Sumário

A interleucina (IL) -6 foi mostrado para ser um grande fator que contribui para o crescimento e progressão do câncer de ovário. A citocina exerce uma actividade pró-tumorigénico através da activação de várias vias de sinalização, em particular, transdutor de sinal e activador de transcrição (STAT3) e regulada por sinal extracelular quinase (ERK) 1/2. Assim, a segmentação IL-6 está se tornando cada vez mais atraente como uma opção de tratamento no câncer de ovário. Aqui, nós investigamos os efeitos da minociclina no IL-6 e suas vias de sinalização em câncer de ovário.

In vitro

, minociclina foi encontrado para suprimir significativamente tanto constitutiva e IL-1β ou 4-hydroxyestradiol (4-OH-E2) estimulada por expressão de IL-6 em células de cancro do ovário humano; OVCAR-3, SKOV-3 e Caov-3. Além disso, minociclina regulada negativamente dois componentes principais de IL-6 do sistema receptor (IL-6Ra e gp130) e bloqueou a activação da STAT3 e ERK1 /2 vias que conduzem à supressão do produto a jusante MCL-1. Em ratinhos nus do sexo feminino que ostentam intraperitoneais OVCAR-3 tumores, a administração aguda (4) e 24 h de minociclina (30 mg /kg) conduziu a uma supressão de IL-6. Mesmo uma dose única de minociclina foi eficaz na redução significativa de plasma e tumor níveis de IL-6. Em linha com esta expressão, p-tumoral da STAT3, P-ERK1 /2 e MCL-1 foram reduzidos em ratinhos tratados com minociclina. Avaliação da implicação funcional de minociclina na actividade metastática revelou a capacidade de minociclina para inibir a migração celular, invasão e adesão associada com a sub-regulação de metaloproteinases de matriz (MMP) -2 e 9. Deste modo, os dados sugerem um papel potencial para a minociclina em suprimindo a expressão da IL-6 e a actividade. Estes efeitos podem revelar-se um atributo importante para os próximos ensaios clínicos de minociclina no cancro do ovário

Citation:. Ataie-Kachoie P, Morris DL, Pourgholami MH (2013) minociclina Suprime Interleucina-6, o seu sistema Receptor e vias de sinalização e prejudica a migração, invasão e adesão capacidade das células do cancro do ovário: in vitro e in vivo. PLoS ONE 8 (4): e60817. doi: 10.1371 /journal.pone.0060817

editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Taiwan

Recebido: 28 de novembro de 2012; Aceito: 03 de março de 2013; Publicação: 08 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ataie-Kachoie et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de ovário é um tumor maligno ginecológica altamente letal para as quais prognóstico geral manteve-se fraca ao longo das últimas décadas [1]. Para explicar os mecanismos moleculares subjacentes envolvidos no desenvolvimento desta malignidade letal um número de teorias foram propostas até agora [1]. dados convincentes apoiar o envolvimento do microambiente inflamatório estromal, causada pela sobre-expressão de citocinas e quimiocinas na promoção da tumorigénese progressão do ovário e cancro [2]. Em particular, a IL-6 produzida pelo tumor e /ou células imunitárias activadas tem sido postulada como sendo uma citoquina chave funcional que altera as células tumorais através de mecanismos complexos comportamentos [3]. IL-6 é expressa por células epiteliais da superfície do ovário humanos primários e foi detectado profundamente superior no tecido do tumor [4], de plasma e de ascites malignas de pacientes de cancro do ovário [5]. IL-6 de expressão no microambiente do tumor do ovário pode impactar mecanismos de defesa imune do hospedeiro, bem como o crescimento de células de tumor, proliferação, diferenciação e angiogénese [6]. Além disso, induz a metástase através da regulação positiva das células cancerosas adesão e invasão capacidade [7]. Além disso, a IL-6 influencia o estado de doença clínica e de prognóstico, conferindo resistência a terapias convencionais [8], estimulando a formação de ascite maligna [9], e induzindo sintomas tais como anorexia, metabolismo de energia alterada, fadiga e anemia [10]. Dados recentes evidências de que o bloqueio da IL-6 pode oferecer uma estratégia terapêutica promissora para melhorar o manejo de pacientes com câncer de ovário. A inibição da sinalização de IL-6 tem sido mostrado para atenuar o crescimento do tumor e os eventos apoptóticos e metastáticos em doentes com cancro do ovário. É também resultou em períodos prolongados de estabilização da doença, a reversão de quimioresistência e amplificado a imunidade do hospedeiro em pacientes com cancro do ovário recorrente resistente à quimioterapia, [3].

