Abstract

sonic hedgehog (SHH) meduloblastoma (MB) subtipo é impulsionado por um CD15 + proliferativa tumor propagação de células (TPC), também considerado na literatura como uma célula-tronco do câncer putativa (CSC). Apesar de considerável pesquisa, grande parte da biologia desta TPC permanece desconhecida. Relatamos evidência de que a fosfatase e tensina homólogo (PTEN) e fosfoinositida 3-quinase (PI-3K) desempenham um papel crucial na propagação, de sobrevivência e de resposta potencial para a terapia neste CD15 + doença maligna CSC /TPC-dirigido. Usando o ND2-

SmoA1

modelo de rato transgénico para MB, mouse genética e xenotransplantes derivados do paciente (PDXs), demonstramos que o CD15 + TPCs são: 1) obrigatoriamente necessário para tumorigenicidade SmoA1Tg-driven 2) regulado por PTEN e PI-3K sinalização 3) seletivamente sensíveis aos efeitos citotóxicos de inibidores da PI-3K pan

in vitro

e

in vivo

mas resistentes à quimioterapia 4) no modelo do rato SmoA1Tg são genomically semelhante para Shh humana subgrupo MB. Os resultados proporcionam a primeira evidência de que PTEN desempenha um papel na sinalização e MB TPC biologia e que alvo inibidores de PI-3K e suprimir a sobrevivência e proliferação de células no interior do compartimento de células estaminais do cancro do rato e CD15 + humanas. Em contraste, células CD15 + TPCs são resistentes a cisplatina, temozolomida e o inibidor de SHH, NVP-EF-225, os agentes actualmente utilizados no tratamento de meduloblastoma. Estes estudos validar a eficácia terapêutica dos inibidores de PI-3K pan no tratamento de meduloblastoma dependente de CD15 + TPC e sugerem uma combinação sequencial de inibidores de PI-3K e quimioterapia vai ter aumentada a eficácia no tratamento desta doença.

Citation : Singh AR, Joshi S, Zulcic M, Alcaraz M, Garlich JR, Morales GA, et al. (2016) PI-3K Inibidores Preferencialmente alvo CD15 + Câncer Stem população de células em Medulloblastoma SHH conduzido. PLoS ONE 11 (3): e0150836. doi: 10.1371 /journal.pone.0150836

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 13 de outubro de 2015; Aceito: 19 de fevereiro de 2016; Publicação: 03 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Singh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Dados Microarray foram depositadas no banco de dados público GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), com o número de acesso GEO GSE41717

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão RO1 CA94233 -09 e FDA SR1 FD- 04.385 para LDN e doações de Alex Lemonade Levante Fundação para o cancro da infância (ALSF), (Springboard Grant) e esperança de Hyundai nas rodas Foundation, esperança Grant, Cricket Corporation e Olivia Fundação Hudson. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Joseph R. Garlich e Guillermo A. Morales são empregados por SignalRx Pharmaceuticals. SignalRx Pharmaceuticals forneceu apoio sob a forma de salários para os autores JRG e GAM, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘

Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações: Autores Joseph R. Garlich e Guillermo A. Morales são empregados por SignalRx Pharmaceuticals. Dr. Durden divulga conflito financeiro de interesse em SignalRx Pharmaceuticals e na droga SF1126. Existem as seguintes patentes relativas a pertinente material a este artigo (PI-3 quinase inibidor pró-drogas patente não: 6.949.537). A relação entre o Dr. Durden e SignalRx foi internamente revisto e aprovado pela Universidade da Califórnia, San Diego, de acordo com o seu políticas de conflito de interesse. Este estudo foi financiado em parte por Cricket Corporation. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de partilha

Abreviaturas:. CSC, células-tronco do câncer; TPC, tumor de células de propagação; PI-3K, fosfatidilinositol 3-quinase; PTEN, fosfatase e homólogo de angiotensina; PDX, derivado do paciente xenotransplante

