Abstract
A expressão da metaloproteinase de matriz 9 (MMP9) é elevada em uma variedade de indicações inflamatórias e oncologia, incluindo ulcerativa colite e câncer colorretal. MMP9 é um efector a jusante e a montante de um mediador de vias envolvidas no crescimento e a inflamação, e tem sido desde há muito considerada como um alvo terapêutico promissor. No entanto, os esforços anteriores para atingir as metaloproteinases de matriz (MMP), incluindo a MMP9, têm utilizado de largo espectro ou inibidores semi-selectivas. Enquanto algumas destas drogas mostraram sinais de eficácia em pacientes, todos os inibidores de MMP-segmentados têm sido dificultados pela toxicidade limitante da dose ou insuficiente benefício clínico, provavelmente devido à sua falta de especificidade. Aqui, mostramos que a inibição selectiva de MMP9 não induziu síndrome músculo-esquelético (uma toxicidade característica de inibidores pan-MMP) num modelo de rato, mas fez diminuir a gravidade da doença num modelo de rato induzida por dextrano sulfato de sódio de colite ulcerativa. Descobrimos também que a inibição de MMP9 diminuiu o crescimento tumoral e metástases incidência num modelo de xenoenxerto ortotópico cirúrgica de carcinoma colorrectal, e que a inibição da MMP9 quer derivado de tumor ou no estroma foi suficiente para reduzir o crescimento do tumor primário. Colectivamente, estes dados sugerem que a inibição selectiva de MMP9 é uma estratégia terapêutica promissora para o tratamento das indicações inflamatórias e oncologia MMP9 em que é regulada positivamente e está associada com a patologia de doenças, tais como a colite ulcerativa e o cancro colo-rectal. Além disso, é relatado o desenvolvimento de um inibidor alostérico MMP9 potente e altamente selectivo, o anticorpo monoclonal humanizado GS-5745, que pode ser utilizado para avaliar o potencial terapêutico de inibição MMP9 em pacientes
citação:. Marshall DC , Lyman SK, McCauley S, Kovalenko H, Spangler R, Liu C, et ai. (2015) Selective Alostérica inibição da MMP9 é eficaz em modelos pré-clínicos de Colite Ulcerativa e Câncer Colorretal. PLoS ONE 10 (5): e0127063. doi: 10.1371 /journal.pone.0127063
Editor do Academic: Fabio Cominelli, CWRU /UH Digestive Health Institute, United States |
Recebido: 23 de dezembro de 2014; Aceito: 11 de abril de 2015; Publicado: 11 de maio de 2015
Direitos de autor: © 2015 Marshall et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
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financiamento:. Todos os autores e reconhecidos pessoas são funcionários atuais ou antigos da Gilead Sciences. Gilead Sciences financiado toda a investigação relatada neste estudo e foi o único envolvido no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar, e preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores têm as seguintes participações: todos os autores são funcionários atuais ou antigos da Gilead Sciences. Este estudo foi financiado pela Gilead Sciences. Gilead Sciences detém a patente ‘Antibodies à matriz metaloproteinase 9’ (B2 US8501916) e do pedido de patente ‘Antibodies à matriz metaloproteinase 9’ (US20130281676 A1), e está atualmente avaliando o anticorpo humanizado monoclonal GS-5745 na fase 1 de ensaios clínicos (ClinicalTrials gov identificadores NCT01831427, NCT02077465 e NCT01803282). Nenhum desses interesses concorrentes afetam a adesão dos autores para PLOS ONE políticas relativas à partilha de dados e materiais associados com o manuscrito submetido.
Introdução
Matrix metaloproteinases (MMP) proteólise mediada desempenha um papel-chave na modulação da homeostase celular: as MMPs pode iniciar, amplificar, ou infra-regular cascatas envolvidos no crescimento e inflamação através da activação de citocinas e libertar factores de crescimento sequestradas sinalização, e pode modificar a arquitectura dos tecidos através da degradação de componentes estruturais da matriz extracelular (ECM) [1 -6]. Dos 23 membros da família MMP, MMP9 (também conhecida como gelatinase B) mostra-se promissor em particular como um alvo terapêutico, dado o corpo de provas que demonstram a sua participação em processos patológicos que contribuem para a inflamação crónica, tumorigénese, e metástase [5-7].