IL-6 transmite o seu sinal através da interacção com um complexo receptor consistindo do ligando liga�o ao glicoproteína denominado IL-6R e gp130 do componente de transdução de sinal. Existem dois tipos de IL-6R, isto é, a membrana celular receptor IL-6 (IL-6Ra) com baixa afinidade que forma um complexo com a gp130 após a ligação com a IL-6 para iniciar o sinal intracelular (sinalização clássico), e um polímero solúvel do receptor de IL-6 (sIL-6R), que se liga à IL-6 e, em seguida, com o receptor de membrana da cadeia β – gp 130 que conduz à transdução de sinal (trans-sinalização) [11]. A transdução do sinal da IL-6, envolve a activação de diversas vias oncogénicos. Em particular, a STAT3 é fosforilada e activada em resposta a IL-6. Após a fosforilação, a STAT3 forma um dímero que é depois translocado para o núcleo para regular a expressão de vários genes que conduzem à indução de uma série de eventos, incluindo o crescimento de células de tumor, a sobrevivência e metástases. Além de STAT3, mitogénio activado proteína-quinases (MAPK) cascata também é activada em resposta a IL-6, o que leva a hiperfosforilação de uma série de proteínas incluindo ERK1 /2, que por sua vez, medeiam a activação de factores de transcrição com diversos efeitos sobre as células tumorais, incluindo a indução de sobrevivência, a migração e a capacidade de invasão [12].

Minociclina (7-dimetilamino-6-desoxytertracycline) é um antibiótico bem tolerado e seguro a partir da família das tetraciclinas de segunda geração. Para além da sua actividade antibiótica de largo espectro, minociclina é também reconhecido como um agente anti inflamatório. É utilizada clinicamente no tratamento de doenças com fundo inflamatório, tais como acne [13] e penfigóide bolhoso [14]. Além disso, a minociclina foi provado ser eficaz no tratamento de doenças auto-imunes tais como artrite reumatóide [15] e esclerodermia [16]. Os potentes actividades anti-inflamatórias e moduladores de células de minociclina são pensados ​​para ser mediado através da inibição de citoquinas pró-inflamatórias, tais como factor de necrose tumoral α [17] e IL-1β [18]; e supressão de MMPs [19]. De particular interesse, são os dados que mostram a supressão da IL-6 por minociclina em monócitos [20] e residente do sistema nervoso central ou células infiltrantes [21]. Este efeito inibidor também foi avaliado para a IL-6 aumento observado na dor neuropática [22]. Os dados experimentais usando várias linhas celulares de carcinoma e em modelos animais demonstrou também que a minociclina e um número de outras tetraciclinas e os seus derivados quimicamente modificados podem inibir o crescimento tumoral e metástase, suprimindo metaloproteinases de matriz e por um efeito directo sobre a proliferação celular. Os efeitos antitumorais destes agentes tem sido, até agora documentados em modelos pré-clínicos de leucemia [23], o melanoma [24], renal, da próstata [25] e do cancro da mama [26]. Nessa linha, temos comunicada recentemente os resultados preliminares que mostram que a minociclina inibe o crescimento de xenoenxertos de cancro do ovário humanos [27], [28] e também suprime o câncer de ovário induzida ascite maligna formação [28]. O reconhecimento dessas propriedades, juntamente com o farmacológico favorável e perfil físico-químico da minociclina incluindo alta propriedade lipofílica, completa absorção oral [29], uma meia-vida longa, características farmacocinéticas clinicamente desejado [30] e um bom perfil de segurança (média tolerada dose oral 400 mg /dia) [31] levou-nos para a concepção do estudo ao perfil desta droga em relação aos seus efeitos na produção de IL-6 em vias de sinalização do cancro do ovário e da IL-6. Aqui, apresentamos o nosso