Introdução

Meduloblastoma (MB) é um tumor cerebelar agressivo e o tumor maligno cerebral pediátrico mais comum [1, 2]. O actual tratamento para meduloblastoma inclui ressecção do tumor seguida de radiação e quimioterapia, que inclui os regimes de cisplatina. Embora a taxa de cura é de 50-80%, os sobreviventes sofrem efeitos secundários graves, incluindo o retardo de crescimento, distúrbios endócrinos, e déficits neurocognitivos marcados [3]. Assim, são urgentemente necessárias terapias mais eficazes e menos tóxicos para meduloblastoma. Recentemente, vários grupos [4-8] têm realizado gene profiling expressão e análise de DNA-copy-número de MB, e identificaram pelo menos quatro grandes subtipos da doença: WNT, Sonic hedgehog (SHH), Grupo C e Grupo D . Estes subtipos moleculares têm características distintas em termos de expressão genética, padrões de mutação, epidemiologia e prognóstico. Entre os subtipos moleculares, tumores associados com a activação descontrolada da via SHH são geralmente definida como MB SHH. A via SHH é uma cascata de sinalização embrionária essencial que regula células-tronco e diferenciação de células progenitoras em vários processos de desenvolvimento [9]. Mutações no supressor via SHH

remendado

ou alterações de outros componentes da via SHH resultar em sua ativação permanente e formação de tumor MB [10, 11]. Cerca de 30% de MB exibe activação descontrolada da via de sinalização de SHH [11]. Embora, diversos (SMO) antagonistas smoothened incluindo NVP-LDE225 GDC0449 estão actualmente a ser avaliadas em ensaios clínicos em pacientes com meduloblastoma, ocorre um rápido desenvolvimento de resistência de tumores [12, 13]. Um estudo realizado por Buonamici et ai demonstraram que a resistência NVP-LDE225 em MB é mediada pela activação da fosfoinositida 3-quinase (PI3K) via de sinalização. [14]. A literatura existente sugere que o supressor de tumor, PTEN e o seu objectivo de PI-3K são importantes na patogénese de SHH-MB associada [15-20]. análise genômica recente de tumores de meduloblastoma revelou que a mutação PI-3K (PIK3CA, PTEN, PIK3C2G) é frequente em tumores subgrupo SHH [21, 22]. Em um dos estudos, de 13 tumores do subgrupo Hedgehog perfilados, 2 tinham mutações de perda de função em

PTEN

, e outro paciente tinha uma mutação ativadora em PIK3CA [22]. Em outro estudo, de 133 MB SHH tumores perfilados, PI-3K via é mutado em 5% dos MBs SHH [21, 22]

Vários relatórios indicam que MB é impulsionado por células-tronco resistentes tratamento. -como células, denominado haste cancro células /células de tumor de propagação (CSC /TPCs). estudos de referência demonstram que as amostras de tumor extraído de modelos MB genéticos murino, Sonic hedgehog (

SHH-Remendado) e da MB humana, são propagadas por células que expressam o CD15 progenitor marcador /óssea [23, 24]. CD15 é um antigénio de hidrato de carbono que é expresso em ambos os progenitores e células-tronco no sistema nervoso central embrionário e adulto [25, 26], e sobretudo é considerada como um importante marcador de TPCs no subgrupo SHH de meduloblastoma [23].

TPCs são considerados proliferativa e um dos principais contribuintes para a resistência do tumor e a recorrência [27-30]. Vários estudos têm demonstrado um papel para a via PI-3K /AKT na proliferação e propagação de TPCs [31-33]. Os relatórios demonstraram que o bloqueio da actividade de PI-3K suprime a proliferação de TPCs nos cancros da mama, ovário e outros cancros [34]. Hambardzumyan

et al

. sugeriu que a atividade da via PI-3K regula a sobrevivência de células-tronco do câncer depois da radiação em meduloblastoma

in vivo

. [35]. Assim, temos a hipótese de que a segmentação do eixo sinalização PTEN-PI-3K no compartimento do MB TPC pode fornecer controle de tumor a longo prazo e /ou erradicação de meduloblastoma. Anteriormente, o nosso grupo tem relatado que heterozigosidade de PTEN promove tumorigênese em humanos e no

SmoA1

modelo de mouse meduloblastoma [15]. Nós relatado que 61% dos tumores de meduloblastoma humano perderam a expressão da proteína PTEN e esta perda de PTEN é de significado prognóstico desta doença (15). Aqui, usando o

SmoA1Tg

modelo do rato e amostras de tumor MB paciente xenotransplante humanos primários (PDXs), observou-se que a capacidade de propagação do tumor de CD15 + TPCs em SHH-driven MB é regulada, pelo menos em parte, pela PTEN- PI-3K vias de sinalização, e que a segmentação deste eixo uso de inibidores de PI-3K pode bloquear a

in vivo

propagação de TPCs e induzir a apoptose.