expressão MMP9 desregulado e actividade estão associados com várias doenças inflamatórias, incluindo a colite ulcerosa (UC) [1, 7-12]. UC é uma inflamação autoimune recidivante /remitente do cólon [13-16] que possui a indução de níveis de proteína e MMP9 actividade proteolítica nas áreas de doença activa [10, 11, 17]. actividade MMP9 em UC está implicado tanto na geração e perpetuação de um estado inflamatório-lo é induzida por citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α e α IL1- [18-20], e que pode ajudar a sustentar processos pró-inflamatórios por libertação de TNF -α e TGF-β, através da potenciação de IL-8, e através da activação IL1-β [4, 21-26]. MMP9 podem também contribuir para o meio inflamatório através de proteólise de a membrana basal (BM) constituintes do colagénio IV e laminina [7]. Destruição epitelial da BM, uma característica de definição de UC [13, 14, 16, 18], pode resultar na apoptose de células epiteliais [27], o que contribui para a perda da integridade da barreira epitelial da mucosa do cólon, exacerbando ainda mais inflamação. Do mesmo modo, o rompimento da BM endotelial pode facilitar linfócitos e neutrófilos transmigração para o local da inflamação [28-30].
expressão UC andMMP9 crónica em UC são factores de risco para o desenvolvimento de carcinoma colorrectal (CRC) [15 , 31-33], e, embora o caminho exato da inflamação crônica a displasia de neoplasia não é clara, o envolvimento de MMP9 em processos que permitem a criação e propagação de ambas as doenças [1, 6, 7, 34, 35] sugere que ela pode desempenhar um papel na progressão da UC ao cancro. MMP9 expressão é elevada e está correlacionada com um mau prognóstico em uma ampla variedade de tumores, incluindo CRC [5, 6, 35-47], e que desempenha várias funções no processo de tumorigénese: MMP9 é produzido pelas células tumorais, bem como pela as células inflamatórias do estroma, tais como macrófagos associados a tumores (TAMs) e neutrófilos, e é um mediador chave da diafonia tumor de estroma, que resulta na activação recíproca de sinalização pró-oncogénica nestes dois compartimentos [48-52]. MMP9 promove a metástase por facilitar a migração de células tumorais e invasão por meio de clivagem de BM e outros componentes da matriz extracelular [53], e que também tem sido implicado no crescimento do tumor primário em virtude da sua posição, tanto como um alvo a jusante [54-63] e um a montante regulador chave de vias de sinalização oncogénicos. Neste último capacidade, MMP9 podem activar a sinalização pró-oncogénica através da sua capacidade para libertar factores de crescimento tais como EGF, FGF-2, VEGF e [64-67], e para modular a função da integrina e a tirosina-cinase do receptor [54, 68, 69 ]. Em última análise, estes diferentes aspectos da MMP9 trabalho função em conjunto para efetuar a desregulação de sinalização e proteólise matriz que contribuem para o crescimento e propagação de tumores [53, 64, 70-73].
A relevância da MMP9 na patologia de certas indicações inflamatórias e oncologia tem sido demonstrado por relatórios que mostram que
MMP9 – /-
ratos expostos diminuiu a gravidade da doença em modelos pré-clínicos de colite e artrite reumatóide, e também exibido reduziu o crescimento do tumor e /ou reduzido metástases em vários modelos de cancro [1, 66, 74-81]. Embora estas e outras observações publicados sugerem que a MMP9 é um alvo terapêutico atraente, os esforços anteriores para segmentar MMPs (incluindo MMP9) utilizados inibidores pan-específicos ou semi-selectivas, e não tiveram sucesso devido aos efeitos secundários que limitam a dose, tais como a síndrome do músculo-esquelético (MSS ) e /ou a uma falta geral de benefício clínico [1, 17, 39, 82-84]. Em retrospectiva, a falta de uma janela terapêutica com esses inibidores de MMP mais amplo espectro é compreensível, dadas as funções que MMPs pode jogar em processos homeostáticos críticos [22, 85].
Aqui, nós relatamos o desenvolvimento de uma altamente selectivo e potente inibidor alostérico anticorpo de MMP9: mostra-se que a inibição da MMP9 é eficaz em modelos de ratinho de UC e cancro colo-rectal, e que esta terapia não induz MSS num modelo de rato. Propomos que a inibição selectiva da sinalização patológica mediada por MMP9 e proteólise de matriz é uma nova oportunidade terapêutica em condições inflamatórias tais como a UC, e em cancros tais como o CRC.