in vitro

resultados que mostram a capacidade de minociclina para reduzir tanto constitutivo e estimulado (quer por IL-1 ß ou 4-OH-E2) IL-6 expressão em células de cancro do ovário. Além disso, mostrámos que a minociclina elimina o sistema receptor IL-6 (IL-6R e gp130), as vias de sinalização (STAT3 e ERK1 /2) e alvo a jusante MCL-1 nestas células. Além disso, demonstrámos que a minociclina interfere com o potencial metastático de células de cancro do ovário, que foi associada à supressão da MMP-2 e MMP-9. Isto é seguido pela nossa

in vivo com base na investigação

revelando pela primeira vez os efeitos de minociclina para reduzir tanto no plasma como tumoral expressão de IL-6, juntamente com a sub-regulação de p-tumoral STAT3, P-ERK1 /2 e MCL-1 em um modelo experimental de câncer de ovário em ratos.

Declaração de Materiais e Métodos

Ética

Todos os trabalhos animais foram realizados de acordo com a Universidade de New South animal Care País de Gales e orientações do Comitê de Ética (ACEC). Todos os procedimentos realizados em ratos estavam em estrita conformidade com o protocolo aprovado pela ACEC (número de aprovação: 9 /23B). E todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento

Chemicals e anticorpos

A menos que de outra forma indicado, todas as drogas e produtos químicos utilizados no presente estudo foram obtidas na Sigma-Aldrich (subsidiária australiana, Sydney, Austrália). Os anticorpos primários que se seguem foram usados ​​ao longo deste estudo: Os anticorpos policlonais de coelho específico para a IL-6Ra, gp130, Tyr

705-P-STAT3, STAT3, Mcl-1, P-p44 /42 MAPK (P-ERK1 /2) , p44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Cell Signaling Technology, Sydney, Austrália), MMP-2 e MMP-9 (Santa Cruz, Sydney, Austrália) e monoclonal de ratinho anti-β-actina (R D Systems, Inc ., Sydney, Austrália). anticorpos secundários foram cabra anti coelho ou anti imunoglobulina do rato G conjugada com rábano peroxidase (Santa Cruz Biotechnology, Sydney, Australia):

Cultura celular

As linhas celulares de cancro do ovário humano.; OVCAR-3, SKOV-3 e Caov-3 células, foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). As células foram mantidas em meio RPMI 1640 com 2 mM de L-glutamina, 2 g /L de bicarbonato de sódio, 4,5 g /L de glucose, 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sódio (Invitrogen, Sydney, Austrália) suplementado com 10% de calor de bovino fetal inactivado soro (FBS) e penicilina-estreptomicina (50 U /ml) a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2.

in vivo

Experiências

nu fêmea ratinhos atímicos nu Balb C /nu (6 semanas de idade) foram adquiridos de Recursos biológicos (Faculdade de Medicina da Universidade de Nova Gales do Sul). Os ratos foram alojados e mantidos em armários de fluxo laminar sob condições específicas isentos de agentes patogénicos em instalações aprovadas pela Universidade de New South Wales Animal Care e do Comitê de Ética (ACEC). Todos os procedimentos realizados em ratos estavam em estrita conformidade com o protocolo aprovado pela ACEC (número de aprovação: 9 /23B) e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Resumidamente, 10 × 10

6 log-fase de crescimento de células em suspensão em 0,5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 3 OVCAR-foram injectados intraperitonealmente (i.p.) para cada rato. No 28 ° dia após a inoculação de células, os murganhos foram distribuídos aleatoriamente a um dos grupos de tratamento ou de controlo. Minociclina foi dissolvido em soro fisiológico normal estéril (0,6 mg /ml). Os ratinhos foram injectados i.p. com uma única dose de minociclina (30 mg /kg). grupo controle recebeu soro fisiológico estéril vez. No final do período de tratamento (4 ou 24 h), o sangue foi recolhido através de punção cardíaca, os animais foram sacrificados utilizando Lethabarb R (100 mg /kg) i.p. injecção (VIRBAC, Sydney, Austrália) e os tumores foram dissecados e imediatamente conservada em -80 ° C para análise de Western blot.

