazio ou expressão do N-terminal, foram analisadas a C-terminal e o ΔN-peptídeo mais de 5 semanas. O tamanho do tumor foi avaliada medindo três diâmetros perpendiculares de acordo com a fórmula: V = (1/6) [π] (d1d2d3), onde π é uma constante matemática e D1, D2 e ​​D3 representam as três dimensões espaciais (largura, altura e profundidade ). Os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical e os tumores removidos para análise posterior.

Experiências

-GST pull-down

Expressão de proteínas de fusão GST para ensaios de GST-pull-down foram realizadas essencialmente como descrito anteriormente [37].

a imuno-histoquímica

Os tecidos foram fixados em formalina a 10% durante 16 h à temperatura ambiente, armazenados em etanol (50%), embebidos em parafina, seccionados e 5 mm de espessura com uma Leica RM 2155 micrótomo. As células apoptóticas foram detectadas por meio de rotulagem nick end-desoxiuridina-trifosfato ensaio biotina mediada por desoxinucleotidil-transferase terminal (TÚNEL) utilizando o ADN de fragmentação ApopTag® peroxidase

In situ

kit de detecção de apoptose (Millipore, Schwalbach, Alemanha).

ensaio de viabilidade celular

CellTiter-Blue® (Promega) para a determinação da viabilidade das células. Resumidamente 22Rv.1 células que sobre-expressam de forma estável o saco péptido-1 foram semeadas em duas placas de 96 poços (4500 células /poço) e as medições foram realizadas em triplicado. Uma placa foi analisada no dia 0 e a outra placa, 2 dias mais tarde. Três horas após a semeadura, 20 l de corante foram adicionados a cada poço contendo 100 ul de meio de cultura e incubou-se durante 4 h a 37 ° C. A fluorescência foi medida pelo fluorómetro de leitura de placas Fluostar Optima (2001, BMG Labtechnology, software de versão 1,10-0) e apresentados como a razão entre o valor no comprimento de onda de excitação (560 nm) ao longo do comprimento de onda de emissão (590 nm). A proliferação celular foi determinada a partir da diferença entre a intensidade de fluorescência no ponto de tempo final e o valor obtido no dia da inoculação das células (dia 0).

In vivo

redobramento Ensaio

ensaio in vivo de redobragem foi efectuado essencialmente de acordo com o método descrito por [38]. HEK-293 em um 70% -confluent placa de 10 cm foram transfectadas com construção de β-actina-fogo mosca luciferase (2 mg), pcMV6-GRP78 (3 g), Saco-1 ou 1 saco-peptídeos em pcDNA3.1-HA (6 ug) e constructo de luciferase de Renilla (0,5 ug) para o controlo igual a transfecção. Dois dias após a transfecção as células foram divididas em dois e incubadas em tampão de choque térmico (MOPS 20 mM e ciclo-heximida 20 ug /ml) durante 30 min a 37 ° C. Uma metade das células transfectadas foi sujeitas a choque térmico durante 30 min a 45 ° C e deixou-se recuperar a 37 ° C durante 30 min. A outra metade foi deixada sem tratamento e utilizado como controle. No final das experiências, as células foram recolhidas, lisadas e a actividade da luciferase foi medida. A actividade medida para o não-sujeitas a choque térmico células foi definida como 100% de luciferase redobrada e as medições da actividade de calor chocado células foram expressos relativamente este valor.

Análise Estatística

Salvo indicação em contrário cálculos de significância estatística neste trabalho foi realizado de acordo com o teste t de Student.

resultados

Bag-1 interage com GRP78 /BiP

Como Bag-1 é relatado para mediar ER-stress e para interagir com um dos componentes do UPS [27], [32], foi investigado se ele também se liga a GRP78 /BiP, um componente chave na via do ER stress. Em primeiro lugar, determinar se Bag-1 interage com GRP78 /BiP em um ensaio de pull-down GST usando ligado de 22Rv.1 células cancerosas da próstata. análise de mancha de Western utilizando um GRP78 /BiP anticorpo específico mostraram que todos os membros da família Bag-1 de proteínas interagiram com GRP78 /BiP (Figura 1A).

In vivo

interacção também foi demonstrada num ensaio de co-imunoprecipitação em que Bag-1 mostrou ligar-se a GRP78 /BiP em 22Rv.1 células (Figura 1B). Além disso, podemos mostrar uma localização perinuclear de Bag-1 e GRP78 /BiP em um teste de imunofluorescência usando 22Rv.1 células (Figura 1C) que implica uma localização ER de Bag-1. Esta constatação foi confirmada em outro experimento imunofluorescência onde poderíamos mostrar co-localização de Bag-1 com um rastreador ER (Figura S1).

