Abstract

O receptor NKG2D estimulador sobre linfócitos promove tumor vigilância imunológica, visando ligantes induzidas seletivamente em células de câncer . tumores progridem combater empregando táticas para desativar NKG2D linfócitos. Esta dinâmica negativa é escalado como expressão algumas células cancerosas humanas co-opt de NKG2D, complementando assim a presença de seus ligantes para a estimulação autónoma de sinalização oncogénica. Dados associação clínica implicam relações entre NKG2D célula cancerosa e doença metastática. Aqui nós mostramos que NKG2D promove a plasticidade das células do câncer por indução de fenotípica, molecular, e as assinaturas funcionais de diagnóstico da transição epitelial-mesenquimal, e de traços estaminais-como

via

indução de Sox9, um regulador da transcrição chave da mama haste de manutenção celular. Estes achados obtidos com linhagens tumorais modelo de mama e xenotransplantes foram recapituladas pela

ex

vivo

células cancerosas de carcinomas da mama invasivos primários. Assim, NKG2D podem ter a capacidade de conduzir traços elevados de malignidade doença metastática subjacente

Citation:. Cai X, Dai Z, Reeves RS, Caballero-Benitez A, Duran KL, Delrow JJ, et al. (2014) Estimulação Autónoma da Cancer celular Plasticidade pela NKG2D humano Linfócitos Receptor co-expressos com seus ligantes em células de câncer. PLoS ONE 9 (10): e108942. doi: 10.1371 /journal.pone.0108942

editor: Eric Vivier, INSERM- CNRS Univ. Méditerranée, França |

Recebido: 16 de maio de 2014; Aceito: 27 de agosto de 2014; Publicação: 07 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Cai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes (exceto para os dados de microarrays – ver abaixo) estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. dados de microarranjos estão disponíveis em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/sob GSE53961 código adesão

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health subvenção CA083636 P50 e Institutos Nacionais de Health subvenção R01 CA174470. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

plasticidade celular Cancer implica o desenvolvimento de características que permitem que as células cancerosas se dissociar do tumor primário, disseminar e expandir clonalmente em locais distantes. Este processo é regulado por a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e a aquisição inter-relacionada de células estaminais cancro regenerativa (CSC) atributos de [1], [2]. controladores conhecidos de plasticidade celular de cancro incluem pistas heterotípicas de estroma associado a um tumor e /ou células do sistema imunitário [1]. Nós previamente identificada uma interacção receptor-ligando homot�ica não convencional em células de câncer [3] e mostrar aqui que a sinalização resultante induz reprogramação no sentido de capacidades migratórias e caule-like.

O receptor envolvido, NKG2D (natural killer grupo 2 membro D ), é um receptor de activação de linfócitos, principalmente, em células NK e células T CD8 e é mais conhecido por mediar a vigilância imunológica de células viralmente infectadas e malignos [4]. sinais NKG2D humanos

via in the DAP10 (proteína de activação de DNAX 10) adaptador, que se liga tanto PI3K (fosfatidilinositol 3-quinase) ou Grb2 (growth factor proteína ligada ao receptor 2), ativando assim PKB /AKT (proteína quinase B) ou MAP (proteína activada por mitogénio) cascatas de cinase [5]. Os ligandos para NKG2D em humanos incluem MICA e MICB (MHC de classe I relacionados com cadeias A e B) e de seis membros da família ULBP (proteína de ligação de UL-16) [6]. ligandos NKG2D são praticamente ausente na superfície das células normais, mas pode ser induzida por stress respostas associadas-oncogenesis em células [7] cancerosas. Esta expressão ligando selectivo permite que as células NK e células T CD8 para alvejar as células cancerosas, pelo menos nas fases iniciais do tumor antes tácticas imunossupressores de tumores progridem reprimir este braço da resposta imune [4], [8].

