Abstract

Objectivo

investigamos o papel prognóstico da relação de pré-tratamento entre Tipo 1 (M1) e tipo 2 (M2) macrófagos associados a tumores (TAMs) no colo uterino localmente avançado pacientes com câncer (LACC) tratados com quimioradioterapia (CT /RT).

Métodos

84 pacientes LACC consecutivos tratados com CT baseada em cisplatina /RT para uma dose total de 50,0 Gy, seguido de radical cirurgia foram analisadas. Duplo-coloração imuno-histoquímica de CD163 /p-STAT, CD68 /pSTAT1, CD163 /C-MAF, e CD68 /C-MAF foi realizada em amostras tumorais tomadas no momento do diagnóstico. TAM com CD163 + pSTAT1 + ou CD68 + pSTAT1 + foram definidos M1; CD163 + C-MAF + ou CD68 + C-MAF + definido o fenótipo M2. O número de células M1 e M2 foi contado a baixa ampliação por meio da avaliação para cada caso, a mesma área do tumor. A relação entre M1 e M2 (M1 /M2) foi finalmente calculada.

Resultados

No momento do diagnóstico, observou-se uma correlação direta entre o número de monócitos circulantes e da TAM (valor-p = 0,001). Pacientes com alta M1 /​​M2 experientes com mais frequência de resposta patológica completa (sem tumor residual) para CT /RT, em comparação com os casos com baixo M1 /​​M2 (55,0% vs 29,5%; p = 0,029). Na análise multivariada M1 /​​M2 (OR = 2,067; p = 0,037) emergiu como preditor independente de resposta patológica à TC /RT. Mulheres com alta M1 /​​M2 mostrou a 5 anos mais livre de doença (67,2% vs. 44,3%; p = 0,019), e 5-anos geral (69,3% vs. 46,9%; p = 0,037) sobrevivência , em comparação com os casos com baixo M1 /​​M2. A presença de um elevado rácio de M1 /​​M2 foi independentemente associada com um resultado desfavorável de sobrevivência na análise multivariada.

Conclusões

polarização da TAM em direção a um fenótipo M2, como refletido por um menor M1 /​​M2 ratio, é um preditor independente de má resposta ao CT /RT e menor sobrevida em LACC

Citation:. Petrillo M, Zannoni GF, Martinelli e, Pedone anchora L, Ferrandina G, Tropeano G, et al. (2015) Polarização da Tumor-Associated macrófagos em direção M2 Fenótipo correlaciona-se com má resposta à quimioradioterapia e reduziu a sobrevivência em pacientes com cancro do colo localmente avançada. PLoS ONE 10 (9): e0136654. doi: 10.1371 /journal.pone.0136654

editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ‘, ITALY

Recebido: 03 de dezembro de 2014; Aceito: 06 de agosto de 2015; Publicação: 03 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Petrillo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar das conquistas relevantes no campo da prevenção primária e secundária, o cancro do colo do útero ainda representa a segunda neoplasia maligna mais comum em mulheres jovens [1]. Além disso, mesmo nos países desenvolvidos, a proporção de pacientes com doença localmente avançada manteve-se estável na última década [2]. De um ponto de vista terapêutico, exclusivo chemoradiation concomitante (CT /RT) tem sido reconhecida como o tratamento padrão para pacientes com câncer localmente avançado do colo do útero (LACC) [3-8]. Por outro lado, outras estratégias de investigação que empregam cirurgia conclusão após a quimioterapia ou CT /RT também têm sido exploradas com o objectivo de melhorar a sobrevivência [9-12]. No entanto, independentemente de a estratégia de tratamento adoptado, aproximadamente 30% das mulheres com recaída LACC e morrem da doença.

Por estas razões, dada a grande variabilidade em termos de resultados de sobrevivência e de resposta para a CT /RT, existe uma demanda crescente de marcadores prognósticos fiáveis, capazes de ajudar os médicos no desenvolvimento de abordagens terapêuticas mais específicas.