Para determinar o domínio de GRP78 /BiP envolvidos na sua ligação ao Bag-1, nós construções de fusão com GST usado das duas regiões principais de GRP78 /BiP (a ATPase e substrato de ligação domain-SBD) (Figura 1D) em experimentos de pull-down com células HEK-293 superexpressão Bag-1. A análise Western blot mostrou que Bag-1 interagiu não só com o comprimento total GRP78 /BiP mas também com a sua ATPase e SBD (Figura 1E). Como Bag-1 é relatado para se ligar ao domínio de ligação a ATPase da chaperona molecular Hsp70 /Hsp70 [39] e GRP78 /BiP pertence a esta família de chaperones [40], a nossa descoberta de que a SBD de GRP78 /BiP é também ligado por Bag-1 é bastante intrigante e identifica um novo sítio de interacção de Bag-1 na família de chaperona molecular. Nós, portanto, usou a SBD de GRP78 /BiP na melhor caracterização da interação de GRP78 /BiP com Bag-1.

A. A família Bag-1 de proteínas liga GRP78 /BiP. ensaio de pull-down GST foi realizada incubando 5 ug cada de proteínas GST-fundidos Bag-1 com 400 ug de lisado celular 22Rv.1. Transferência de Western com um antibodiy específica contra GRP78 /BiP foi utilizado para detectar a ligação e um anticorpo anti-GST foi utilizada para determinar a quantidade de proteína em bactérias purificada empregue no ensaio. B. Bag-1 e GRP78 interagir

in vivo

. GRP78 foi imunoprecipitado com um anticorpo anti-GRP78 /BiP ou IgG como controlo em 22Rv.1 células. Western blotting com um anticorpo anti-Bag-1 e anti-GRP78 foi realizada para determinar GRP78-Bag-1 interacção. C. Bag-1 e GRP78 /BiP mostram uma co-localização perinuclear. As análises microscópicas confocais foram realizadas em 22Rv.1 células que foram e coradas com um anticorpo Bag-1 para detectar Bag-1 (canal verde) e um anticorpo específico GRP78 /BiP para detectar GRP78 /BiP (canal vermelho) fixa-paraformaldeído . A coloração laranja na fusão dos dois canais indica o grau de co-localização das duas proteínas. Todas as imagens (40x) foram adquiridos com um microscópio confocal Leica TCS SPE (Leica Microsystems; Barras de escala indicam 25 mm). D. representação esquemática dos domínios de GRP78. E. Bag-1 liga-se a vários sites em GRP78. GST-pull down ensaio realizado incubando 500 ug de lisado de células HEK-293 transfectadas com um saco-1 e 10 ug GRP78 comprimento total fundida-GST marcada com HA e seu domínio de ligação ATPase e substrato (SBD). A análise por Western blot foi realizada utilizando um anticorpo HA para detectar a proteína Bag-1-etiquetado. É mostrada uma coloração azul Coomassie das proteínas GST bactérias purificadas para demonstrar carga igual das proteínas GST.

GST-pull down análises foram realizadas com a SBD de GRP78 /BiP e ligado de células HEK293 expressando o tipo selvagem Bag-1, Bag-1ΔC47, um mutante de deleção C-terminal ou Bag-1Δ68mer, um mutante de deleção interna. Estes estudos identificaram uma sequência interna de 68 aminoácidos como alvo da interacção de Bag-1 com GRP78 /BiP (Figuras 2A e B). A supressão desta sequência (Bag-1Δ68mer) aboliu a interacção de Bag-1 com GRP78 /BiP (Figura 2B pista 11) enquanto que a expressão da sequência de ácido 68 amino sozinhos mostraram que ela é realmente necessária para a ligação da SBD de GRP78 /BiP ( A Figura 2B pista 12). Este achado foi confirmado em um

in vivo

experimento co-imunoprecipitação, onde um peptídeo marcada com HA Bag-1 expressos em HEK 293 células interagiram com GRP78 proteína endógena /BiP (Figura 2C pista 3).

A. Representação esquemática da Bolsa-1 e seus mutantes de deleção utilizado para a identificação de sequências necessárias para a ligação da SBD de GRP78 /BiP. Retratado em azul e vermelho são o domínio da ubiquitina-like eo domínio BAG respectivamente. B. Identificação da Bag-1 peptídeo ligação a GRP78 /BiP. -Pull GST baixo ensaio realizado incubando 500 ug lisados ​​a partir de células HEK-293 transfectadas com o saco-1 construções indicados e 10 ug de GST-GRP78 (SBD) ou GST como controle. análise de Western blot com um anticorpo HA para detectados os mutantes Bag-1 é mostrado. coloração com azul de Coomassie foi realizada para demonstrar o carregamento igual de proteínas de fusão GST. C. Os Bag-1 68 aminoácidos liga peptídeo ácido

in vivo

a GRP78. As células de HEK 293 foram co-transfectadas com pcDNA-péptido marcada com HA Bag-1. As células transfectadas foram tratadas com 2 mM Ditiobis (succinimidilpropionato) para reticular as proteínas e os lisados ​​celulares foram imunoprecipitados com um anticorpo anti-HA ou IgG como controlo, seguido por Western blotting com um anticorpo anti-GRP78 /BiP. D. O Bag-1 peptídeo ácido 68 amino inibe a atividade de redobramento /BiP GRP78.