além de contrariar as respostas imunes, algumas células cancerosas cooptar NKG2D para seu próprio benefício, complementando a presença de seus ligantes para a auto-estimulação de desenvolvimento de neoplasias [3]. proporções variáveis ​​de mama, do ovário, da próstata, do cólon e células de cancro expressam de sinalização complexos NKG2D-DAP10 proficiente, que activam o eixo de sinalização PI3K-AKT-mTOR (alvo da rapamicina em mamíferos) e efectores a jusante. Além disso, como em linfócitos, NKG2D-DAP10 estimula a fosforilação de ERK (cinase regulada por extracelular de sinal) e da JNK nas cascatas de MAP-quinase [3]. importância fisiopatológica da sinalização NKG2D-DAP10 é apoiada por um estudo de associação clínica que estabeleceram correlações positivas entre as percentagens de células cancerosas com NKG2D superfície e tamanho do tumor e se espalhou [3]. Estas relações foram estendidos por associações significativas com metástase ganglionar, e por correlações tendência com grau e invasão linfática, sugerindo efeitos NKG2D-DAP10 na formação disseminação de células de tumores e metástases [3]. O presente estudo aborda a capacidade dos NKG2D-DAP10 para promover a plasticidade célula cancerosa doença metastática subjacente.

Resultados

Indução de EMT reprogramação pela estimulação do ligando de NKG2D

linhas de tumor epitelial tipicamente expressar ligandos NKG2D mas ou são negativos para o receptor NKG2D-DAP10 ou, como com o MCF-7, BT-20, e MDA-MB-453 linhas de cancro da mama, dificilmente positivo tal como reflectido por alterações mínimas da citometria de fluxo perfis e próprias baixo NKG2D e mRNA DAP10 e expressão da proteína (Figura S1A e S1B, também consulte a Figura 2B e Figura 2C nas referências 3 e 9, respectivamente). Esta escassez de receptor em linhas tumorais se opõe a abundância relativa, tanto por mRNA e expressão de proteínas, em positivo

ex

vivo

células cancerosas (Figura S1C-E; também se referem a Figura 1C -E em referência 3). Para testar em um

em

vitro

modelo se NKG2D induz EMT, nós, portanto, examinado células MCF-7 que foram estavelmente transfectadas com NKG2D-DAP10 (MCF-7-TF células), resultando em superfície expressão em níveis semelhantes aos

ex

vivo

células cancerosas (comparar Figura S1C e Figura S1F). Por microscopia de contraste de fase, as células MCF-7-TF exibida transformações morfológicas em comparação com as células de controlo transfectadas por simulação, que exibiu fortemente agrupados formas de paralelepípedo semelhante. As células MCF-7-TF, em contraste, exibida morfologias semelhantes a fibroblastos (Figura 1A). Estas modificações foram devidas a expressão ectópica de NKG2D-DAP10 como o fenótipo parental foi restaurada por recombinante ARNi segmentação de NKG2D em células MCF-7-TF-KO mediada por lentivírus (Figura 1A, por citometria de fluxo perfis destas linhas modelo ver Figura S1A e S1F). Estas observações sugerem que a estimulação mediada pelo ligando de NKG2D resultou na indução de EMT, que envolve alterações moleculares e celulares coordenadas que conduzem à perda de adesão célula-célula epitelial, polaridade, e a integridade do citoesqueleto, concomitante com a aquisição de assinaturas de proteína mesenquimais, de células fusiformes formas e capacidades invasivas e migratórias [10], [11]. Diagnóstico de EMT são reduzidos expressão da E-caderina celular junção-associado, e indução de N-caderina e o filamento intermediário do citoesqueleto Vimentin. Por microscopia de imunof luorescência, as células MCF-7-TF exibida essas alterações em células epiteliais e mesenquimais proteínas marcadoras, os quais foram invertidos por RNAi segmentação de NKG2D (Figura 1A). resultados correspondentes foram obtidos por imunotransferência e de perfis de RT-PCR (Figura 1B). Extensão dos dados para proteínas marcadoras adicionais e seus mRNAs correspondentes, incluindo os epiteliais apertados occludens-1 Zona juncionais (ZO-1) e ocludina, citoqueratina 19 (CK19) e mucina 1 (MUC1), e fibroblastóide actina de músculo α-liso (α -SMA), produziu conforme resultados (Figura 1A e 1B) [12]. EMT são orquestradas por factores de transcrição que incluem Snail1 /2, TWIST1 /2, Zeb1 /2, e LEF-1 [1]. A indução de ARNm para o conjunto destes elementos, com excepção para Zeb1 foi gravado com MCF-7-TF mas não as células MCF-7-TF-KO (Figura 1B). A pré-incubação de células MCF-7-TF com um cocktail de anticorpos anti-ligandos NKG2D relevantes inibiram toda a proteína gravado e alterações de ARNm, confirmando assim envolvimento ligando (Figura 1B) [3]. Nosso estudo anterior estabeleceu a exigência de contacto célula-célula para a estimulação mediada pelo ligando de NKG2D-DAP10 sinalização em células cancerosas [3]. Assim, como pode ser visto por citometria de fluxo, as proporções de superfície de E-caderina

