Abstract

apresentam grandes variações humanos em seus perfis metabólicos devido às diferenças nos factores genéticos, dieta e estilo de vida. Por conseguinte, a fim de detectar diferenças entre indivíduos metabólicas métodos analíticos robustos são necessários. Um protocolo foi produzido com base na utilização de líquido Chromatography- alta resolução Espectrometria de Massa (LC-HRMS) em combinação com a interacção Hidrofílico ortogonal (HILIC) e de Fase Reversa (RP) métodos de cromatografia líquida para a análise do metaboloma urinária, que foi em seguida avaliada como uma ferramenta de diagnóstico para câncer de próstata (uma condição comum, mas altamente heterogênea). O método LC-HRMS foi encontrado para ser robusto e exibiu uma excelente repetibilidade para os tempos de retenção ( ± 1%), e precisão de massa ( ± 1 ppm). Com base em dados normalizados (em relação aos níveis de creatinina, da pressão osmótica ou MS totalizam sinais úteis /MSTUS) juntamente com análise multivariada supervisionado usando Orthogonal mínimos quadrados parciais-discriminante Análise (OPLS-DA), fomos capazes de discriminar amostras de urina de homens com ou sem próstata cancer com R2Y (cum) 0,9. Além disso, utilizando o teste de características de operação do receptor (ROC), a área sob a curva (AUC) para a combinação dos quatro melhores compostos biomarcadores caracterizados era 0,896. Os quatro compostos de biomarcadores também foram encontrados para diferem significativamente (P 0,05) entre um grupo de pacientes e controlos independente. Esta é a primeira vez que um teste como rigorosa foi aplicada a este tipo de modelo. Se validado, o protocolo estabelecido fornece uma abordagem robusta com um grande potencial de aplicação ao metabolito profiling de fluidos biológicos humanos na saúde e na doença

Citation:. Zhang T, Watson DG, Wang L, Abbas M, Murdoch L, Bashford G, et al. (2013) Aplicação de Holística cromatografia líquida de alta resolução de Espectrometria de Massa Base urinário Metabolomics para detecção do cancro da próstata e Biomarcador Discovery. PLoS ONE 8 (6): e65880. doi: 10.1371 /journal.pone.0065880

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 30 Janeiro, 2013; Aceito: 29 de abril de 2013; Publicação: 18 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores reconhecer Scottish Sciences Alliance Life para suporte para equipamentos de espectrometria de massa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o câncer mais prevalente na população masculina nos países ocidentais. O câncer de próstata é altamente heterogênea com os resultados clínicos altamente variáveis: doença indolente não tende a progredir mesmo ao longo de muitos anos, enquanto agressiva da doença (alto grau), muitas vezes progride rapidamente para resultar em metástases que inevitavelmente resultam em morte prematura. Além disso, há uma limitação significativa na especificidade com a prática corrente de utilização de medição específico da próstata no soro ao antigénio (PSA) como uma ferramenta de diagnóstico. Portanto, há uma necessidade urgente de melhores testes de diagnóstico e prognóstico para câncer de próstata.

Evoluindo evidências apontam para a entrada de vias metabólicas altamente versáteis no abastecimento carcinogênese [1] A análise, portanto, detalhado do metaboloma associado a tumor pode revelam novos biomarcadores [2], [3]. As análises de urina, plasma e /ou amostras de tecido pode ser realizado com espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e /ou espectrometria de massa (MS) combinado com técnicas de separação tais como a cromatografia líquida (CL) e /ou cromatografia gasosa (GC). Sreekumar

et al

. realizada perfis metabolômico irrelevantes para o cancro da próstata utilizando LC /GC-MS através de três tipos diferentes de amostras clínicas (urina, plasma e tecidos). Mais de 1.000 recursos foram detectados através das amostras analisadas [4]. Um perfil de seis metabolito foi sugerido para significar elevado risco de progressão do cancro e de diluição com isótopos análise adicional GC-MS sarcosina identificado como um potencial biomarcador urinário para o cancro da próstata agressivo. Lamentavelmente, sarcosina como um biomarcador (urinário ou plasma) no câncer de próstata não foi apoiada por vários estudos independentes, posteriormente, [5] – [15]. Além disso, apenas um punhado desses estudos tentaram executar perfil metabólico irrelevantes [6], [16], [17]. Nestes estudos subsequentes, a utilização de análise de mobilidade diferencial GC-MS ou (DMA) -ms fornecida cobertura ainda mais limitado de metabolitos, quando comparado com o estudo de Sreekumar