In vivo

luciferase ensaio redobramento foi realizada em células HEK-293 transfectadas a 70% de confluência com a construção mosca luciferase 2 mg β-actina-fogo, 3 ug pcDNA3 vector vazio como controlo ou pCMV6-GRP78 /Bip, 6 ig da construção de luciferase indicada pcDNA3.1-Bag-1 ou construções mutantes e 0,5 ug de Renilla para determinar a eficácia de transfecção. As células transfectadas foram divididas em duas. Uma metade foi deixada sem tratamento e a outra metade foi a choque térmico a 45 ° C durante 30 min. Posteriormente a actividade da luciferase foi medida. Os resultados são expressos como a percentagem de re-enrolamento a actividade em relação a células não-sujeitas a choque térmico e apresentados como gráficos de barras da média de três experiências independentes ± SEM. * P . 0,05

A. modulação UPR em cima Bag-1 sobre-expressão de peptídeos. Os clones de células reunidas 22Rv.1 transfectadas com pcDNA3.1-HA-Bag-1 peptídeo ácido 68 amino ou um vector de expressão vazio foram tratadas com 300 nM de tapsigargina (TG) para os pontos de tempo indicados. As células foram lisadas e sujeitas a análise de transferência de Western utilizando os anticorpos indicados ou anticorpos específicos de fosfo. B. O péptido Bag-1 sensibiliza as células para 22Rv.1 ER-stress apoptose induzida. Os clones reunidos de 22Rv.1 transfectadas com o péptido Bag-1 ou o vector de expressão vazio foram tratados com tapsigargina (TG) ou (GS) durante 24 h carente de glicose. As células foram lisadas e sujeitas a análise de Western blot utilizando anti-PARP e caspase 4 anticorpos específicos. O anticorpo anti-HA foi utilizado para detectar o péptido HA-Bag-1. O anticorpo anti-β-actina foi utilizada para demonstrar carga igual das amostras de proteína. C. GRP78 downregulation aumenta a clivagem PARP. clones reunidos de 22Rv.1 expressando peptídeo Bag-1 marcada com HA ou um vector de expressão vazio foram transfectadas com GRP78 /BiP siRNA ou controlo GFP siRNA. As células foram lisadas e transferência de Western foi realizada com anticorpos anti-HA, anti-PARP, anti-GRP78 e. β-actina de anticorpo foi utilizado para determinar o nível de proteína carregada no gel.

Vários estudos têm mostrado que GRP78 /BiP coopera com PDI no re-enrolamento de proteínas desnaturadas

in vitro

[ ,,,0],41], [42]. Para determinar se GRP78 /BiP também possui a capacidade de dobrar proteínas desnaturadas

in vivo

, adotamos um ensaio de redobramento usado anteriormente para determinar a atividade acompanhante de Hsp70

in vivo

[43] Neste ensaio, as células HEK-293 foram transfectadas com um plasmídeo que codifica um gene de luciferase e um plasmídeo de expressão para GRP78 /BiP. As células foram brevemente submetidas a choque térmico e em seguida a actividade de luciferase das células transfectadas que expressam GRP78 /BiP foi comparada com a das células que expressam não GRP78 /BiP. Este estudo mostrou que a sobre-expressão de GRP78 /BiP melhorado significativamente a atividade da luciferase após o choque térmico (Figura 2D), demonstrando a capacidade de GRP78 /BiP redobrar luciferase desnaturado

in vivo

. Se as células foram adicionalmente transfectadas com o saco 1 ou do ácido 68-amino saco 1 de péptido que se liga GRP78 /BiP, a actividade de redobragem de GRP78 /BiP foi reduzida para o nível de controlo (Figura 2D). Este não era o caso quando Bag-1Δ68mer que não se liga GRP78 /BiP foi co-transfectado. Estes estudos demonstram que o péptido de Bag-1 interfere com a actividade de redobragem de GRP78 /BiP. No entanto, o peptídeo Bag-1 não tem qualquer efeito sobre a atividade ATPase de GRP78 /BiP embora Bag-1 aumentou a atividade enzimática (Figuras S2A e S2B). Isto indica que as funções de péptidos Bag-1 de forma diferente a partir do comprimento total Bag-1. Por isso, embarcou na caracterização deste peptídeo como um ligando para GRP78 /BiP para futuro uso terapêutico.