-. /N-caderina

+ mesenquimais células MCF-7-TF correlacionada com a confluência de cultura celular (Figura 1C)

(a) mostra a microscopia de contraste de fase de transição epitelial para fibroblastóides formas de MCF-7-TF versus controlo transfectadas por simulação, e reversão fenotípica de células MCF-7-TF-KO células que expressam NKG2D RNAi. Por microscopia de imunof luorescência, as células MCF-7-TF exibir diminuída de E-caderina, ZO-1, ocludina, e MUC-1, induzida e N-caderina e vimentina. (B) imunotransferência correspondente (painel superior) e os dados de RT-PCR (painel do meio), incluindo a CK19 adicional e marcadores α-SMA. A perda de células epiteliais e mesenquimais ganho de marcadores é atenuada quando as células MCF-7-TF são pré-incubados com o cocktail de anticorpos de ligandos NKG2D. painel inferior mostra fatores de transcrição EMT-associado perfis de RT-PCR de MCF-7-TF e linhas de controle e atenuação dos eventos de perda e ganho por mascaramento anticorpo de ligantes NKG2D. (C) A citometria de fluxo de linhas de células MCF-7 cultivadas derivados de baixa ou alta confluência para E-caderina e N-caderina. Os números em quadrantes indicam proporções de células em por cento. Note-se que esta detecção é mais sensível, em seguida, o procedimento utilizado em (A). (D) de dados exemplares mostrando aumento

em

vitro

migração e invasão de MCF-7-TF contra simulada controle negativo transfectadas e as células MCF-7-TF-KO. Presença de cocktail de anticorpos anti-ligando inverte ganhos de motilidade. Os números indicam as contagens de células em campos microscópicos seleccionados aleatoriamente. (E) de exibição gráfica de dados da motilidade com barras que representam números médios de células (+/- SD) derivadas de três experimentos independentes com cada quatro contagens de campo microscópico. Asteriscos denotam

p Art 0,005. (F) Imagem da migração de células MCF-7-TF contra linhas de controle em ensaios de cicatrização de feridas por microscopia de contraste de fase ao longo do tempo. (G) RT-PCR de Snail1, Snail 2, e Sox9 a partir de células MCF-7 parentais, NKG2D-empobrecido ou scrRNAi-transduzidas.

(A) por microscopia de contraste de fase, MCF-7 As células TF reverter a morfologia epitelial quando expostas a inibidores de PI3K (LY294002) ou pan-AKT (AKTV), mas não de MEK1 /2 (U0126) ou JNK (SP600125). (B, C) Inibição da via PI3K ou Akt inverte marcador de proteína EMT e perfis de factor de transcrição em células MCF-7-TF e células MCF-10AT-TF-induzidas Dox, mostrado por imunotransferência e /ou RT-PCR. (D, E) Inibição da via PI3K ou Akt reduz actividades migratórias e invasivos de células MCF-10AT-TF-Dox induzidas MCF-7-TF e. Barras representam a média do número de células (+/- SD) derivadas de três

em

in vitro

migração e invasão experimentos independentes com cada quatro contagens de campo microscópico. Asteriscos denotam

p

. 0,005

remodelação associada a EMT de célula-célula e célula-matriz de adesão dota as células cancerosas com capacidades migratórias e invasivos [10]. Testámos por aumento da motilidade de células MCF-7-TF em ensaios padrão marcando a migração através da membrana microporosa ou traversion de membrana basal reconstituída (matrigel). Em comparação com o controlo MCF-7 transfectadas por simulação, estas experiências revelaram aumentos de cerca de seis e de 12 vezes na actividade migratórias e invasivos, respectivamente, de células MCF-7-TF, que foram suprimidas na NKG2D-empobrecido MCF-7 células -TF-KO (Figura 1D e 1E). Para uma abordagem alternativa, raspe fechamento da ferida por monocamadas confluentes de-7-TF MCF e controle células foi fotografada por microscopia de contraste de fase. Enquanto as células MCF-7-TF obtida de fecho completo da ferida em 72 horas, pouco se qualquer alteração foi observada com as células de controlo negativo (Figura 1F). Em conjunto, esses resultados completou o

em

vitro

estudos de células MCF-7-TF sugerindo que NKG2D-DAP10 tem a capacidade de ativar a EMT de células cancerígenas.