neste contexto, um aumento de pré-tratamento contagem de monócitos circulantes foi recentemente reconhecido como um preditor de mau prognóstico em pacientes com LACC células escamosas [13]. Estes resultados sugerem fortemente o papel relevante na progressão do cancro do colo do útero do recrutamento e diferenciação de monócitos circulantes em macrófagos associados a tumores (TAMs). Além disso, é bem conhecido que a TAM são uma população muito complexo que consiste de dois fenótipos, cada um com funções específicas no microambiente tumoral [14]. Quando activado pelo interferon-γ (IFN-γ) ou factor de necrose tumoral α (TNFa), Tipo 1 (M1) TAM promover as respostas imunitárias inflamatórias, aumentando a capacidade de apresentação de antigénio e induzir a imunidade Th1 através da produção de citocinas tais como IL-12 [ ,,,0],15]. Por outro, a produção por Tipo 2 (M2) TAMs de TGF, PGE2 e as citocinas imunossupressoras IL-10 contribui para uma supressão geral das actividades antitumoral [16,17]. Apesar destas evidências biológicas interessantes, o papel clínico do tipo 1 (M1), e tipo 2 (M2) MAT em mulheres com LACC continua a ser estabelecida. Por estas razões, aqui vamos investigar o papel prognóstico do M1 e M2 TAM em uma grande série de pacientes submetidos à LACC CT /RT seguida de cirurgia radical.

Pacientes e Métodos

Pacientes e Tratamento

Entre março de 2009 e dezembro de 2011, 84 mulheres com LACC foram admitidos (at) à Oncologia ginecológica Unidades da Universidade Católica de Roma. As características clínico-patológicas da população do estudo foram resumidos na Tabela 1. Todos os pacientes incluídos no estudo mostrou: carcinoma comprovada por biópsia do colo do útero (estágio IIB-IV), sem evidência de doença fora da pelve, Eastern Cooperative Oncology Group Status 2, função renal e hepática adequada, nenhum caso de câncer antes que não carcinoma basocelular. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento concordando em ser apresentado a todos os procedimentos descritos, e para os seus dados clínicos a ser prospectivamente coletadas e analisadas para fins científicos. O estudo recebeu a aprovação do Comitê de Ética da Universidade Católica do Sagrado Coração. Pré-tratamento de trabalho de incluída coleção de história clínica, exame clínico, radiografia de tórax, ressonância magnética abdominopelvic (MRI), hemograma e medição da função hepática e renal, cistoscopia e proctoscopia em caso de suspeita clínica de bexiga e /ou reto invasão. Os resultados da contagem de monócitos de sangue realizada no momento de pré-tratamento de trabalho acima foram recuperados e analisados ​​no presente estudo. Neoadjuvante CT /RT foi administrada como se segue: a irradiação pélvica todo em 25 fracções (2,0 Gy /dia, em semanas 1-2, 5-6, 9, num total de 50 Gy) em combinação com cisplatina (20 mg /m

2 , 2-h de infusão intravenosa) e 5-fluorouracilo (1000 mg /m

2, 24 h de infusão intravenosa contínua), tanto nos dias 1-4, a cada 4 semanas, durante 3 ciclos [18]. Todos os casos foram submetidos sete /oito semanas após o fim da concomitante CT /RT à histerectomia radical e linfadenectomia pélvica ± aórtica. Após a cirurgia, os pacientes foram submetidos a procedimentos de acompanhamento de rotina. resposta patológica para CT /RT foi definida: completa na ausência de qualquer tumor residual após o tratamento (PR0), microscópico (pR1) na presença de apenas focos de tumor microscópico (dimensão ≤ 3 mm no máximo), e macroscópico (pR2) quando observamos a persistência de tumor residual . 3 mm em dimensão máxima [19]

imuno-histoquímica Avaliação da TAM

Como publicado recentemente, foi utilizada a expressão de pSTAT1 e c-MAF na contexto do CD68 ou CD163 para caracterizar o

in situ

polarização da TAM [20]. Em particular, M1 fenótipo foi definida como a expressão concomitante de PSTAT e CD68, ou PSTAT e CD163; enquanto TAM com M2 fenótipo foram identificados utilizando a combinação de c-MAF e CD68 ou c-MAF e CD163 [20].

imuno coloração dupla de CD163 /pSTAT1, CD68 /pstat, CD163 /c-MAF , CD68 /c-MAF foram realizados em (FFPE) amostras de câncer fixadas em formalina, embebidos em parafina cervicais tomadas no momento do diagnóstico, antes do início do CT /RT. Três secções de tecido uM parafina montado em poli-L-lisina- lâminas revestidas e secou-se a 37 ° C durante a noite foram usados. Os cortes foram tomadas áreas formulário FFPE mostrando uma distribuição homogénea e grande quantidade de tecido de câncer cobrindo quase todo o slide. As lâminas foram deparaffinised em xileno e re-hidratados, convencionalmente, a peroxidase endógena foi bloqueada com 3% H