A imunocitoquímica de coloração

As células foram semeadas em lamelas de vidro esterilizadas. Em seguida, eles foram tratados com minociclina durante 24 h, lavadas com PBS e fixadas com 100 ul por lâmina de arrefecida de etanol a 95%, 5% de ácido acético glacial durante 10 minutos. As células fixadas foram então lavadas e incubadas em 0,3% de Tween 20, durante 20 min, lavadas com PBS, bloqueadas com BSA a 1%, incubadas com anticorpos primários em BSA a 1% seguido de anticorpos secundários conjugados AlexaFluor em 1% de BSA. núcleos de células foram coradas com iodeto de propídio (PI) (1:2000 diluição) durante 1 min antes de lamelas foram montadas em lâminas de vidro utilizando glicerol, e analisadas quanto à expressão de proteína utilizando microscopia de varrimento a laser Olympus IX71 com lente de imersão em óleo de 60 ×.

Immunosorbent Assay (ELISA) para IL-6 ligado a enzima

In vitro

, as células foram semeadas em placas de 6 poços em 10% de meio de FBS durante 24 h para completar a ligação . Em seguida, eles foram ou estimuladas com IL-1β (10 ng /ml) ou 4-OH-E2 (50? G /ml) ou não-estimuladas com ou sem pré-tratamento com a minociclina. A IL-6 produzida no meio de cultura foi quantificada utilizando o kit de ELISA específica de IL-6 de acordo com as instruções do fabricante (BioLegend Inc., San Diego, CA). As células fixadas foram contadas para normalizar as concentrações de IL-6 contra o número de células. A determinação quantitativa do teor de IL-6 a partir do plasma

In vivo

estudo também foi realizada utilizando o mesmo kit de ELISA.

Análise Western Blot

Para examinar o efeito de minociclina sobre a expressão celular de gp130, IL-6Ra, p-STAT3, STAT3, Mcl-1, P-ERK, ERK, a MMP-2 e MMP-9, a análise western blot foi realizada de acordo com o procedimento padrão. Resumidamente, as células foram lavadas em PBS arrefecido com gelo e extraiu-se durante 30 minutos com um tampão contendo Tris-HCl a 50, pH 7,5, NaCl 140 mM, EDTA 5 mM, NaN3 5 mM, 1% de Triton X-100, 1% de NP -40, EGTA 1 mM, 10% de inibidor de fosfatase e cocktail inibidor de protease. Os lisados ​​foram clarificados por centrifugação a 13.000 ×

g

durante 30 min e proteínas concentrações foram determinadas utilizando o ensaio de proteína Bio-vermelho. Quantidades equivalentes de extractos de células completas foram resolvidos por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e transferidos para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Millipore Corporation, MA, EUA). As membranas foram então sondadas com anticorpos específicos. Imuno-complexos foram detectados utilizando a peroxidase de rábano conjugada com anticorpo anti-ratinho ou anti-coelho, seguido por detecção por quimioluminescência (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA, EUA). Para demonstrar Carga igual de proteína, as manchas foram retirados e sondado com um anticorpo específico que reconhece β-actina.

Transwell migração e invasão Ensaio

A migração celular e invasão foram determinadas utilizando um sistema Transwell de 24 poços com membranas de policarbonato de tamanho de poro 8 milímetros (Life Technologies, Vic, Austrália). Resumidamente, 1 x 10

3 células foram semeadas em meio de 0,1% BSA RPMI contendo várias concentrações de minociclina na câmara superior (câmara de ensaio normal para a migração e a câmara revestida de Matrigel para ensaio de invasão). A câmara inferior foi preenchida com o mesmo meio contendo 1% de FBS. Após incubação durante 18 h a 37 ° C, as células na câmara superior foram cuidadosamente removidos com uma cotonete e as células que tinham atravessado para inverter a face da membrana foram fixadas em metanol, coradas com solução Giemsa. Para cada réplica (n = 3), a migração ou invasão das células foi quantificada por contagem das células marcadas (células por cinco campos) sob microscópio invertido.

Ensaio de Adesão Celular

O ensaio foi realizada como previamente descrito com modificações de menor importância [32]. Resumidamente, as células SKOV-3 foram cultivadas até 70% de confluência, soro empobrecido, e, em seguida, tratada com concentrações variadas de minociclina (0-100 uM) durante 18 h. As células foram removidas utilizando uma solução de descolamento não enzimática, lavadas duas vezes, ressuspensas em meio RPMI sem soro contendo diferentes concentrações de minociclina (0-100 uM), e colocadas em placas a uma densidade de 1 x 10

4 células /poço em placas de 96 poços revestidos com colágeno IV. Após 30 min de incubação a 37 ° C, o meio foi removido, e as placas foram lavadas duas vezes em PBS. As células foram então fixadas com metanol e coradas com solução de violeta de cristal a 0,1%, delicadamente lavadas 3 vezes com PBS, e cristal violeta-solubilizado utilizando ácido acético /metanol /água (10:30:60), e a absorvância foi lida a 595 nm.

Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas com Graph Pad Prism versão 5.0 (CA, EUA). Os dados são apresentados como média ± DP. O estudante

t

-test foi utilizado para comparar dois grupos independentes meios. Uma análise de variância (ANOVA) foi utilizado para determinar as diferenças estatísticas entre mais de dois grupos e uma de duas vias para medidas repetidas ANOVA foi utilizado para avaliar os efeitos do tempo e interação tratamento para a IL-6 variável dependente; uma interação significativa foi interpretado por uma análise de efeitos simples posterior com correção de Bonferroni. A significância estatística foi estabelecida no

p

. 0,05

Resultados

A minociclina Diminui expressão constitutiva de IL-6 em células de cancro do ovário

Para investigar o efeito da minociclina na produção de IL-6 a expressão em células de cancro do ovário, coloração de imunofluorescência foi realizada após 24 h de tratamento de OVCAR-3 (com baixo de IL-6 de expressão), SKOV-3 (com a forma de IL-6 de expressão), e Caov -3 (com expressão elevada de IL-6) com linhas de células de minociclina (100 uM). Os resultados demonstraram que a minociclina diminuíram significativamente a expressão de IL-6 em todas as três linhas de células de cancro do ovário (Fig. 1). Para quantificar este efeito, o ensaio ELISA foi utilizado para determinar os níveis de IL-6 em células de meios de cultura de banho OVCAR-3, SKOV-3 e Caov-3 células tratadas com minociclina (100 uM) durante 1, 2, 4, 6 e 24 h. Como mostrado na Fig. 2, para as células OVCAR-3 IL-6 não era detectável na mídia. No entanto, o tratamento com minociclina, resultou numa diminuição dependente do tempo nos níveis de IL-6 de expressão em ambos os SKOV-3 e nas células Caov-3 que foi significativo às 6 h, com redução percentual em relação ao controlo: 55 ± 5% de SKOV-3 (p 0,001 ), e 25 ± 4,5% para Caov-3 (p 0,05); e 24 h, com redução percentual em relação ao controlo: 60 ± 7% de SKOV-3 (p 0,001) e 35 ± 3.5% para Caov-3 (p 0,001)

imagens confocais representativos de IL. 6 (verde) em OVCAR-3, SKOV-3 e Caov-3 células sob condições de controlo e exposta a minociclina (100 uM) durante 24 h. As células também foram coradas com iodeto de propídio (vermelho). As imagens foram obtidas a 60 × ampliação. As barras de escala representam 20 um.

minociclina (100 uM) diminuiu de IL-6 expressão de SKOV-3 e nas células Caov-3 com um padrão dependente do tempo tal como analisado por ELISA. Os valores exibidos são DP ± média dos dados de três experiências independentes (*

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grupo controle) .

Minocycline Blocos de IL-6 Surge em células cancerosas ovarianas estimuladas com IL-1β ou 4-OH-E2