MCF- 7 é uma linha de cancro da mama luminal com características epiteliais, bem como alguns epitelial constitutivo a plasticidade mesenquimais, que é típico da maior parte das linhas de tumor da mama [13], [14]. Assim, Snail1 e Snail2 ARNm eram detectáveis ​​por alta-ciclo (36 voltas) por RT-PCR em células MCF-7 não transf ectadas-mãe (Figura 1G). Consistente com um envolvimento de NKG2D endógena no /2 indução Snail1, depleção NKG2D em células MCF-7-NKG2D ARNi levaram a redução ou perda destes transcritos em comparação com transdutantes mexidos ARNi de controlo (células MCF-7-scrRNAi; Figura 1G; para citometria de fluxo perfis destas linhas modelo ver Figura S1A e S1G). Endógena NKG2D pode, assim, em princípio, ter uma capacidade para promover a diferenciação no sentido assinaturas mesenquimais mas estes efeitos não podem penetrar, devido à sua expressão escassos. Consequentemente, a presença ou ausência de expressão NKG2D endógeno em linhas de cancro da mama, tais como o epitélio MCF-7 (NKG2D

+) ou mesenquimais SUM149PT (NKG2D

-), é não alinhado com a sua principalmente epitelial contra representações mesenquimais [3 ], [9], [14], [15].

indução de EMT célula cancerosa é uma capacidade geral da NKG2D-DAP10

Para a confirmação dos resultados principais em diversas linhagens tumorais, nós testadas transfectantes NKG2D-DAP10 de cancro da mama SUM149PT [9], o melanoma A375 [3], e de células de cancro do ovário MDAH-2774, e, em mais células epiteliais detalhe MCF-10AT pré-malignas da mama, que foram co-transduzido com construções de lentivírus para doxiciclina (Dox) -inducible NKG2D e expressão de DAP10 (Figura S2A e S2B). Distinta a partir de células MCF-7, cada uma destas quatro linhas falta NKG2D endógena (Figura S2A e S2B) [3], [9], mas partilham a capacidade de se submeter EMT [13], [16] – [19]. Tal como acontece com as células MCF-7-TF, sinalizando a proficiência da ectopicamente expressa NKG2D-DAP10 foi demonstrado para as linhas SUM149PT-TF e A375-TF [3], [9], e foi confirmada com o recém-gerado MDAH-2774-TF e as células MCF-10AT-TF por detecção de immunoblot de phosphokinases

P

-Akt

S473 e

P

-ERK1 /2

T202 /Y204 após reticulação do anticorpo anti-NKG2D ( Figura S2C).

Com todas as quatro linhas tumorais, ectópica expressão NKG2D-DAP10 (constitutiva ou induzida por Dox) imprimiu os morfológicas (mostrado apenas para as células MCF-10AT-TF), proteína marcadora, e transcrição assinaturas EMT gravada com células MCF-7-TF (Figura S3A-D). Além disso, a citometria de fluxo de células MCF-10AT-TF-Dox induzidas para a superfície de E-caderina e N-caderina confirmou que a activação de células EMT foi por contacto e, portanto, presumivelmente ligando-dependente (Figura S3E). Todas as linhas tumorais com constitutivo ou Dox induzida ectópica NKG2D-DAP10 expressão exibiu significativamente aumentada

em

in vitro

actividades migratórias e invasivos (Figura S3F).

Dependência da EMT reprogramação na activação de PI3K-AKT

para identificar os requisitos de sinalização NKG2D-DAP10 para activação EMT, células MCF-10AT-TF-Dox induzidas MCF-7-TF e foram expostas a inibidores farmacológicos de PI3K (LY294002), Pan -Akt (AKT Inibidor V), MAP quinase quinase (MEK1 /2) a montante do ERK (U0126), e JNK (SP600125). Indução de todos os critérios de EMT examinados anteriores, incluindo alterações morfológicas (mostrado apenas para as células MCF-7-TF), marcador de proteína de diagnóstico e assinaturas de fatores de transcrição, e motilidade, estavam dependentes do eixo sinalização PI3K-AKT com nenhuma contribuição discernível da ERK e JNK (Figura 2A-E). Em uma abordagem complementar, NKG2D foi expressa nas células MCF-10AT por transdução em conjunto com a DAP10 mutado em uma ou outra sua PI3K /p85 (M88Q *) ou Grb2 (N87Q *) local de ligação [20]. Após confirmação da expressão adequada e da função dos complexos de variante NKG2D-DAP10 (Figura 3A e 3B), o teste para a indução de parâmetros EMT verificada a sua dependência de recrutamento de PI3K /p85, mas não de Grb2 (Figura 3C-E).