et ai

[4]. Assim, existe uma necessidade real de desenvolver uma plataforma metodológica e analítica robusta para facilitar os esforços futuros no perfil global do metaboloma na descoberta de câncer de próstata biomarcador [18].

A urina tem algumas vantagens para estudos metabolômica uma vez que tem uma grande abundância de metabólitos, baixo teor de proteína, é recolhido de forma não invasiva e requer preparação da amostra mínima antes da análise. Recentemente, a aplicação de alta resolução metabolômica urinário base (HR) MS ganhou popularidade no estudo de diagnóstico de câncer e descoberta de biomarcadores, especialmente em combinação com diversas técnicas de LC. HRMS mostra uma maior cobertura do perfil dos metabolitos do que outros métodos e a capacidade de identificar compostos potenciais biomarcadores [19] – [24]. A introdução de Cromatografia de Interacção Hidrofílico líquido (HILIC), em que o mecanismo de retenção é ortogonal para que de fase inversa (RP) Cromatografia líquida, oferece uma plataforma de separação adequado para os diversos metabolitos altamente polares na urina [25]. Em um estudo recente da bexiga e do cancro do rim biomarcadores [22], a análise multivariada combinada (MVA) e ortogonal mínimos quadrados parciais-discriminante Análise (OPLS-DA) dos dados obtidos a partir de RP e HILIC LC-HRMS mostrou 100% de precisão na segregação câncer e indivíduos saudáveis ​​correctamente.

a normalização de dados é considerado um passo essencial mas unstandardised em análise urinária humana [26]. Análise de Componentes Principais (PCA) parcelas de pontuação pode ser processado completamente diferente simplesmente dependendo do método de normalização utilizados, eo valor de biomarcadores candidatos pode ser invalidada pela escolha de um componente interno “errado” como referência. O sinal /nível de creatinina e de corrente total de iões (TIC) são comumente usados ​​como fatores de normalização na LC-HRMS base estudos perfil metabólico urinário [4], [20], [22], [24]. Warrack

et ai

introduzida uma nova estratégia de normalização com base nas MS Total de sinais úteis (MSTUS) que tinha correlação encorajador para os dados com base na normalização a osmolalidade urinária e recomendou a utilização de, pelo menos, dois métodos diferentes para assegurar a normalização estatisticamente significativa alterações no perfil dos metabolitos [27].

um protocolo utilizando uma combinação de GC-MS e LC-MS para realizar perfil metabólico do plasma e o soro foi recentemente descrito [28]. Ao contrário de urina não é necessária para normalizar os dados para as amostras de sangue derivadas de estudos em metabolômicos. Embora os protocolos detalhados utilizando GC-MS e LC-MS para o perfil do metaboloma urinária também foram relatados [29], [30] nenhum deles têm discutido ou métodos de normalização em relação a uma grande extensão. Além disso, a cobertura de metabolito por GC-MS é necessariamente limitada aos componentes voláteis. A combinação dos dois métodos LC ortogonais para profiling metabolômica só foi aplicado durante o período desde os protocolos descritos nas referências 28 e 30. Edifício no nosso trabalho anterior [25], temos aperfeiçoado ainda mais a nossa metodologia e análise gasoduto, e perfilados amostras de urina a partir de pacientes com cancro da próstata e urinas de controlo por LC-HRMS utilizando métodos de separação ortogonais. foi demonstrado o efeito de três métodos diferentes de normalização na análise de dados. Usando os resultados dos ensaios clínicos a capacidade discriminar de perfis metabolômica de urina no cancro da próstata relação foi avaliada usando ambos os modelos OPLS-DA e biomarcadores específicos. O estudo foi orientado pelos padrões de denúncia de precisão de diagnóstico (STARD) critérios [31] e a lista de verificação de avaliação podem ser encontrados em (S1 Arquivo).