2O

2 em H

2O durante 5 min. processo de recuperação de antigénio foi realizada por aquecimento em forno de microondas de EDTA pH 8 (2 vezes durante 4 min.). Para reduzir a ligação não específica, as secções foram incubadas com soro de cabra normal a 20% durante 30 min à temperatura ambiente. As células que expressam CD68 ou CD163 foram identificados após 1 h de incubação à temperatura ambiente, utilizando o anticorpo monoclonal anti-humano CD163 (01:50; clone10D6; BIOCARE), e o anticorpo monoclonal anti-humano CD68 (01:50; PG-clone M1; DAKO), respectivamente . A detecção foi realizada utilizando um polímero marcado En Vision rato + System-HRP (DAKO, Carpinteria, CA, EUA), 30 min à temperatura ambiente. Diaminobenzidina foi utilizada como um (sistema de substrato DAB, Dako) cromogénio. Posteriormente, as lâminas foram lavadas (TBS1X Ph7,5) durante 5 minutos e diluiu-se apropriadamente C-MAF (anti-humano policlonal C-MAF; 1:50; Santa Cruz) ou anticorpos anti-humanos (pSTAT1 policlonais PSTAT; 1:50; Santa Cruz) foram incubadas durante a noite a 4 ° C. A detecção foi realizada utilizando um polímero marcado En Vision coelho + Sistema-AP (DAKO, Carpinteria, CA, EUA), 30 min à temperatura ambiente. Vermelho rápido foi utilizado como um cromogénio (SRL diagnóstico UCS). As secções foram contrastadas com hematoxilina e montadas com Glycergel (DAKO). O número de marcadas macrófagos M1 e M2 foi contado manualmente por dois pesquisadores diferentes (GFZ; EM) sem qualquer conhecimento prévio dos parâmetros clínicos e biológicos, a baixa ampliação (5x lente objetiva) através da avaliação para cada caso a mesma área do tumor que consiste em dez campos de alta potência representativas (ampliação 400x) de secções de tecido. Finalmente foi calculada a relação M1 /​​M2.

Análise Estatística

modelo de regressão linear foi utilizada para investigar o papel das variáveis ​​clínico-patológicas como preditores de doença residual após o CT /RT. A sobrevida global (OS) e sobrevida livre de doença (DFS) foram calculados a partir da data do diagnóstico até a data da morte /recorrência ou data da última visita de acompanhamento, de acordo com a M1, M2 e os níveis de M1 /​​M2. Medianas e tabelas de vida de acordo com os níveis de TAMs foram calculados utilizando a estimativa do produto-limite pelo método de Kaplan e Meier, eo teste de log-rank foi utilizado para avaliar a significância estatística [21,22]. Todos os cálculos estatísticos foram realizados utilizando o Statistical Package for Social Sciences (versão 17.0, SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

Resultados

As características clínico-patológicas de toda a série tem foram resumidos na Tabela 1. Sessenta e oito pacientes (82,1%) apresentaram estágio FIGO IB2 /IIB, enquanto que 16 casos (17,9%) tinha estadio III-IV. A grande maioria das mulheres (84,5%) mostraram uma histotipo escamosas e resposta patológica completa para CT /RT foi documentada em 35 pacientes (41,6%). O número mediano de TAM detectados na análise imuno-histoquímica em biópsias tumorais tomadas no momento do diagnóstico foi de 12 (0-46), e o número médio de M1 e M2 macrófagos era igual representando 5 (Tabela 1). Calculou-se a razão entre o número de M1 e M2 para cada paciente, e o valor médio foi de 0.600, variando de 0 a 19. contagem de monócitos mediano na avaliação da linha de base era de 490 /ul (230-1180), e o número de monócitos circulantes mostrou direcionar correlação estatisticamente significativa com o número de TAMs (valor-p = 0,001; Fig 1).

círculos vazios representam o número de TAMs e circulando monócitos em cada paciente, de tendência linear foi também forneceu (

p valor

, e

X

2

foram calculados aplicando modelo de regressão linear).