(a) imunoprecipitação (IP) e imunoblot (IB) de NKG2D e /ou a DAP10 (N87Q * ou * M88Q) em células MCF-10AT transduzidas (dois painéis superiores). Fundo três painéis mostram a detecção primária de DAP10 e a associação mutuamente exclusivas da sua N87Q * e * M88Q variantes com p85 e Grb2, respectivamente. (B) de sinalização funcionalidade da DAP10 N87Q * e * M88Q variantes. Note-se que a ERK é a jusante de PI3K. EGF foi adicionado para a ativação de controle, DMSO para controlo do solvente. (C, D) Reversão de perfis de proteínas marcadoras e marcadores EMT transcrição por expressão de DAP10 (M88Q *) com a ligação de p85 auditivos, mostrado por imunotransferência e /ou RT-PCR. (E) DAP10 variante M88Q * mas não N87Q * reduz atividades migratórias e invasivos de células MCF-10AT induzidas Dox expressam os respectivos complexos mutantes NKG2D-DAP10. As barras representam números médios de células (+/- SD) derivadas de três

in vitro

migração e invasão experimentos independentes com cada quatro contagens de campo microscópico. Asteriscos denotam

p

. 0,005

Associação de NKG2D-DAP10 com as assinaturas de EMT de

ex vivo

células cancerosas

Sinalização de proficiência de o receptor NKG2D-DAP10 em células de câncer de mama tem sido documentado [3] e foi confirmado aqui com dois espécimes de cancro da mama adicionais (Figura S1H). receptor de ligação cruzada induzida por fosforilação mediada por AKT anticorpo a jusante de PI3K em células de cancro da mama classificadas para ausência de CD45 (exclusão de células hematopoiéticas), expressão de EpCAM (a inclusão de células de cancro), e NKG2D. Aparência de fosfo-AKT (

P -Akt

) foi sensível ao LY294002 e, portanto, dependente de PI3K. Para determinar a relevância biológica de NKG2D-DAP10 na EMT reprogramação, suspensões de células isoladas de fresco a partir de 12 amostras de cancro da mama invasivo primárias (referidos como BT1 para BT12) foram examinados pela superfície multi-parâmetro de citometria de fluxo para CD45, EpCAM, NKG2D, eo E -cadherin

– /N-caderina

assinatura + EMT. EpCAM é um

bona fide

marcador de células de câncer, embora a regulação baixa pode ocorrer durante EMT [12], [21]. Na verdade, a expressão EpCAM entre CD45

– populações de células foi heterogêneo em todos, mas um (BT8) das suspensões de células 12 tumorais (Figura 4A). Nós, portanto, examinado CD45

-EpCAM

alto e CD45

-EpCAM

células de baixa separadamente para NKG2D superfície e padrões de E-caderina /N-caderina. Consistente com os nossos achados anteriores [3], NKG2D

+ células cancerosas estão presentes em todos os 12 espécimes de cancro da mama, variando entre 0,5 e 27,8% (média de 9,7 +/- 9,1%) do total de CD45

-EpCAM

células de alta (Tabela S1). EMT representa um continuum com epitelial híbrido /mesenquimais e estados mesenquimais-like totalmente a transição [10], [11], [21]. Com base em nossos achados com as linhas modelo de tumor, célula cancerosa NKG2D deve, portanto, ser associada tanto híbrido (E-caderina

+ N-caderina

+) e mais diferenciado (E-caderina

N-caderina

+) fenótipos. Em 9 das suspensões de células 12 tumor testados (BT4 para BT12), a maioria NKG2D

+ entre o CD45

-EpCAM

células de alta tinham padrões caderina-E /N-caderina de acordo nem com parcial (E- (e-caderina

-N-caderina

+) caderina

+ N-caderina

+) ou mais progrediu EMT (Figura 4A e 4B). Exceto para as suspensões BT8, BT11 e BT12, desviando para esses fenótipos não era evidente entre os NKG2D combinado

– células cancerosas. Em três casos (BT1, 2 e 3), as células cancerosas com assinaturas mistos ou mesenquimais foram confinados ao NKG2D

+ subconjunto, mas não foram predominantes (Figura 4B).