Materiais e Métodos

Produtos Químicos e materiais

acetonitrilo de grau HPLC (ACN) foi comprado de Fisher Scientific, Reino Unido. água de qualidade para HPLC foi produzido por um Direct-Q 3 Sistema de água ultrapura da Millipore, Reino Unido. ácido fórmico AnalaR grau (98%) foi obtido a partir de BDH-Merck, Reino Unido. carbonato de amônio e acetato de amónio foram adquiridos de Sigma-Aldrich, Reino Unido.

Coleta de amostras

Todas as amostras estudadas foram obtidas com consentimento por escrito adequado de pacientes. A coleta de amostras foi aprovado pela ética Institutional Review Board (Joint da Universidade Chinesa de Hong Kong – Comitê de Ética em Pesquisa Clínica New Territories East Cluster). Os detalhes sobre a informação clínica relacionada ao paciente, incluindo parâmetros de cancro da próstata estão descritos na Tabela 1.

A preparação da amostra

As amostras de urina foram armazenadas a -30 ° C e descongeladas à temperatura ambiente antes preparação para análise por LC-MS. Para a análise, utilizando condições HILIC, 200 uL de urina foi completamente misturada com 800 ul de acetonitrilo, seguido por centrifugação a 3000 rotações por minuto (rpm) durante 5 minutos; 800 ul de sobrenadante foi então transferido para um tubo de ensaio de LC. Para as condições RP 200 uL de urina foi diluída com 800 ul de água num frasquinho de LC. A amostra colectiva foi preparada através da recolha de 100 ml de urina de cada amostra que foi então tratada como acima.

Medição da creatinina e osmolaridade

50 ul de amostras diluídas e preparadas soluções padrão de creatinina foram exaustivamente misturada com 100 ul de reagente de detecção de creatinina (Enzo Life Sciences, Reino Unido) em uma placa de 96 cavidades e a absorvância foi lida a 490 nm usando um espectros Max M5 a partir de Molecular Devices. As concentrações de creatinina nas amostras de teste foram calculados usando uma curva de calibração de 7 pontos, em que cada ponto foi medida em duplicado. Após a calibração com soluções padrão (Vitech Scientific Ltd., Reino Unido), medição de depressão de congelação-ponto para cada amostra foi realizada com um osmómetro (Advanced Micro, Modelo 3300), a fim de determinar a osmolalidade.

CL-EM aquisição de dados

as amostras foram colocadas aleatoriamente na bandeja do amostrador automático e do experimento de LC-MS foi realizada num sistema de HPLC Accela 600 combinado com um espectrômetro de massa Exactive (Orbitrap) da Thermo Fisher Scientific (Bremen, Alemanha). Uma coluna ZIC-pHILIC (150 x 4,6 mm, 5? M) e também uma coluna ACE C18-AR (150 x 4,6 mm, 5 um) (Hichrom, Reading UK) foram empregues para HILIC e separações RP, respectivamente. As fases móveis utilizadas em condições HILIC eram tampão de 20 mM de carbonato de amónio (pH 9,2) e ACN puro Sob condições RP 0,1% v v de ácido fórmico em água e 0,1% v /ácido /v fórmico foram usadas como fases móveis. Os perfis de gradiente de eluição HILIC e LC RP e as definições de parâmetros de MS foram descritos em nosso estudo anterior [25]. O MS selectiva

2 fragmentação de biomarcadores potenciais foi levada a cabo usando induzida por colisão de dissociação (CID) a 35 V, utilizando um sistema Surveyor HPLC combinada com um espectrómetro de massa LTQ-Orbitrap da Thermo Fisher Scientific (Bremen, Alemanha).