Os valores medianos de M1, M2 e M1 /M2 foram utilizados como limiares para identificar pacientes com níveis baixo e alto. Exemplos representativos de casos com níveis elevados de M1 e M2 foram fornecidos na Fig 2A e 2B.

Como se mostra na Tabela 1, há diferenças foram documentados em termos de características clínico-patológico entre mulheres com uma alta baixo M1 /​​M2. No entanto, a percentagem de mulheres que mostram PR0 após CT /RT foi quase o dobro no grupo de pacientes com alta M1 /​​M2 em comparação com casos com níveis baixos de a proporção (55,0% versus 29,5%; p = 0,029). Na análise univariada /multivariada, histotipo escamosas (OR = 2,120; p = 0,028) e níveis elevados da M1 /​​M2 (OR = 2,067; p = 0,037) rácio emergiram como os únicos preditores independentes de PR0 (Tabela 2).

Análise de Sobrevivência

em junho de 2014, a duração média do acompanhamento foi de 28 meses (7-107) na série global. Recorrência e morte por doença foram observadas em 21 e 20 pacientes, respectivamente

As mulheres com níveis elevados M1 mostrou uma mais 5 anos DFS (79,7% vs 51,3%; p = 0,450)., E 5- oS anos (74,7% vs 49,0%, p = 0,249; Fig 2C) comparada aos casos com baixos níveis de M1, mas essas diferenças não atingiram significância estatística. Por outro lado, a presença de um número elevado de M2 ​​foi associada com um menor 5-anos DFS (54,3% versus 64,8%; p = 0,067), e OS (51,9% versus 60,3%, p-valor = 0,236) , mas, novamente, as diferenças não foram estatisticamente significativas (Fig 2D).

Dado o impacto oposto sobre a sobrevivência da M1 e M2 fenótipos, focamos nossa atenção no papel prognóstico da relação M1 /​​M2. 5-anos DFS foi significativamente mais elevada em mulheres com M1 /​​M2, em comparação com casos com predominância de M2 ​​(isto é, baixo M1 /​​M2) (67,2% versus 44,3%; p = 0,019; Figura 3A). De igual modo, a presença de um alto M1 /​​M2 foi associada com um prolongado 5-yars OS em comparação com casos com baixo M1 /​​M2 (69,3% versus 46,9%; p = 0,037; Figura 3B). Com o objectivo de analisar o papel prognóstico independente da TAM polarização, foi aplicado modelo de regressão de Cox aos dados de sobrevivência. Tanto na análise uni e multivariada, os níveis de relação M1 /​​M2 (DFS: HR = 0,233, p = 0,028; OS: HR = 0,245; p = 0,030), bem como a contagem de monócitos linha de base (DFS: HR = 1.462, p = 0,043; OS:. HR = 1,181; p = 0,041) foram independentemente associados com um DFS reduzida, e OS (Tabela 3)

Discussão

Após o advento do CT /RT avanços relevantes foram alcançados no prognóstico de LACC. No entanto, ainda existe uma coorte de mulheres com sobrevivência reduzida devido à presença de células de tumor resistentes à quimioterapia e terapia de radiação.

Recentemente, os resultados de uma análise retrospectiva conduzida de uma grande série de mulheres com doença localmente avançado demonstraram que o pré-tratamento elevada contagem de monócitos em circulação é um factor de prognóstico negativo independente e pode ser utilizado como biomarcador adjuvante à SCC-antigénio [13]. No nosso estudo, que confirmaram estes resultados (Tabela 3), demonstrando pela primeira vez a existência de uma correlação significativa entre a contagem inicial de monócitos e o número de TAM em amostras de tumor tomadas no momento do diagnóstico (Fig 1) circulante. Estes resultados apoiam fortemente a existência de um monócito /TAM eixo de circulação, que actua na regulação da progressão do cancro do colo do útero [23].

é bem conhecido que o microambiente do tumor representa uma importante fonte de quimiocinas, que conduzir a extravasamento de monócitos circulantes no local do tumor [23]. Depois de atingir o tecido maligno, uma rede complexa de citocinas, incluindo IL-4, IL-10 e IL-13, induz a diferenciação de monócitos em M1, M2 e MAT [23]. Neste contexto, nosso estudo representa a primeira avaliação do papel clínico da M1, M2 e TAM em pacientes com LACC.