(A) Exemplos (mama amostras de cancro BT4 e BT5) do fluxo de multiparâmetros citometria de gráficos de pontos que ilustram gating células de câncer com base na ausência de CD45 ea presença de EpCAM (alto ou baixo) e posterior exibição de fenótipos caderina-e /N-caderina de NKG2D

+ ou NKG2D

– subpopulações de células de câncer. Os números em quadrantes indicam proporções de células em por cento. portões quadrante são baseados em fluorescência-menos-um isotipo Ig de controlo colorações. (B, C) de exibição gráfica de dados provenientes de 12 espécimes de cancro da mama (BT1-BT12) que foram analisadas como em (A). E

+ N

-, E

+ N

+ e E

-N

+ referem-se a E-caderina e status de N-caderina. Cores correspondem às dot quadrantes da trama em (A). Ver texto principal para maiores explicações.

NKG2D

+ células também foram observadas entre CD45

-EpCAM

populações de células tumorais baixos, que compreendem entre 0,3 e 59,3% (média de 12,6 + /- 18,9%) (Tabela S1). Em todos, mas a amostra BT1, NKG2D

+ CD45

-EpCAM

populações de baixa também preferencialmente exibido fenótipos EMT. Notavelmente, em amostras seleccione (BT3, BT5, BT6 e BT12), as proporções de mesenquimais (E-caderina

N-caderina

+), as células foram consideravelmente maiores entre NKG2D

+ CD45

– EpCAM

baixo em comparação com NKG2D

+ CD45

-EpCAM

células de alta, sugerindo que a regulação baixa EpCAM pode ocorrer no final do processo EMT (Figura 4B e 4C). No total, estas observações corroboram as constatações feitas com as linhas modelo de tumor, apoiando um papel proeminente de NKG2D como um ativador natural da EMT no câncer. Isto é consistente com o facto de o NKG2D

+ células constituído proporções substanciais quando registados como percentagem do total de células híbridas e marcadores mesenquimais perfil positivo (Tabela S1). Todos os 12 suspensões de células tumorais continham proporções variáveis ​​de CD45

-EpCAM

– células que faltava E-caderina e N-caderina e, portanto, não podiam ser atribuídas a um tipo específico de célula. Com a exceção de quatro espécimes de tumor (BT2, BT3, BT11 e BT12), NKG2D

+ células estavam ausentes entre aquelas populações.

NKG2D induz EMT em um modelo de xenotransplante tumoral

provas complementares para um papel de NKG2D na EMT foi obtido a partir de tumores derivados de células de controlo negativo SUM149PT-TF ou xenoenxerto ortotopicamente em almofadas de gordura mamária de NOD /SCID, um experimento de modelo que foi instrumental no estabelecimento tumorigenicidade NKG2D-driven [9]. Mais

in vivo

evidência direta não era atingível desde cancros espontâneos ou induzidos por carcinógenos em camundongos não têm expressão NKG2D [3]. A linha de SUM149PT é fenotipicamente heterogênea, abrigando subconjuntos consideráveis ​​de células com perfis de marcadores mesenquimais [14]. Assim, imuno-histoquímica pode representar dificuldades em avaliações da evolução EMT-associados. Exame de suspensões de células derivadas de tumores de xenoenxerto por citometria de fluxo aumentaram fortemente expostas representações de fenótipos híbrido /mesenquimais em todos os cinco NKG2D

+ SUM149PT-TF em oposição a NKG2D

– tumores de controlo simuladas (Figura 5). atividade migratória associada a EMT de células SUM149PT-TF xenotransplantadas pode ter contribuído para a disseminação de células tumorais reforçada previamente observada neste modelo animal [9].