LC-MS processamento de dados por MZMine 2.10 [32]

Os dados brutos foi dividida em um único conjunto de dados ESI positivo e negativo, e também convertidos para o formato mzML usando ProteoWizard. O procedimento e as configurações de cada passo usado em MZMine 2.10 são descritos em S2 Arquivo. Aqui foi introduzida a estratégia de usar os dados de amostras reunidas para filtrar variações biológicas técnicas e independentes do conjunto de dados. As cinco amostras reunidas foram preparados juntamente com amostras de teste e que foram medidos como controlos de qualidade (CQs) periodicamente ao longo de toda a experiência de LC-MS. Um deles foi injetada três vezes e o resto foram injectados apenas uma vez, portanto, 7 conjuntos de dados de QC foram adquiridas para avaliar a estabilidade do sistema e para gerar um filtro de repetibilidade. As características que não apresentem em todos os conjuntos de dados 7 QC foram removidos porque eles ou eram causados ​​pela variação da preparação da amostra ou pelo sistema de LC-MS, durante a aquisição de dados. Com base nesta lista de pico filtrada, os dados de ensaios individuais foram alinhados e todos os recursos não correspondentes com a lista de pico amostra colectiva foram removidos. Recursos dentro do conjunto de dados QC estão incluídos somente se eles são observados em 75% das amostras de ensaio. Finalmente, as características com um desvio padrão relativo (RSD) para a área do pico inferior a 25% dentro dos QCs foram utilizados para análise dos dados.

Normalização

Para o método de creatinina ou da pressão osmótica normalização, a área do pico de cada função numa amostra foi escalado para a concentração de creatinina ou a osmolalidade da amostra. Para o método MSTUS em cada combinação de condição LC e modo de ESI, as áreas dos picos de todos os recursos que se manteve através dos três filtros foram somados e, em seguida, foram substituídas por suas percentagens do valor total.

multivariada /análise estatística

SIMCA-P 13 (Umetrics, Suécia) foi usado para realizar todas MVA. Antes de PCA e OPLS-DA, os dados foram-média centrado e variância unitária (UV) dimensionado. Pareto de escala também foi tentado, mas os modelos gerados foram dominados por algumas características com grandes valores normalizados (por exemplo, creatinina e o dímero de ureia). Assim, considerando o facto de que, na busca de biomarcadores todas as características são biologicamente iguais e que a maior parte do ruído foi removido por os filtros, foi utilizado o dimensionamento UV. Os valores de p foram calculados pelos dois Student cauda

t

teste (Microsoft Office 2010). O teste ROC foi realizada pela IBM SPSS Statistics 21.

Resultados e Discussão

LC-HRMS avaliação e validação método

perfil metabolômica não segmentados com base em dois métodos de separação LC ortogonal foi executada [33]: uma coluna de ZIC-pHILIC com um pH da fase móvel a 9,2 para o método de HILIC e uma ACE coluna C18-AR com um pH da fase móvel a 2,6 para o método de RP, referido daqui em diante como “ZIC-pHILIC” e ” RP “respectivamente. A fim de analisar a complementaridade entre estes dois métodos de LC ortogonais alguns metabólitos padrão foram medidos junto com as amostras em cada condição LC. Como mostrado no nosso estudo anterior alanina e p-alanina podem ser separados sob as condições de ZIC-pHILIC [25]. Aqui uma separação clara da sarcosina isômeros, que foi previamente sugerido como marcador de câncer de próstata, alanina e β-alanina também foi alcançada em condições ZIC-pHILIC mas todos eles eluída ao volume morto da coluna sob condições RP (Figura S1 e S2 em Arquivo S3). Os dados brutos LC-HRMS foram processados ​​por MZMine 2,10 tal como descrito na secção experimental. A Tabela 2 mostra o número de recursos remanescentes depois de cada filtro e as suas percentagens baseadas no características originalmente detectados. O filtro de repetibilidade amostra colectiva efetivamente removido mais de 75% dos recursos detectadas, a maioria dos quais se originou a partir de ruído do sistema LC-HRMS e sinais de fundo. O número de recursos foram diminuiu modestamente através do filtro de 25% em falta, que removido compostos biológicos que foram muito variável nas amostras. Através das características de filtro RSD da área de pico com grandes variações de área de pico pode ser removido. Tais características são geralmente devido a respostas MS baixos ou pobres formas dos picos cromatográficos. Aproximadamente 5.200 características no total destes três sobreviveram filtros e foram reunidas em conjunto, como um conjunto de dados global para multivariada e análise estatística.