Materiais e Métodos
Tecidos
fresco congelado (FF) e fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) tecidos humanos foram obtidos a partir de Cureline, Inc. (Burlingame, CA), Asterand (Detroit, MI), ou Folio Biosciences (Powell, OH) .
proteínas recombinantes e MMP9 imunização
MMP9 proteína humana foi gerado por clonagem do ADNc de comprimento total no vector pSecTag2hygro (B) (Life Technologies, Carlsbad, CA) e transientemente transfectar-lo em células HEK293 células (ATCC, Manassas, VA). O meio condicionado foi purificado com uma coluna Fast Flow 16/20 XK Ni-Sepharose (GE Life Sciences, Pittsburgh, PA). Esta proteína e adjuvante Ribi foram utilizados para imunizar ratinhos BALB /c (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine), através da almofada da pata. Os ratinhos com títulos de anticorpos séricos contra MMP9 foram usadas para criar bibliotecas de hibridoma através da fusão de células B isoladas de nódulos linfáticos. Estas bibliotecas foram subclonados através de uma única célula de triagem para gerar populações clonais a partir do qual o anticorpo anti-humano de MMP9 foi identificado AB0041. As imunizações, criação da biblioteca de hibridoma e clonagem de anticorpo foram realizadas em soluções de anticorpos (Sunnyvale, CA). O anticorpo monoclonal de rato anti-MMP9 AB0046 foi gerada de modo semelhante, com as excepções que os ratinhos knockout de MMP9 (Jackson Laboratories) foram utilizados e que uma proteína de rato MMP9 composta de apenas os domínios pro e catalíticos (aa 1-445) foi utilizado para a imunização. Para a análise de especificidade, de comprimento completo proteínas da família MMP foram adquiridos a partir de R D Systems (Minneapolis, MN)
AB0041 e AB0046 a produção de anticorpos e
células de hibridoma que expressa purificação
AB0046 ou AB0041 foram cultivadas em. IMEM, 10% de soro Fetal bovino (baixa IgG), penicilina /estreptomicina (1X), 5% de Clonagem de hibridoma Fator, e suplemento de meios HT (1X) (Life Technologies, Grand Island, NY). fluido ascítico foi gerada, foi purificado pelo modo em lotes em resina certeza MabSelect (GE Healthcare, Piscataway, NJ), e foi formulado em solução salina tamponada com fosfato (PBS; 10 mM de fosfato de sódio, 140 mM de cloreto de sódio). pureza do anticorpo foi avaliada por resolução de amostras reduzidas e não reduzidas com SDS-PAGE 4-12% de gel de Bis-Tris e coloração com mancha azul simples Seguro (Invitrogen). Os anticorpos purificados foram mostrados para conter menos de 5% de agregados por SEC-HPLC utilizando coluna TSKgel G3000SWXL a partir da Tosoh (King of Prussia, PA). LAL teste (Endosafe, Charles River Laboratories, Charleston, SC) foi utilizado para confirmar as preparações de anticorpos continha menos do que 5 mg de endotoxina UE /.
MMP9 dirigir enzyme-linked immunosorbent assay de ligação (ELISA)
direto de ligação de antigénio-down ensaios de ELISA com proteínas MMP9 recombinante purificados foram desenvolvidos para medir a afinidade de ligação aparente de AB0046, AB0041, e GS-5745. Todas as lavagens foram com PBS + 0,05% Tween-20 (PBST). MMP9 proteínas de comprimento completo foram revestidos em placas Maxisorp (Nunc, Rochester, NY, EUA), seguido de bloqueio com PBS + 5% (w /v) de albumina de soro bovino (BSA; Merck). As placas foram então lavadas e diluições em série de anticorpos anti-MMP9 em PBS foram adicionados. Após a lavagem, as placas foram incubadas com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário (Thermo Scientific, Fair Lawn, NJ) diluída 1: 10000 em PBS + 0,5% (w /v) de BSA, em seguida, lavadas e reveladas utilizando 3,3 ‘, 5,5’-tetrametilbenzidina (TMB; Sigma, St. Louis, MO) durante 1 minuto. A reacção foi extinta pela adição de ácido clorídrico 1 M. A quantificação foi realizada num leitor de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) no modo de absorção a um comprimento de onda de 450 nm. As constantes de dissociação aparente (K
D (ELISA)) foram determinadas utilizando o software SoftMax Pro (Molecular Devices) através da representação gráfica dos valores de absorvância vs concentração de anticorpo e ajustando os dados a uma equação logística de 4 parâmetros, com o “C “equação parâmetro definido como a aparente K
D.