As suspensões de células de tumores derivados de ratinhos imunodeficientes ortotopicamente xenoenxerto com cancro da mama SUM149PT- As células TF (gráfico de barras superior) são fortemente desviada para híbrido e-caderina

+ /N-caderina

+ e mais transitou e-caderina

– /N-caderina

+ fenótipos em comparação com o controle Os tumores de células SUM149PT transfectadas por simulação (menor gráfico de barras). E

+ N

-, E

+ N

+ e E

-N

+ referir a situação E-caderina e N-caderina; mediana, número de identificação do mouse.

Instrução de reprogramação stemness por NKG2D

Além de conferir habilidades migratórias, EMT fatores de transcrição Snail1 e torção regular perfis de marcadores de superfície que definem as populações de células de cancro da mama enriquecida para células-tronco com atributos semelhantes [22] – [24]. Consistente com a indução de Snail1 e Twist, expressão NKG2D-DAP10 ectópica (constitutivo ou Dox induzida) foi associado com a haste do cancro da mama celular como CD24

– /CD44

+ perfil mudanças no MCF-7-TF , MCF-10AT-TF e linhas SUM149PT-TF (Figura 6A) [22], [25]. No entanto, apenas uma pequena fracção de células com fenótipos CSC-se qualificar como CSCs como funcionais [2]. Mais relevante para inter-relações EMT-stemness pode ser o facto de que os factores de transcrição, tais como EMT Snail2 ou Zeb1, em cooperação com circuitos genéticos separados, também regular estados funcionais da mama CSC [2], [26] – [28]. Por microarrays expressão do gene de perfis, identificou-se uma indução de destaque do factor de transcrição Sox9 em células MCF-7-TF em comparação com células de controlo falsamente transfectadas (ver dados de microarray em http: adesão //www.ncbi.nlm.nih/geo/under GSE53961 código), que foi confirmado independentemente por RT-PCR quantitativo e imunotransferência (Figura 6B e 6C).

(a) de duas cores de citometria de fluxo de padrões /CD44 CD24 em estavelmente transfectadas células MCF-7-TF e SUM149PT-TF, e as células MCF-10AT-TF transduzidas induzidas Dox (todos mostrados em vermelho) em comparação com controlos negativos (em azul). números coloridos em quadrantes indicam proporções celulares correspondentes por cento. Os dados apresentados são representativos de três experiências. (B) RT-PCR quantitativa de Sox9 na MCF-7 e as linhas modelo MCF-10AT-derivados. barras de dados experimentais representam dobrável aumenta ao longo do controle dados negativos fixado em um. Os dados são representativos de três experiências independentes. Asteriscos denotam

p Art 0,005. (C) dados immunoblot correspondentes para Sox9 e controle de actina. (D) micrografias de contraste de fase de mammospheres formados por células MCF-7 induzidas pelo TF e MCF-10AT-TF contra linhas de controlo negativo. gráfico de barras à direita (barras cinza) resume os dados como o número de Organóides ( 100 mm de diâmetro) contadas em três conjuntos de poços em triplicado cada semeada com 10

3 células MCF-7-TF. As barras pretas representam experiências realizadas com células MCF-7-TF sob as mesmas condições na presença de inibidores de PI3K (LY294002), Pan-AKT (AKTV), MEK1 /2 (U0126), ou de JNK (SP600125). Os dados são representativos de três experiências independentes. DMSO serve como controlo do solvente. (E, F) Como em (D), com células MCF-7 que expressam TF-Sox9 ou controlos Snail2 ARNi ou scrRNAi. (L) micrografias de contraste de fase de células mesenquimais em relação morfologias epiteliais de linhas celulares apresentadas em (E, F). (H) O display gráfico de proporções de Sox9

+ /Snail2

+ células entre CD45 positivo ou negativo NKG2D

-EpCAM

+

ex vivo

células de cancro da mama (espécimes BT13 para BT18) determinado pelo multi cor citometria de fluxo.