A estabilidade do sistema de LC-HRMS foi verificada comparando as massas exactas (± 3 ppm) e retenção vezes (± 0,5 min) de compostos presentes na urina em relação a padrões autênticos: 42 e 51 características foram pareados com as normas em condições ZIC-pHILIC em ESI modos positivos e negativos, respectivamente, e 39 e 34 recursos foram atribuídos sob condições RP. A estabilidade do sistema foi monitorizada no que diz respeito à variação no tempo de retenção, e a área do pico de massa precisão destes metabolitos identificados em 7 amostras de QC sob cada condição LC-HRMS (S3 do ficheiro). Após o processamento MZMine, a maior parte dos metabolitos normais combinados presentes nas amostras mostraram extremamente baixas RSD para a precisão de massa ( 1 ppm) e tempo de retenção ( 1%). Apenas alguns deles apresentaram grandes variações para a área do pico ( 25%) por causa de suas respostas baixos MS; estes foram excluídos pelo filtro 25% RSD. Tendo desenvolvido a metodologia de filtragem de dados estes filtros foram em seguida aplicada aos dados a partir das amostras de 30 pacientes e 30 de controlo. Os recursos restantes após a aplicação dos filtros foram depois tratados posteriormente.

Normalização e multivariada /estatística análise

Atualmente, não há consenso sobre o método (s) de normalização em estudos de urina metabolômica. Foram aplicados três métodos de normalização independentes e as correspondentes parcelas de pontuação PCA são apresentados na Figura 1. Dada a diversidade no estilo de vida entre sujeitos, sem supervisão MVA não separar as amostras dos grupos e controlo do cancro. Além disso pôde ser observada qualquer semelhança entre as estruturas padrão que é refletido pelo completamente diferentes direcções e distâncias (vetores) com base em uma amostra (em forma de diamante) referenciados em três outras amostras (em forma de 4 pontos da estrela, estrela de 5 pontos e triângulo invertido), em cada padrão. A soma do primeiro e do segundo componentes principais é inferior a 30% para cada modelo reflectindo a fraca correlação entre as variáveis ​​(características) no conjunto de dados. É importante ressaltar que em todos os quatro modelos de PCA, os 7 QC recursos (em verde) estão próximos uns aos outros como um cluster no meio do padrão, confirmando a excelente estabilidade do sistema por toda parte. Como um método MVA supervisionado, OPLS-DA foi capaz de grupos de estudo separados de acordo com critérios pré-definidos biológicos [22], [34]. Neste estudo, o teste de definir 5 indivíduos com câncer, incluindo 3 na fase inicial (T1N0M0) e 5 controles foram retirados de cada grupo modelos .A OPLS-DA foram construídos usando as amostras e controlo do cancro da próstata 25 restantes como um conjunto de treinamento usando dados normalizados utilizando os três métodos de normalização diferentes e dados não-normalizados. A Figura 2 mostra a discriminação do conjunto de treinamento ea previsão do conjunto de teste obtida pela aplicação OPLC-DA aos dados e dados da ONU normalizada normalizados utilizando três métodos diferentes. Muito claras separações entre dois grupos foram alcançados para a formação definida nos modelos gerados com os dados a seguir a normalização de creatinina e MSTUS. Apenas um cancro e uma amostra de controlo cruzado ao longo da linha de separação no modelo gerado com o método osmolalidade e dados brutos. O valor da R2Y (cum), o que explica o poder discriminatório do modelo OPLS-DA, é mais do que 0,9 com creatinina e MSTUS normalização e 0,8 com a normalização da pressão osmótica, mas inferior a 0,7 com dados não-normalizados. O valor da Q2Y (cum), que é calculado pela 7-pasta de validação cruzada e capaz de indicar o poder preditivo do modelo, é de cerca de 0,3 para todos os métodos. Embora este valor não é tão elevada como esperado ( 0,5), todas as amostras no conjunto de teste foram correctamente previstos para todos os três métodos de normalização, excepto um modelo baseado no MSTUS. É interessante notar que, ao contrário dos modelos PCA os modelos OPLS-DA com diferentes fatores de normalização mostram estruturas padrão semelhante e isso ainda o caso com dados não-normalizados. Os vectores da mesma amostra para os outros três são muito semelhantes em todos os modelos OPLS-DA (Figura 2). Com base nas observações anteriores, parece que a estratégia de normalização afecta grandemente o resultado de o MVA não supervisionada mas não o supervisionado. No entanto, através da remoção do desvio da concentração de metabólitos introduzido por variação do volume de urina, a normalização melhora o desempenho do MVA supervisionado. O valor de importância variável para a projeção (VIP) indica o fator de impacto da variável ao modelo. Geralmente uma variável é considerada importante para o modelo, se o seu valor é VIP 1. No geral 406 características únicas com valores VIP 2 foram selecionados de todos os três modelos OPLS-DA. Verificou-se que 76 eram comuns em todos os três modelos, 89 estavam em quaisquer dois modelos e 241 eram de apenas um modelo (Figura S1 no ficheiro S4). Essas características comuns em três modelos apresentaram os maiores valores VIP média em comparação com os mais comuns em dois, ou apenas em um modelo e eles incluíram 80% dos 10 melhores recursos no valor VIP de cada modelo e os 20% restantes podem ser encontradas no grupo que era comum em dois modelos. Conforme recomendado pelo Warrack