mapeamento de epítopos de AB0041 e AB0046
Todas as construções MMP9 mutantes utilizados no mapeamento de epítopos foram gerados por mutação vectores de expressão de MMP9 humanos mouse e usando II uma mutagénese dirigida QuikChange Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Os clones individuais foram verificadas por análise da sequência de DNA, e proteínas MMP9 mutantes foram gerados por transf ecção transitória em células HEK293. O meio condicionado foi colhido após 24 a 48 horas e usada para o revestimento de um His-Select Hi-Capacidade de Ni2
+ placa revestida (Sigma), durante a noite a 4 ° C. Os seguintes placas dia foram lavadas em PBST e bloqueou-se com BSA a 5% em PBS, durante uma a duas horas à temperatura ambiente, seguido por incubação com 10 nM ou 1 nM de anticorpo diluído em PBST. As placas foram lavadas e incubadas com uma cabra-anti-ratinho IgG conjugado com HRP anticorpo secundário (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), diluído 1: 10000 em BSA a 0,5% em PBS. As placas foram lavadas, desenvolvidos e leia como descrito acima
ensaios de actividade MMP9
atividade MMP9 foi avaliada utilizando substratos fluorogênicos apaga.; clivagem gera fluorescência que é proporcional à quantidade de actividade da enzima [86]. ensaios humanos e de rato usado QXL onde, Abu = ácido 520-γ-Abu-P-Cha-Abu-SMC-HA-Dab (5-FAM) -AL-NH2, a SMC = S-metil-L-cisteína 2-aminobutírico e Cha = ciclo-hexilalanina-β (AnaSpec Inc., Fremont, CA), e o ensaio de rato utilizado Mca-PLGL Dpa-AR-NH2; (R D Systems, Minneapolis, MN). MMP9 recombinante purificada a partir de células HEK293 que foi activada por incubação durante a noite a 37 ° C, com acetato 4-aminofenilmercúrico (APMA) em 50 mM Tris pH 7,5, cloreto de cálcio 10 mM, cloreto de sódio 150 mM e 0,05% de Brij-35 tampão [87]. proteína MMP9 (63 pM humano, rato 125-150 pM, ou 1 nM de rato) foi transferido para uma placa de 96 poços preta (Costar) e misturou-se com anticorpo diluído em série. Após a formação do complexo de MMP9-anticorpo, substrato (20 uM para ensaios humanos e de ratinho, 10 uM de rato) foi adicionado e a fluorescência foi monitorizada em modo de cinética a 37 ° C em cada um leitor de placas SpectraMax M2 ou M5 (excitação 320 nm, emissão 405 nm) ou um leitor de placas Infinito M1000 (Tecan, Suíça) utilizando um comprimento de onda de excitação de 494 nm e um comprimento de onda de emissão de 521 nm. O declive da curva (unidades de fluorescência relativa [RFU] por minuto) foi determinada na zona linear, e, em seguida representada graficamente contra a concentração de anticorpo utilizando uma curva de 4 parâmetros algoritmo de ajuste para determinar um
valor de IC 50. Para determinar o modo de inibição de MMP9, o ensaio de actividade foi realizado como descrito acima utilizando quatro concentrações diferentes de substrato péptido QXL-FAM marcado. Os ensaios
DQ-colagénio IV e DQ-gelatina
humana DQ-colagénio IV e DQ-gelatina porcina (Life Technologies) são proteínas extinta fluoresceína conjugado que apresentam fluorescência após a digestão. MMP9 proteínas recombinante de comprimento total humano ou de ratinho foram activados, como descrito acima. MMP9 humano a 1 nM ou 0,25 nM (colagénio IV ou ensaio de gelatina, respectivamente) ou MMP9 rato a 1 nM foi adicionada a uma microplaca de 96 poços preta contendo diluições em série de anticorpo. Após a formação do complexo anticorpo-MMP9, foi adicionado 25 de substrato ug /ml e a fluorescência foi monitorizada num leitor de placas SpectraMax (Molecular Devices M5) regulado a 37 ° C, com comprimentos de onda de excitação /emissão de 495/515 nm durante 3 horas (colagénio IV) ou num leitor de placas PHERAstar FS (BMG LABTECH) com comprimentos de onda de excitação /emissão de 485/520 nm durante 30 minutos (gelatina). Os dados foram corrigidos por subtracção dos seus respectivos negativos (sem enzima) poços de controlo, e unidades de fluorescência relativas (RFU) foram convertidos em percentagem de inibição, o qual foi em seguida representada graficamente em função da concentração do anticorpo; uma curva de 4 parâmetros encaixe foi utilizado para determinar um valor de IC
50.