Materiais e Métodos

animal estudos

ND2:

SmoA1

(

SmoA1

) camundongos transgênicos foram um presente de James Olson (University of Washington, Seattle, WA) [36]. Os ratos foram mantidos no biotério Moores Cancer Center na Universidade da Califórnia, San Diego, e todas as experiências foram realizadas utilizando procedimentos aprovados pela Universidade da Califórnia, San Diego comitê IACUC.

implantação estereotáxica de células tumorais

implantação estereotáxica de células de tumor foi realizado tal como descrito anteriormente [23, 37]. Nude

camundongos

nu-nu foram anestesiados com 60 mg /kg de cetamina (Fort Dodge Saúde Animal), acrescido de 20 mg /kg de xilazina (Ben Venue Laboratories) e posicionado em um quadro estereotáxico com um adaptador de mouse (Kopf Instruments ). Foi feita uma incisão na linha média do couro cabeludo através do cerebelo, e um pequeno buraco foi feito no crânio (3 mm para a direita e de 1 mm anterior ao bregma) usando um (ponto afiado) chanfrada 25 L agulha. A 30 seringa Hamilton de calibre carregado com células foi montado em um micromanipulador e introduzido através do furo para a superfície inferior do lóbulo frontal direito, a uma profundidade de 4,5 mm. +/- tumorais células CD15 (não cultivadas) recém-ordenados foram injetados ao longo de 2 minutos, e a agulha foi deixada no local por mais de cinco minutos para evitar o refluxo. Finalmente, a pele foi fechada com 6-0 rápida absorção de sutura do intestino liso usando um PC-1 agulha 3/8 de corte (Ethicon). Os animais foram monitorados continuamente durante e no pós-operatório para assegurar que os ratos se recuperaram da cirurgia e são ambulatorial sem evidências de desconforto. efeitos dolorosos e estressantes potenciais desta cirurgia sobrevivência incluem: 1) má alimentação, perda de peso 2), 3) fir babados, 4) perda de mobilidade na gaiola, 5) evidência de infecção no sítio cirúrgico. A buprenorfina analgésico (0,1 mg /kg) foi injectada em caso de dor ou desconforto. suturas e /ou agrafos não absorvíveis foi removido 10-14 dias após a cirurgia. Se morbidade não é corrigida por nossas intervenções, os ratos foram sacrificados utilizando CO2 seguido por deslocamento cervical

isolamento celular citometria de fluxo

As células tumorais foram isolados a partir de PDX, bem como ratinhos SmoA1Tg 4 a 6 meses de idade como se segue. Resumidamente, o tecido do tumor foi cortado em pedaços pequenos, e incubou-se a 37 ° C durante 30 min em tampão de digestão consistindo em PBS de Dulbecco (DPBS, Life Technologies, Grand Island, NY) com 10 U /mL de papaína (Worthington, Lakewood, NJ) , 200 ug /ml de L-cisteína, e 250 U /ml de DNase (Sigma, St. Louis, MO). O tampão de digestão foi então removido e substituído com DPBS contendo inibidor de 8 mg /ml de tripsina de soja (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 8 mg /ml de albumina de soro bovino (BSA, Sigma), e 250 U /DNase ml, seguido de titulação de tecido, utilizando pipetas de diminuição do tamanho do orifício para se obter uma suspensão de célula única. As células foram centrifugadas à temperatura ambiente e ressuspensas em PBS contendo 200 ug /ml de BSA (PBS /BSA) e passada através de um filtro celular (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) para remover os detritos. Esta suspensão foi centrifugada através de um gradiente de passo de 35% e 65% Percol (Amersham Biosciences), e as células foram colhidas a partir da interface a 65% a 35%, lavou-se em PBS /BSA. Para a triagem de células CD15 + e células CD15-, células tumorais foram re-suspensas em tampão FACS (DPBS + 2% de FBS) e coradas durante 30 min com anticorpo CD15 (BD Biosciences, N ° Cat. 340850, antibodiy primária) lavadas com tampão FACS, coradas durante 30 minutos com antibodiy secundário (FITC), e, em seguida, analisados ​​ou classificados usando um FACSVantage sE citómetro de fluxo.

a proliferação celular, a incorporação de BrdU, a apoptose e a análise do ciclo celular

As células tumorais foram isolados como descrito anteriormente [23] a partir de pacientes derivado xenotransplantes humanos (PDX), bem como 4 a 6 meses de idade

SmoA1

PTEN + camundongos /+ exibindo sinais físicos e comportamentais de meduloblastoma.