IL-1β é um potente indutor de IL-6 em humanos células [33]. Demonstrou-se que ambas as células de ovário epiteliais normais e malignas, juntamente com as células imunitárias activadas no estroma produzem IL-1β. Além disso, a produção constitutiva de IL-1β por células de carcinoma do ovário, estimula a produção de citocinas tais como IL-6 [34]. Para simular o que acontece em tumores ovarianos, utilizou-se IL-1β (10 ng /ml) para induzir a expressão de IL-6 em células de cancro do ovário e, em seguida examinado se a minociclina pode bloquear o aumento da expressão de IL-6. Utilizando o kit de ELISA padrão, IL-6 As concentrações nos meios de OVCAR-3, SKOV-3 e Caov-3 foram medidos em diferentes pontos de tempo de pós-estimulação com IL-1β. Observou-se que a IL-6 concentração aumentada de uma maneira dependente do tempo, na presença de IL-1β no banho meios todas as três linhas de células. O aumento máximo foi observado a 6 h, com o aumento percentual em relação ao controlo de 335 ± 15% de OVCAR-3 (p 0,001), 110 ± 6% de SKOV-3 e 90 ± 5% para Caov-3 (p 0,01); e 24 h, com a percentagem de aumento em relação ao controlo de 940 ± 13% de OVCAR-3, 185 ± 7,8% para células SKOV-3 e 100 ± 5,4% para Caov-3 (p 0,001) (Fig. 3A). O pré-tratamento das células estimuladas com IL-1β-com minociclina (100 uM) levou a uma inibição significativa da IL-6 de onda em 6 h (a diminuição percentual em relação ao grupo estimulada por IL-1β: 40 ± 7,3% para OVCAR-3, 50 ± 4,5 % de SKOV-3 e de 35 ± 6,2% para Caov-3, p 0,05); e 24 h (a percentagem de inibição em relação ao grupo de IL-1β estimulada: 50 ± 3,8% para OVCAR-3, 50 ± 2,5% de células SKOV-3 e 30 ± 5% para Caov-3, p 0,001). Para confirmar ainda mais a produção de IL-6 efeito de modulação minociclina, o efeito da droga foi examinado em células de cancro do ovário 4-OH-tratadas-E2. Está bem documentado que as hormonas esteróides, particularmente estrogénios pode modular a produção de citoquinas por meio de indução do gene IL-1β ao nível da transcrição [35]. 4-OH-E2 é o metabolito de catecol 17β-estradiol, que é o estrogénio mais biologicamente activo do ovário. Em células de cancro do ovário, 4-OH-E2 é uma substância mitogénica potente [36], que induz a outros factores de crescimento e vias carcinogénicas [37]. Aqui, OVCAR-3, SKOV-3 e Caov-3 foram tratados com 4-OH-E2 (50? G /ml) e a concentração de IL-6 foi medida no meio de cultura celular após 6 e 24 h. No caso de células OVCAR-3, IL-6 não foi detectada nos meios de comunicação até 24 h pós-4-OH-E2 tratamento. No entanto, o 4-OH-E2 tratamento resultou num aumento significativo nos níveis de IL-6 concentrações em ambas Caov-3 células meios SKOV-3 e aos 6 h (5 e 12 vezes de aumento de células SKOV-3 e Caov-3, respectivamente) ( p 0,001); e 24 h (aumento de 6 e 3 vezes por células SKOV-3 e Caov-3, respectivamente) (P 0,01) (Fig. 3B). Como representado na Fig. 3B, o pré-tratamento de células de minociclina 4-OH-E2-estimuladas resultou em inibição dependente da concentração de IL-6 de expressão. Na concentração de 100 uM minociclina completamente bloqueada IL-6 induzida por aumento de 4-OH-E2 em ambas as linhas de células SKOV-3 e Caov-3.

(A), OVCAR-3, SKOV-3 e Caov -3 células foram pré-tratadas com minociclina (100 uM) seguido por estimulação com IL-1β (10 ng /ml) a diferentes pontos de tempo. Os níveis de IL-6 no meio de cultura foram quantificadas por ELISA em sanduíche. Cada conjunto de dados representam a média ± DP de três experiências independentes. (*

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grupo controle,

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grupo estimulada por IL-1β). (B) OVCAR-3, SKOV-3 e Caov-3 células foram pré-tratadas durante 1 h com concentrações variáveis ​​de minociclina (0-100 uM) seguido por estimulação com 4-OH-E2 (50? G /ml) durante seis e 24 h. Os meios foram recolhidos e IL-6 nível foi analisada por ELISA. Os valores exibidos são DP ± média dos dados de três experiências independentes (*

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vs grupo

4-OH-E2 estimulada)

a minociclina Down-regula IL-6R e Expressão gp130 em células de cancro do ovário

Para.. determinar se a minociclina afeta o sistema receptor de IL-6, a análise de western blot foram realizados para avaliar a IL-6Ra e expressão de gp130 em células SKOV-3 de células (a IL-6Ra positivo) depois de minociclina (100 uM) o tratamento com ou sem estimulação de IL-1β. Exposição de ambas as células não estimuladas e estimuladas por IL-1p SKOV-3 de minociclina significativa levou a sub-regulação de IL-6Ra (Fig. 4A) e gp 130 (Fig. 4B) de um modo dependente do tempo.