TNF-α proteína de fusão ensaio de clivagem
O ensaio humano recombinante de clivagem da proteína de fusão pró-TNF-α (R D Systems, 1012-PS-010) foi realizada seguindo o protocolo do fabricante. Activo MMP9 recombinante humana (Millipore, PF024) ou ADAM17 (R D Systems, 903-ADB) foi misturado com 10 uM de AB0041 ou 10 um do BB-94 (Selleck Chemicals, S7155) e incubou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. substrato da proteína de fusão de TNF-α foi então adicionada e incubada durante a noite a 37 ° C. A análise por Western blot foi realizada com um anticorpo para o TNF-α policlonal de coelho (Cell Signaling, 3707). Recombinante TNF-α humano (R D Systems, 201-TA) foi usada como um controlo positivo
Rat MSS modelo
Trinta ratos machos Lewis foram obtidos dos laboratórios Harlan (Livermore, CA. ) e foram aclimatizados durante cinco a sete dias antes do início do estudo. Os ratos foram divididos aleatoriamente em 5 grupos (3 controle; 2 experimentais) de 6 ratos /grupo com base em seu peso corporal. Os ratos foram alojados em gaiolas individuais numa sala com temperatura controlada com uma luz ciclo de 12 horas /escuridão e tiveram acesso ad libitum a água potável dos animais e comida ao longo do curso do estudo. AB0041 (50 mg /kg) ou veículo (PBS, pH 6,5, 0,01% de Tween-20) foi administrada a 6 ratos duas vezes por semana através de injecção intravenosa na veia da cauda. Como um controlo positivo para MSS, 6 ratos foram tratados com o marimastat (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) através de uma bomba de Alzet implantadas cirurgicamente subQ (Alzet, Cupertino, CA). Cada bomba continha um total de 60 mg de o marimastat, que foi entregue a uma taxa de 2,5? L /hora durante um período de 28 dias. Um quarto grupo de 6 ratos recebeu o veículo utilizado para a diluição marimastat (50% de DMSO /50% de água) através de uma bomba de Alzet SubQ. taxa de libertação marimastat situou-se entre 6,8 mg /kg /dia (no início do estudo) e 5,7 mg /kg /dia (no final do estudo). Os animais foram observados diariamente e teve sintomas de MSS de acordo com os critérios citados na Renkiewicz et ai. [88]. Descansando postura, marcha e vontade de avançar: postura de repouso foi pontuado como 0 (normal), 1 (que descansa em um pé) ou 2 (descansando em nem um pé nem dois pés). Gait foi pontuada como 0 (normal), 1 (evita a utilização de uma pata traseira) ou 2 (evita a utilização de ambas as patas traseiras). Vontade de avançar com a estimulação foi pontuado como 0 (movimento normal), 1 (um pouco relutante em se mover), 2 (moderada relutantes em se mover) ou 3 (muito relutantes em se mover). No final do estudo (dia 28), os membros foram colhidas e fixadas em 10% de formalina tamponada neutra para análise histopatológica. Membros foram descalcificados e, em seguida, aparado, processado, embebidos em parafina, seccionado, corado com hematoxilina e eosina (H E) e examinadas ao microscópio. O estudo foi conduzido em MSS Aragen Biosciences Inc. (Morgan Hill, CA).
induzida por DSS colite modelo
Setenta e cinco ratos machos C57BL /6 machos foram obtidos a partir de Charles River Laboratories (Wilmington , MA) e foram aclimatados durante 5 dias antes do estudo de início e monitorizados para confirmar a saúde. O estudo foi realizado em salas de animais fornecidos com ar filtrado HEPA, a uma temperatura de 70 ° C +/- 5 ° F e 50% +/- 20% de humidade relativa. O quarto era no um temporizador automático para um ciclo de luz /escuridão de 12 horas em e 12 horas de folga sem crepúsculo. cama estéril Bed-O-espigas foi mudado no mínimo uma vez por semana. Os animais foram alimentados com Purina estéril Labdiet 5053 dieta de roedores, e água esterilizada foi fornecida ad libitum.