Em primeiro lugar, nós relatamos em nosso estudo uma relação entre M1 e M2 de 0,600, sugerindo que no momento do diagnóstico do microambiente do tumor é polarizada principalmente em direção a um fenótipo M2. Estes dados estão de acordo com evidências convincentes que sugerem que os macrófagos M2 estão envolvidos no processo de desenvolvimento de câncer em várias neoplasias humanas, incluindo câncer cervical [14]. Mecanismos pelos quais isso ocorre ainda não estão claros de modo mais estudos para investigar e esclarecer-lhes são desejáveis.

Além disso, observou-se que a percentagem de mulheres que mostram PR0 após CT /RT é quase o dobro em pacientes com alta M1 /M2 em comparação com os casos com uma baixa M1 /​​M2, e relação entre M1 e M2 macrófagos representa um preditor independente de PR0. Esses dados enfatizam que a diferenciação de TAM para um fenótipo M2 pode promover o desenvolvimento de resistência a CT /RT em pacientes LACC. Nossos resultados são fortemente apoiadas por evidências recentes, que sugerem que a inflamação promove a diferenciação de macrófagos M2, que em última análise conduzir a resistência aos agentes de platina em linhas celulares de cancro do colo do útero [24].

Com foco na sobrevivência, não observamos uma correlação entre o número total de TAM e sobrevivência (Tabela 3). Estes resultados podem ser facilmente explicado considerando que a população de TAM consiste de pelo menos dois subtipos de macrófagos com funções opostas [14]. Na verdade, a presença de um número elevado de M1 foi associada com uma tendência não significativa para uma sobrevivência mais longo, enquanto que o aumento dos níveis M2 foram associados com uma sobrevivência mais curto, mais uma vez sem atingir significância estatística (fig 2C e 2D). Por outro lado, a relação entre os níveis de M1 e M2 emergiu claramente como um factor independente relevante muito interessante prognóstico negativo, com um aumento de cerca de 20% de 5-anos DFS e OS em mulheres com nível elevado de M1 /​​M2. Recentemente, na presença de uma forte infiltração intra-epitelial de macrófagos M1 tem sido associada com um grande influxo de linfócitos T e uma sobrevivência melhorada no cancro do colo do útero [25]. De acordo com estes

in vitro

evidências, nossos resultados fornecem a primeira demonstração clínica de que, (em vez) mais do que o número total de células M1 e M2, a polarização da TAM em direção a um fenótipo específico determina as características biológicas do tumor e prognóstico do paciente.

de um ponto de vista clínico, isto tem que ser considerado que um aumento do número de TAM tem sido associada com uma maior densidade de microvasos [26], e aumentado a produção de VEGF [27] no colo do útero pacientes com câncer. Portanto, será útil para investigar, no futuro, o impacto da polarização de TAM na angiogénese tumoral, particularmente após a introdução de bevacizumab no tratamento de doentes com cancro do colo do útero [28]. Estes resultados experimentais e clínicos nos levou a avaliar melhor os alvos potenciais que exibem potencial tumorigénico e imunossupressora relacionadas com macrófagos associados a tumores. Além disso, nossos resultados suportam outras avaliações pré-clínicos sobre a eficácia das drogas que alvejam TAM, tais como trabectedina, no cancro do colo do útero [29].

Nós reconhecemos que o nosso estudo representa uma das primeiras aplicações em doentes com cancro do colo do útero de uma abordagem imuno-histoquímica para determinar o

in situ

o número de M1 e M2 TAM; no entanto, a confiabilidade do nosso protocolo experimental é apoiado por evidências publicadas anteriormente [20]

Apesar da relevância potencial dos nossos dados várias limitações afetam nosso estudo:. pequeno tamanho da amostra, a abordagem não-padronizado da nossa experimental protocolo sugere que as futuras investigações prospectivas são necessários antes de tirar conclusões definitivas.

Em conclusão, nossos resultados demonstram que a polarização da TAM em direção a um fenótipo M2 no momento do diagnóstico, como refletido pela redução da relação entre M1 e M2 macrófagos, é um marcador muito interessante de má resposta ao CT /RT e menor sobrevida em mulheres com LACC. Nossos resultados enfatizam a necessidade de continuar as investigações experimentais com abordagem molecular, a fim de esclarecer o papel no cancro cervical dos subtipos específicos de TAM, incluindo também a população de Misturado M1 e M2 TAM, que foi recentemente demonstrado como envolvidos na promoção o crescimento do tumor no câncer colorretal [30].