para detectar os níveis de (A) (B) de gp130 IL-6Ra ou expressão, SKOV-3 células ou foram estimuladas com IL-1β (10 ng /ml) ou não estimuladas, com ou sem pré-tratamento com minociclina (100 uM) para diferentes pontos de tempo. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por imunotransf erência para o IL-6Ra, gp130 e anticorpos de p-actina. β-actina era o controlo de carga. os níveis de IL-6Ra e proteína gp130 foram normalizados para a p-actina e suas diferenças em relação com os controles correspondentes são mostradas (*

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IL-1β células tratadas).

Influência da minociclina na STAT3 e ERK1 2 fosforilação /e Mcl-1 Expressão em IL-1β estimulada e não estimulada células cancerosas ovarianas

Para examinar se a minociclina inibe a fosforilação do STAT3 no cancro do ovário, células SKOV-3 que expressam STAT3 persistentemente activados foram tratados com minociclina com ou sem estimulação de IL-1β, para os diferentes pontos de tempo. Observou-se que o tratamento com minociclina no resultou a sub-regulação de basal p-STAT3 de uma forma dependente do tempo com o efeito inibidor máximo ocorrendo a 6 h (2,5 diminuição vezes em comparação com o controlo, p 0,01). estimulação de IL-1β-regulada a fosforilação da STAT3 forma dependente do tempo com o aumento máximo às 6 h (2,5 vezes de aumento comparado com o controlo). O pré-tratamento das células estimuladas com IL-1β com minociclina inibiu a fosforilação do STAT3 com o efeito óptimo em 6 h (decréscimo de 5 vezes em comparação com estimulada por IL-1β grupo, p 0,001). No entanto, este efeito foi reversível e os níveis de p-STAT3 voltou para controlar os níveis depois de 24 h de tratamento. Não foram observadas alterações significativas nos níveis de STAT3 totais (Fig. 5a).

SKOV-3 foram tratados com minociclina (100 ^ M) com ou sem IL-1β (/ml 10 ng) a estimulação para diferentes pontos temporais . Os níveis de expressão de (A) p-STAT3, STAT3; (B) Mcl-1, ou (C) P-ERK1 /2, ERK1 /2 foram estimados por análise de Western blot. A análise densitométrica é expresso como média ± desvio padrão da intensidade de densidade óptica obtidos em três experiências independentes (*

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p Art 0,01

vs de Il-1β células tratadas).

MCL-1 é uma proteína inibidora da apoptose a jusante de IL-6 /STAT-3 via. Nós, assim, avaliado o efeito da minociclina em Mcl-1 em células SKOV-3 em ambas as condições normais e IL-1β-estimuladas. Em não estimulado células SKOV-3, o tratamento com minociclina levou a sub-regulação de Mcl-1 de proteína a partir de 2 h (1,5 diminuição vezes em comparação com o controlo, p 0,05) com a inibição máxima a 6 h (decréscimo de 3 vezes em comparação com controlo, p 0,01). Mas, eventualmente, os níveis de proteína retornou ao valor de controlo normal por 24 h. O tratamento de IL-estimularam-1p células também conduziu a um efeito inibidor, dependente do tempo de Mcl-1 de proteína, onde a inibição máxima pode ser observada às 24 h (6 vezes menor do que os IL-1β estimulada grupo, p 0,01) ( a Fig. 5B).

Numa tentativa para determinar se minociclina inibe MAPK percurso, foram examinados os efeitos de minociclina sobre a fosforilação de ERK1 /2 em normal e IL-1β induzidas células SKOV-3. Como mostrado na Fig. 5C, não foram observadas alterações significativas nos níveis de proteína p-ERK1 /2 de células não estimuladas após o tratamento minociclina. estimulação IL-1β aumentou phorphorylation de ERK1 /2 em tempo hábil. O tratamento com minociclina antes da estimulação com IL-1β suprimiu significativamente a fosforilação de ERK1 /2 em 2 h (descida de 8 vezes em comparação com estimulada por IL-1β grupo, p 0,01). No entanto, os níveis de proteína P-ERK1 /2 voltou aos valores normais de controlo por 24 h. Minociclina tratamento não alterou a expressão global da proteína ERK1 /2.