Os murganhos foram distribuídos aleatoriamente com base no peso corporal em 5 grupos de 14 animais e um grupo de 5 animais antes do início do estude. A colite foi induzida pela administração de 3% w /v de sulfato de sódio de dextrano (DSS) (MP Biomedicals; MW 36,000-50,000;. Produto não 160110;. Lote n 5237K) na água de beber em dias de estudo 0 a 5. solução foi DSS substituído com uma solução preparada de fresco no dia 3. um grupo de ratinhos (n = 5) não receberam DSS e serviu como grupo de controlo sem doença. No dia de estudo de 6, 14 animais por grupo foram administrados por via intraperitoneal quer PBST veículo, anticorpo de controlo de isotipo (30 mg /kg), AB0046 (30 mg /kg), ou o etanercept (10 mg /kg, Clayworth Saúde, Castro Valley, CA) . Veículo e anticorpos foram dosados nos dias 6, 9 e 12, e etanercept foi administrado nos dias 6, 8, 10 e 12. Todos os animais foram pesados e avaliados visualmente quanto à presença de diarréia e fezes com sangue diariamente. No final do estudo (dia 14), todos os animais foram submetidos à endoscopia vídeo de parte inferior do cólon com uma pequena endoscópio animais (Karl Storz Endoskope, Alemanha). Os animais foram anestesiados com isoflurano e colite foi pontuada visualmente com a escala seguinte [89]: 0 (para o normal), um (para perda de vascularização), 2 (para a perda de vascularidade e evidência de friabilidade), 3 (por friabilidade e erosões ), e 4 (por ulceração grave). Cada rato foi atribuída uma pontuação simples (denominado pontuação endoscopia) que correspondeu à mais graves danos observados ao longo de todo o comprimento do cólon. No final do estudo, os animais foram sacrificados por exposição a C0
2. Para avaliar a colite histologicamente gravidade, um patologista GI veterinário credenciado, cegos com relação a grupos de estudo, avaliou H seções passo FFPE E-manchadas de tecido do cólon. Cinco a oito secções separadas 5 um de espessura retiradas de regiões distintas da parte inferior de cada 5 cm do cólon foram classificadas por alterações morfológicas e /ou lesão do epitélio, tecido conjuntivo, e na submucosa, utilizando uma escala de 4 pontos [89]. Scoring da inflamação e edema foi a seguinte: 0 (nenhum presente), 1 (raros focos /mínimas), 2 (regiões dispersas ou leve /difusa), 3 (numerosas regiões ou moderada difusa), 4 (marcado). Scoring de necrose da mucosa foi a seguinte: 0 (nenhum), 1 ( 25% afetado), 2 (26-50% afetado), 3 (51-75% afetado), e 4 ( 76% afetado). Estas pontuações foram média para obter uma única pontuação média por rato por parâmetro. Este estudo e análise histopatológica associada (incluindo seleção de imagens representativas) foi conduzido por biomodelos, LLC.
HCT116 cirúrgica ortotópico modelo de xenotransplante
Todos os estudos pré-clínicos de três HCT116 foram realizadas por AntiCancer Inc. (San Diego, CA). ratinhos nu nu /NCr fêmea foram obtidos a partir de Charles River (Wilmington, MA) e foram criados por AntiCancer Inc. para produzir estudar animais. Os animais de teste foram mantidas por num ambiente filtrado HEPA com 14 horas de luz /10 horas de ciclo escuro para o experimento. Gaiolas, alimentos e roupas foram autoclavados; LabDiet rato ração foi obtida a partir PMI Nutrition International Inc. (Brentwood, MO) e foi fornecida à vontade, como se a água potável. Os murganhos foram distribuídos aleatoriamente com base no peso do corpo em 4 grupos (grupo de controlo; um 3 grupos experimentais de 15 animais cada). existências tumorais pré-implantação da linha celular HCT116 do cancro colo-rectal humano que expressa GFP (AntiCancer Inc.) foram preparadas por injecção subcutânea as células HCT116-GFP a uma concentração de 5 x 10
6 células /100 ul no flanco de nu ratos. Após a expansão, tecidos de tumor foram colhidas a partir de ratinhos e cortados em fragmentos de aproximadamente 1 mm
3. Dois de tais fragmentos de tumor foram então implantados cirurgicamente ortotopicamente (SOI), adjacente aos dois pontos de cada animal de estudo, de acordo com ketamina /Acepromazina /Xilazina anestesia.