Sox9 atua cooperativamente com Snail2 (Slug) e, em menor medida Snail1 como um regulador mestre do estado de células-tronco mamárias [28]. Assim, regulando positivamente Sox9 além de Snail2 e Snail1 (ver Figura 1B), NKG2D pode ter a capacidade de promover atributos semelhantes a células estaminais funcional. Esta ideia foi suportada por culturas organ�de matrigel tridimensionais e ensaios mammosphere clássicos. Em ambos os tipos de experiências, as células MCF-7-TF formado numerosos grandes ( 100 mm) Organóides enquanto que as células MCF-7-TF-KO gerados apenas alguns grupos de células que eram tipicamente pequenos (Figura 6D) controle mock-transfectadas ou. Tal como acontece com EMT reprogramação, a formação organ�de era dependente de PI3K-AKT sem envolvimento aparente de ERK ou JNK (Figura 6D). Correspondendo evidência para a capacidade de induzir a NKG2D Sox9 e formação organ�de foi obtido com células MCF10AT-TF-induzidas Dox (Figura 6B-D).

e Sox9 Snail2 são ambos necessários para as células epiteliais mamárias de introduzir e estavelmente manter um estado de células estaminais funcional [28]. Assim, a depleção de Sox9 RNAi-mediada, e, separadamente, de Snail2, revogada formação organ�de em culturas de células MCF-7 mammosphere-TF [Figura 6E e 6F). Ao contrário Snail2, que é pensado para contribuir para conter a indução de células

via

ativação de um EMT, os efeitos da Sox9 em EMT reprogramação são considerados menores [28]. Consequentemente alterações morfológicas, EMT-associados de células MCF-7-TF foram, portanto, invertida pela depleção de RNAi-mediada de Snail2 mas não de Sox9 (Figura 6G).

A característica definidora de células cancerosas maiores plasticidade é sua eficiente iniciação do tumor mediante xeno em ratinhos imunodeficientes. Nosso estudo rato modelo anterior demonstrou latências significativamente reduzidos e incidência de tumores avançados com ortotopicamente transplantado MCF-7-TF contra linhas de controle [9]. Esses resultados são consistentes com a indução NKG2D mediada por Sox9 e Snail2 e aquisição de atendimento das capacidades CSC. Esta indução também fornecida uma explicação para a iniciação do tumor melhorada observada por células não transfectadas MCF-7 que expressam mínima endógena NKG2D (Figura 1G; por citometria de fluxo perfis de MCF-7 parental, MCF-7-NKG2DRNAi, e linhas de células MCF-7-scrRNAi veja a Figura S1A e S1G) [9]. Para sondar para a relevância em cancros humanos,

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células tumorais de seis espécimes de cancro da mama invasivos primários (BT13 para BT18) foram testados para associações entre NKG2D e Sox9 e Snail2 por fluxo policromática citometria. Em todos os tumores, proporções de CD45

-EpCAM

+ células co-expressando Sox9 e Snail2 foram significativamente maiores entre NKG2D

+ em comparação com NKG2D

– células (Figura 6H). Em conjunto, esses resultados apoiam significado tumorigénico do NKG2D

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indução Sox9- e Snail2 mediada de traços CSC.

Discussão

alta plasticidade células cancerosas são considerados culpados principais de tumor divulgação e repercussão após a terapia convencional do câncer [2], [29]. O presente estudo indica que a expressão cooptados de, e sinalização por, NKG2D sobre as células cancerosas promove plasticidade célula cancerosa com a diferenciação em relação fenótipos mesenquimais e de habilitação de divulgação e capacidades de iniciação do tumor. significado fisiológico é apoiada pela recapitulação de EMT e Sox9 assinaturas gravadas com linhagens tumorais modelo de cânceres de mama invasivos primários. É provável que o papel dos NKG2D como um controlador de plasticidade célula cancerosa é amplamente aplicável, estendendo-se para, pelo menos, do ovário, do cólon, da próstata e células de carcinoma de [3].

A relevância de EMT, e por inferência de reprogramação stemness, no desenvolvimento do tumor humano não é controversa [30]. No entanto, as manifestações baseadas em citometria de fluxo recente de células tumorais circulantes com epitelial, mesenquimal ou assinaturas híbridos e capacidades de iniciação metástases associadas, constituem evidência direta para a plasticidade das células de cancro humano e seu significado fisiopatológico [21], [31]. Nossa análise de uma única célula multi-paramétrico de

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suspensões de células de tumor estende essa evidência para cânceres de mama primário e descobre que misturado epitelial /mesenquimais e mesenquimais-like fenótipos de células de câncer de mama são mais prevalentes e, presumivelmente, mais complexa do que se pensava anteriormente. Porque a maioria das populações de células cancerosas NKG2D

+ mama examinados foram desviada para fenótipos híbridos e mesenquimais e representou proporções substanciais de todas as células com esses estágios de diferenciação, NKG2D podem possivelmente ter um papel de destaque na indução de EMT.