Minociclina inibe a translocação da STAT3 ao Núcleo

Seguindo fosforilação no citoplasma, STAT3 transloca-se para o núcleo para tornar a sua actividade de transcrição. Aqui, utilizou-se microscopia confocal de imunofluorescência com anticorpos que se ligam especificamente a p-STAT3 (Tyr) ou 705 STAT3 total para confirmar que blocos de minociclina a fosforilação e a translocação nuclear de STAT3. Como representado na Fig. 6A, a fosforilação tratamento minociclina (100 uM) de STAT3 reprimida nas células SKOV-3, que é, em conformidade com os resultados da análise de Western blot. Além disso, a translocação nuclear de STAT3 foi inibida em células expostas a minociclina (100 pM) (Fig. 6B).

imunocitoquímica confocal de (A) p-STAT3 e (B) STAT3 (verde) em células SKOV-3 As células tratadas com 100 uM de minociclina em comparação com células de controlo. Os núcleos são contrastadas com iodeto de propídio (vermelho). As imagens foram obtidas a 60 × ampliação. As barras de escala representam 10 mm.

A minociclina Atenua celular do cancro do ovário potencial metastático que está associada a MMP-2 diminuída e MMP-9 Expressão

IL-6 contribui para a metástase do câncer de ovário através de um processo de passos múltiplos envolvendo o complexo de adesão, migração e invasão de células cancerosas [7]. A seguir, realizada ensaio de migração de células câmaras de Boyden e ensaio de invasão de Matrigel, para determinar se a minociclina induzida por IL-6 supressão leva a inibição de células SKOV-3 actividade metastática. O tratamento com minociclina (18 h) atenuou significativamente a migração (Fig. 7A) e invasão capacidade (Fig. 7B) de células SKOV-3 de um modo dependente da dose. Além disso, minociclina inibiu a capacidade de as células SKOV-3 de aderir aos poços revestidos com colagénio de tipo IV humano, dependente da dose (Fig. 7D).

Os efeitos da minociclina no SKOV-3 (A) e a migração de células (B) invasão foi medida por ensaio Transwell. Minociclina foi aplicado em diferentes concentrações (0-100 uM) durante 18 h. (C) A expressão da MMP-2 e MMP-9 estimado por análise de Western Blot, após 18 horas de tratamento as células SKOV-3 com concentrações variáveis ​​de minociclina. (D) a adesão de células após 18 h de exposição a várias concentrações de minociclina, tal como descrito em Material e Métodos (*

P

0,05, **

P

0,01 e ***

p Art 0,001

vs

controle)

a expressão de MMPs, especialmente MMP-2 e MMP-9, pode promover a migração e invasão celular pelo.. proteólise selectiva de componentes da matriz extracelular [38]. Para estudar o efeito da minociclina na actividade de MMP em células de cancro do ovário, analisou-se a expressão de MMP-2 e MMP-9 em células SKOV-3 após tratamento com diferentes concentrações de minociclina durante 18 h. Como mostrado na Fig. 7C, minociclina reduziu tanto a expressão de MMP-2 e MMP-9 de modo dependente da dose. Estes dados sugerem que a inibição do potencial metastático de células de cancro do ovário por minociclina está associada com a diminuição da expressão de MMP-2 e MMP-9.

Minociclina inibe a IL-6 no modelo experimental de cancro do ovário em Ratos

a capacidade de minociclina para inibir a IL-6 e seus percursos em células de cancro do ovário e

in vitro

foi uma boa indicação de que ele tem o potencial de afetar os níveis de IL-6

in vivo

. Aqui, observa-se que o tratamento de dose única minociclina, resultou numa diminuição considerável no plasma (Fig. 8A) e de tumor (Fig. 8B) níveis de IL-6, tanto após 4 e 24 h. Além disso, as expressões tumorais de p-STAT3 e MCL-1 foram significativamente inibidos em amostras 4 e 24 horas de tratamento. A inibição da activação de ERK1 2 /foi observada nos 4 h tratadas amostras de tumor que consistente com os

In vitro

resultados, parece ser recuperado por 24 h (Fig. 8B).

( a) níveis de IL-6 foram determinados por ELISA no plasma de ratinhos portadores IP