et al

[27], a fim de assegurar a fiabilidade dos biomarcadores nos concentramos sobre os recursos VIP que eram comuns em três métodos de normalização. Este grupo incluiu muitas características que mostraram os mesmos valores de m /z, sob diferentes condições de LC ou foram detectados em ambos os modos de iões positivos e negativos com o mesmo tempo de retenção. Esta observação sugere que esses recursos poderiam ser atribuídos a metabólitos individuais que iria fazê-los mais confiável como biomarcadores genuínos. Student não pareado

t

e testes ROC foram realizadas para estas características em todas as amostras e os valores de p calculados e área sob a curva (AUC) obtidos por ROC são mostrados na Tabela S4 S1 em arquivo. Tal como esperado todas elas mostraram alta AUC ( 0,63) e os valores de P baixa ( 0,05) e os seus rácios entre as amostras de cancro e de controlo são também muito semelhantes um ao outro, sob diferentes condições de LC-HRMS com diferentes métodos de normalização que suporta a fiabilidade dos resultados. Algumas outras características podem também ser considerados como biomarcadores potenciais devido a resultados estatísticos significativos, embora fossem apenas presente em uma única condição LC-HRMS. A capacidade discriminativa da sarcosina para câncer de próstata também foi avaliada (Tabela S1 no arquivo S3); de acordo com vários relatórios anteriores, não houve diferença significativa no nível de sarcosina entre os grupos e controlo do cancro [6], [8] -. [10], [12], [15]

assuntos cancerosas são marcado em vermelho, controla em azul e QCs em verde. O vector de diamante para estrela de 5 pontos é rotulado de preto, a estrela de 4 pontos em verde e triângulo invertido em roxo. (A-C) Normalização de creatinina, MSTUS e osmolaridade, respectivamente. (D) de dados brutos sem normalização.

assuntos câncer são em forma de quadrados e controles como círculos. O conjunto de treino é marcado em vermelho cheio eo teste ajustadas no azul oco. Os quatro temas selecionados e os vetores são iguais em forma e cor como Figura 1.