Quando os tumores implantados cirurgicamente alcançado um volume médio de cerca de 70-100 milímetros
3, os ratinhos foram divididos em grupos de tratamento. O tratamento foi iniciado 16 dias após o implante do tumor para o Estudo 1 e Estudo 3, e 17 dias após a implantação para Estudo 2. Todos os ratinhos tratados com o cocktail AB0041 /AB0046 receberam uma dose de carga de AB0046 de 50 mg /kg no primeiro dia de tratamento. AB0041 e AB0046 foram depois doseados por injecção intraperitoneal duas vezes por semana a 15 mg /kg, quer individualmente quer em combinação (no grupo de combinação, cada anticorpo estava presente a 15 mg /kg). Os ratinhos de controlo foram doseados com veículo (PBS, 0,01% de Tween-20). Primário tamanhos dos tumores e os pesos corporais foram medidos (por compasso de calibre ou pela balança electrónica, respectivamente) duas vezes por semana para o estudo 2 e estudo 3, e uma vez por semana para as estimativas de tamanho baseados em Caliper Estudo 1. foram obtidos através da medição da dimensão menor perpendicular ( W) e grande dimensão (L) do tumor de palpação. volume tumoral aproximado (mm
3) foi calculada pela fórmula (W
2x L) /2.
Ratos foram terminadas aos 20 dias após o início do tratamento o tratamento (Estudo 3), 18 dias depois iniciação (Estudo 2), ou 28 dias após o início do tratamento (Estudo 1). Gatilhos para a eutanásia foram: volume de tumor 2.000 milímetros
3, perda de peso de 20%, observou interferência com uma função vital fisiológico, ou ulceração ou necrose do tumor. O tumor de cólon primário e de quaisquer órgãos com metástases foram colhidas no final do estudo e do tumor primário foi pesado após a excisão. Os tumores foram dividido e uma metade foi fixada em solução de formalina a 10% tamponada neutra para análise histológica. A outra metade e todos os tumores metastáticos GFP-positivas a partir de outros órgãos foram colocados em cassetes de tecido e foram congelados instantaneamente em azoto líquido. O sistema de imagem FluorVivo (INDEC Biosystems, Santa Clara, CA) foi usado para imagiologia de corpo inteiro. Na necropsia, imagiologia aberto foi realizada na cavidade torácica e abdominal para a área de inspecção de metástases para os nódulos linfáticos, pulmões e outras áreas. A presença de tecido necrosado em H secções de tumor E-manchado foi avaliada por um patologista credenciado
Imunohistoquímica
tecidos congelados foram embutidos em temperatura de corte óptima (OCT-Tissue Tek, VWR. , Brisbane, CA) composto por imersão num banho de gelo seco isopentano (-70 ° C). Os tecidos foram recuperados e armazenados a -80 ° C. oct-blocos contendo tecido foram seccionados num criostato (Leica CM1850), e cortado em criosseções de 5 um de espessura, que foram colocadas em lâminas SuperFrost carregados positivamente (VWR). Para (FFPE) blocos de tecido embebidos em parafina fixadas em formalina, 5 seções mm de espessura foram cortadas, montadas em lâminas SuperFrost, e cozido a 60 ° C durante aproximadamente 20 minutos.
A menos que indicado de outra forma, todos os reagentes IHC e equipamentos foram Biocare de Medicina (Concord, CA), IHC procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, e todas as lâminas foram coradas utilizando o Nemesis 3600 de Biocare médica. Pré-fixação (cortes de tecido congelados): lâminas foram fixadas com paraformaldeído a 4% (VWR) e, em seguida, enxaguados em PBS contendo 0,02% de Tween-20 (PBST), em preparação para o IHC. A desparafinação /Antigen Recuperação (tecidos FFPE): as lâminas foram imersas em 1x Universal Decloaker solução e aqueceu-se a 90 ° C durante 45 minutos na câmara decloaking, então submersos em Hot Enxaguamento 20 vezes, e equilibrada com água destilada. Autostainer: lâminas foram tratadas com Peroxidazed e bloqueadas com fundo atirador antes da incubação com o anticorpo primário em Diluente da Vinci verde durante 30 minutos. O anti-MMP9 (ab76003), anti-colagénio IV (ab6586), e anti-PM2K (ab58822) anticorpos foram obtidos a partir de Abcam (Cambridge, MA). O anti-mieloperoxidase (MPO, A0398) foi obtido a partir de Dako (Carpinteria, CA). As lâminas foram então lavadas em TBS-Autowash. O kit de polímero Mach 2 foi utilizada para a detecção de antigénio através da adição de anticorpo secundário anti-coelho (conjugado com peroxidase de rábano) por 30 minutos. DAB (3, 3-diaminobenzidina) cromogénio foi adicionada às lâminas durante 1 minuto, seguido por uma única lavagem em TBS-Autowash e uma única lavagem em água destilada. As lâminas foram então contrastadas com hematoxilina de CAT, seguido por desidratação manual com álcool graduado, em seguida, montado com meios de montagem Entellan. Todas as lâminas foram visualizados usando um microscópio óptico Leica DFC500.