A. clones estáveis ​​de 22Rv.1 células mostram a viabilidade celular reduzida

in vitro

. Os clones estáveis ​​foram semeadas numa placa de 96 poços e o número de células em cada poço foi avaliado por medição da razão entre o comprimento de onda de excitação e de emissão de 560/590 nm utilizando o ensaio de proliferação de CellTiter-Blue ™. Os gráficos de barras representam a média de pelo menos quatro experiências independentes ± SD (* p 0,05). B. Determinação do nível da Bag-1 expressa nas 22Rv.1 clones. Os extractos celulares de 22v.1 clones estáveis ​​foram sujeitos a análise de Western blot. Um anticorpo anti-HA foi utilizado para detectar o péptido e um anticorpo anti-actina β para controlo de carga igual. CD. O peptídeo Bag-1 reduz o crescimento de células tumorais da próstata 22Rv.1

in vivo

. De seis semanas de idade os ratinhos nus atímicos foram injectados por via subcutânea em ambos os flancos com 5 × 10

6 células de cada clone estável. O tamanho do tumor foi medido uma vez por semana utilizando um paquímetro e expressa como o volume do tumor em mm

3. Mostram-se (C) dos volumes tumorais dos clones transfectados com o vector de expressão vazio e clones (D) que expressam o péptido Bag-1. Cada ponto representa o volume médio e o desvio padrão de pelo menos 5 de 10 tumores. E. xenoenxertos de clones estáveis ​​expressando o show peptídeo Bag-1 aumentou a apoptose. secções de cinco micron, de tecidos tumorais embebidos em parafina e fixados em formalina foram submetidos a imuno-histoquímica. Os núcleos são corados azul-violeta com hematoxilina enquanto as células apoptóticas detectadas com o ensaio TUNEL estão manchadas marrom. As secções representativas de xenoenxertos obtidos a partir de cada clone estável 22Rv.1 foram obtidas com um microscópio Axioscop (Zeiss). V: significa vector vazio clone de expressão e P:. Peptídeo expressar clone

Utilização de um saco-1 Peptide para induzir a apoptose e reduzir o cancro da próstata celular Crescimento

Durante ER stress, desdobrou peptídeos acumulam no ER e GRP78 /BiP desempenha um papel fundamental para ajustar a capacidade de dobramento de proteínas, ativando três vias de sinalização (Perk, IRE1α e ATF6) [44], [45]. Autofosforilado vantagem é que conduz à fosforilação da subunidade alfa da proteína eIF2 e síntese de desligamento. Fosforilada eIF2α aumenta selectivamente a tradução do factor de transcrição ATF4 que aumenta a expressão do gene alvo UPR, tais como GRP78 /BiP [44], [45] e também é IRE1α autofosforilado que conduz à activação da síntese de chaperona através da activação XBP1. ATF6 é clivado proteoliticamente para participar na regulação positiva da expressão de genes alvo UPR [44], [45]. No entanto a apoptose é induzida homeostase se não pode ser estabelecida [46]. Nós, portanto, determinar se a ligação do peptídeo Bag-1 a GRP78 /BiP, o componente-chave do estresse do RE, afeta as vias de sinalização da UPR.

A. Diagrama esquemático do péptido Bag-1 e seus mutantes de deleção. O domínio da ubiquitina-como é representado em azul eo domínio BAG em vermelho. Os números referem-se às posições de aminoácidos dos domínios diferentes. Os resíduos de aminoácidos estão numerados na sequência da numeração para o saco-1L. B. previsão da estrutura secundária do péptido Bag-1, mostrando um gancho de cabelo β-N-terminal do domínio da ubiquitina-like (azul) e uma α-hélice C-terminal do domínio SACO (vermelho). C. Normalizada espectros de dicroismo circular dos péptidos Bag-1. 30 uM do péptido Bag-1 foram medidos em KHPO 20 mM

4 tampão, pH 6,8 (linha preta). O seu teor de α-helicoidal foi estimado como sendo de aproximadamente 25% por desconvolução dos espectros (linha vermelha). 12 uM do péptido N-terminal (linha verde) e 11 jiM de C-terminal (linha azul) foram medidos sob as mesmas condições. D.

1H

15N-HSQC espectro de RMN

peptídeo Bag-1 marcada com 15N (202-269) em 20 milímetros KHPO

tampão 4, pH 6,8, a 23 ° C. A dispersão espectral estreita indica que o péptido não exibem uma estrutura globular dobrado. O H

δ e H

sinais de cadeia lateral £ de asparagina e glutamina são conectados por linhas finas. E. A região N-terminal do péptido Bag-1 é importante para a ligação GRP78.