Identificação de um painel de biomarcador potencial

Todos os recursos utilizados na MVA foram pesquisados ​​em massa exata com um janela de tolerância de 3 ppm contra uma biblioteca in-house metabólito [25]. 1673 e 1159 os recursos foram supostamente identificados como metabolitos ou sinais relacionados com menos de ZIC-pHILIC e condições RP respectivamente. Os resultados de identificação em formato Excel pode ser baixado do nosso site: https://www.metabolomics.strath.ac.uk e pessoas que desejam compartilhar arquivos de dados brutos são bem-vindos para nos contactar. Os biomarcadores em Arquivo S4 foram distribuídos com sucesso em metabolitos genuíno, mas alguns deles com vários isómeros. Para finalizar a identidade dos biomarcadores um experimento MS

2 foi realizado. Uma característica mencionada na Tabela S1 no arquivo S4 (145,062 m /z em ESI negativo e 147,076 m /z em modo positivo ESI) foi atribuído a fórmula C

5H

10N

2O

3 com massa erro inferior a 1 ppm. Três isómeros podem ser atribuídos a esta fórmula na HMDB. Estas são a glutamina, o ácido isobutírico e ureido alanylglycine. Como pode ser visto na Figura 3A a característica interessante refere-se a Pico B nos cromatogramas iónicos extraídos. MS por

2 Análise de picos A e C mostrou o mesmo padrão de fragmentação que pode ser explicado como se mostra na Figura 3B e foram identificados como glutamina por comparação com um padrão do espectro MS /MS no HMDB. Pico B mostrou um padrão de fragmentação completamente diferente e corresponde a ureido ácido isobutírico da interpretação dos espectros de MS

2. No espectro MS /MS padrão foi encontrado em qualquer banco de dados público. A fragmentação parece ser dirigida pelo grupo ureido na molécula (figura 3B). A ausência de um grupo amina livre reduz a polaridade da molécula o que explica a ordem de eluição oposta à da glutamina sob as duas condições de LC ortogonais (Figura 3A). Finalmente, verificando os dados brutos Pico A foi identificado como sendo devido a um fragmento em-fonte de alfa-N-fenilacetil-L-glutamina, que é um componente altamente abundante na urina humana. Alanylglycine pode corresponder à pequena pico antes e depois Peak B sob ZIC-pHILIC e condições RP respectivamente. No entanto, o seu sinal a nível MS 1 estava fraco demais para se obter confiança MS

2 fragmentação. Os biomarcadores potenciais finais e suas identidades, incluindo MS

2 de dados fragmentação, são mostrados na S5 Arquivo. Mais biomarcadores potenciais foram identificados nas condições ZIC-pHILIC do que em condições de RP. Foi interessante notar que houve alguns biomarcadores identificados a partir de, por exemplo, alimentos stachydrine e 3-hydroxystachydrine. A sua fiabilidade /autenticidade como biomarcadores foi naturalmente suspeita.

cromatogramas iónicos extraídas sob 4 condições diferentes LC-HRMS (A) e a interpretação dos seus

2 fragmentações MS (B).

de nossa revisão da literatura para o diagnóstico de câncer em metabolômica há estudos avaliaram a capacidade discriminativa de biomarcadores propostas em um único papel, testando amostras coletadas de forma completamente independente do estudo original. Foram realizadas análises em amostras de urina obtidas de 30 pacientes adicionais de câncer de próstata e compararam os dados contra as amostras de controlo analisados ​​anteriormente. Com base na metodologia óptima identificada acima destas 60 amostras foram comparadas apenas sob condições ZIC-pHILIC e os dados foram normalizados contra a concentração de creatinina. Na comparação entre os controlos e as amostras de cancro da próstata recolhidos independentemente 14 dos 33 marcadores foram abaixo do limiar de 0,05 P-valor incluindo ureido ácido isobutírico que tiveram resultados estatísticos quase idênticas em ambos os modos de ES1 positivos e negativos (Tabela 3). Alguns dos metabólitos alimentos não apresentando diferença significativa entre câncer e grupos saudáveis. Quatro dos 14 biomarcadores validados foram identificados com confiança como ureido isobutírico ácido, indolylacryloyglycine, acetylvanilalinine e 2-oxoglutarato todos os quais não foram relatados na metabólito anterior profiling estudos de câncer de próstata.