Bem-estar animal
Todos os estudos realizados com camundongos ou ratos foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovados pelo IACUC local, supervisionando cada local onde foram realizados estudos: biomodelos Institucional animal Care e Use Committee (IACUC número de aprovação 09-1215-03); Comissão Aragen para Animal Care e Uso (IACUC número de aprovação SA-003-A); Animal Care e Use Committee em AntiCancer (IACUC número de aprovação 14-090).
Gráficos e análise estatística
Os dados foram analisados e visualizados usando software Prism (GraphPad, v5.01). Para avaliações clínicas, histológicas e imuno-histoquímica, a importância da regulação dos grupos de tratamento versus o grupo de veículo foi avaliada como se segue: O D’Agostino Pearson teste de normalidade omnibus foi utilizado para determinar se os dados eram normalmente distribuídos. Os dados eram normalmente distribuídos foram avaliados por um ANOVA de uma via com o pós-teste múltiplo de comparação de Dunnett. Os dados não-normalmente distribuídos foram avaliados por um ou outro um teste de Mann Whitney (para análise de pares) ou por um teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de comparações múltiplas de Dunn. O teste exato de Fisher foi utilizado para a análise de dados de metástases. denominações valor de P são como se segue: * 0,05, ** 0,01, *** 0,001, **** 0,0001.
Resultados
anticorpos
Geração e caracterização de anticorpos anti-MMP9
anticorpos monoclonais direcionados-MMP9 foram gerados pela imunização de camundongos com proteínas humanas ou MMP9 rato recombinantes, e candidatos foram identificados pelo
in vitro
triagem para meta vinculativa, a inibição da proteólise do substrato, e selectividade contra outros membros da família MMP. O processo de selecção produziu AB0041, que inibe tanto a MMP9 humana (hMMP9) e MMP9 de rato (rMMP9), mas não se liga a MMP9 rato (mMMP9); e AB0046, que inibe mMMP9 inversamente, enquanto não se ligar a rMMP9 ou hMMP9 (Tabela 1). Ambos os anticorpos tinham uma afinidade elevada e excelente potência: para AB0041 segmentação hMMP9, K
D (app) = 0,133 ± 0,030 nM e IC
50 = 0,172 ± 0,007 nM, e para AB0046 segmentação mMMP9, K
D (app) = 0,218 ± 0,097 nM e IC
50 = 0,029 ± 0,005 nM (Tabela 1). AB0041 e AB0046 eram altamente selectivo, com maior do que 500 vezes de selectividade para MMP9 contra outros membros da família de MMPs (incluindo a MMP2 altamente homóloga) (Tabela 1 e Tabela 2). Ambos os anticorpos se comportavam como inibidores não competitivos, como o
50 valores IC gerados em relação à atividade da enzima sobre um substrato de peptídeo não foi substancialmente afetada pela concentrações de substrato variando de 1-20? M (Fig 1A). Além disso, ambos os anticorpos inibiu a clivagem mediada por MMP9 do colagénio substratos de gelatina e de membrana basal IV fisiologicamente relevante, com potências semelhantes para os gerados no ensaio de substrato peptídico. O IC
50 de AB0041 foi de 0,34 ± 0,061 nM para a clivagem de gelatina (Fig 1B) e 0,30 ± 0,025 nM para a clivagem do colágeno IV (Fig 1C), eo IC
50 de AB0046 para a clivagem de gelatina foi de 0,26 ± 0,018 nM (Figura 1B). Rato MMP9 não humano digerir o colagénio IV, assim AB0046 não foi avaliada neste ensaio.