Com base em o total de 90 indivíduos (60 cancer vs 30 controles) o poder de diagnóstico para câncer de próstata foi avaliada por um teste de ROC para cada um deles, bem como por seu poder combinado. A área do pico foi dimensionado de UV e, se o nível do biomarcador foi maior no grupo do cancro do que no grupo saudável, ele seria tratado como influência positiva e inferior como influência negativa. O valor de AUC gerado para os biomarcadores combinados foi de 0,896 e a sensibilidade e a especificidade foram também melhoradas com o melhor ponto de corte em comparação com outros biomarcadores individuais (Figura 4. A eficácia de diagnóstico pode ser melhorada ainda mais através da inclusão de mais biomarcadores individuais, mas, devido à sua identificação putativa que não foram incluídos na combinação. em geral, a utilização do painel de biomarcador combinado é comparável à utilização de testes de PSA (AUC em 0,94). com refinamento futuro, um tal painel pode ser de uso clínico, quer isoladamente ou em combinação com a própria PSA. Devido à limitação do número de indivíduos medidos neste estudo e a incerteza sobre o significado de alguns biomarcadores significativos seleccionados entre mais de mil recursos, mais uma validação do painel e os biomarcadores específicos serão realizados com mais disciplinas e os dados serão de acesso público em nosso site:. https://www.metabolomics.strath.ac.uk

os quatro biomarcadores identificados não estão ligados de uma forma óbvia, embora individualmente eles têm algum fundo bioquímica interessante como biomarcadores de outras condições médicas. ácido Ureidoisobutyric (Uiba) está bem estabelecida como um marcador na urina de um erro inato do metabolismo devido a deficiência ureidopropionase onde os seus níveis são elevados [35]. No caso atual seus níveis são mais baixos em doentes com cancro da próstata. Uiba é um metabólito da timidina base de DNA. Uiba é também um produto de degradação de ADN derivada da degradação oxidativa da timidina e tais bases danificadas são removidos a partir de ADN pela enzima glicosilase de ADN de reparação [36] – [38]. Se não remover esses resíduos podem resultar em mutações sendo formado durante a replicação devido ao emparelhamento de base incorreta com o sítio danificado. Níveis mais baixos de Uiba pode apontar para taxas reduzidas de reparação da excisão.

Indoylacroylglycine (IAG) tem sido proposta como um marcador para o autismo em crianças. A sua origem é claro, embora tenha sido proposto que ele é produzido pela transformação metabólica do triptofano pela microflora intestinal. No entanto, tem sido demonstrado que os seus níveis de flutuar na urina humana de acordo com a época do ano e níveis mais altos podem dizer respeito ao aumento da exposição à luz UV. A este respeito, é análogo ao ácido urocânico, que é produzido a partir de histidina em resposta à radiação UV [39].

N-acetylvanilalinine (AVA) foi monitorizada na urina para a detecção de um erro inato do metabolismo rara devido à deficiência aromático descarboxilase de aminoácidos (AAD) [40]. No grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 3, há um marcador não identificado (268,083 m /z, modo negativo), que, como AVA é altamente elevados em doentes com cancro da próstata. Este marcador difere em composição elementar por um átomo de oxigênio da AVA sugerindo que poderia ser hidroxilado AVA.

Conclusões

O presente estudo estabeleceu um protocolo simples e robusta para o rastreio de urina de biomarcadores usando ortogonal os métodos de LC em conjunto com HRMS. Um protocolo de extração de dados com base em MZmine foi criado para remover variações técnicas e biologicamente não-relacionados. Aplicando o método desenvolvido foi realizado com sucesso um estudo preliminar sobre metabolômica urinário para o diagnóstico de câncer de próstata e descoberta de biomarcadores. Em comparação com estudos anteriores muito mais abrangente perfil metabólico foi conseguido através do emprego de dois métodos de LC ortogonais combinados com HRMS que proporcionou uma maior oportunidade para descobrir mais potenciais biomarcadores.