FACS As células seleccionadas CD15 + e CD15- foram colocadas em placas a 4 x 10

4 células /cavidade em ligação placas de 96 poços, em meio isento de soro contendo suplementos B27 Neurobasal e ultrabaixa. As células foram incubadas durante a noite e tratadas com DMSO ou inibidores durante 48 horas. ensaio de viabilidade celular foi realizada utilizando AlamarBlue® (Roche) de acordo com o protocolo do fabricante. Para os estudos de incorporação de BrdU, as células tumorais foram isolados a partir do modelo de Smo A1 Tg tal como descrito acima. 2 milhões de células tumorais por poço foram plaqueadas em placas de 24 poços, em meio isento de soro contendo suplementos B27 e Neurobasal. As células foram pulsadas com BrdU durante 30 minutos e, em seguida, lavou-se com meios para remover qualquer remanescente de BrdU. As células foram recolhidos imediatamente após o pulso ( “30 minutos”) e coradas com anticorpo de CD15, como descrito acima. As células foram depois fixadas e coradas com FITC utilizando o kit BrdU de fluxo (BD Biosciences) e iodeto de propídio (PI) de acordo com as instruções do fabricante. A análise foi realizada utilizando um citómetro de fluxo FACS Calibur (BD Biosciences). Para os estudos de apoptose, as células CD15 + e CD15- foram tratadas com inibidor, durante 24 horas, seguida por ensaio da actividade da caspase-3 utilizando o kit (Roche) ou coloração com anexina V

anticorpo FITC e iodeto de propídio (PI) de acordo com as instruções do fabricante ( BD, Pharmingen, San Diego, CA). Para ciclo celular conteúdo de DNA análise foi analisado com fluxo FACS Calibur citômetro (BD Biosciences).

Western blot análise

FACS classificadas CD15 + ou células CD15- foram tratadas com diferentes concentrações de inibidores ou DMSO para 30 minutos e depois estimuladas com IGF 50 ng /ml durante 30 minutos. As células foram lisadas com tampão de lise RIPA (Pierce) contendo mistura de inibidores de protease. As proteínas foram quantificadas pelo ensaio de proteína BCA (Pierce) e quantidades iguais de proteína foram resolvidos em gel de poliacrilamida, transferidas para membrana de nitrocelulose e sondados com anticorpos primários seguintes: (. N�cat 9271) p-AKT (Ser473), p-AKT ( Thr308) (cat no. 9275), AKT (cat no. 9272), p-p70S6K (Thr389) (cat no. 9205), p70S6K (cat no. 2708), p-4EBP1 (Thr37 /46) (cat no. 2855), 4EBP1 (cat no. 9452), vantagens (Thr202 /Tyr204) (cat no. 9101), p-PRAS40 (Thr246) (cat no. 2997), PRAS40 (cat no. 2610), p27 KIP1 (cat não . 2552), p-MDM2 (S166) (cat não 3521), Bad (cat não 9292) e PARP (cat não 9542) (todos da sinalização celular Technologies)…;

análise quantitativa em tempo real

O ARN foi extraído a partir de CD15 p21 Cip1 /WAF1 (SC-397), Bax (SC-493) e β-actina (SC-47778) a partir de Santacruz. + e as células CD15- utilizando o estojo RNeasy (Qiagen, Germantown, MD) de acordo com as instruções do fabricante. Para RTPCR, o ADNc foi preparado a partir de amostra de ARN de 1 ug, utilizando o kit de síntese de ADNc iscript (Bio-Rad, Hercules, CA). O ADNc foi amplificado por meio de reacções de RT-PCR com 1 × SYBR Supermix verde (Bio-Rad, Hercules, CA) em placas de 96 poços em um sistema de tempo real CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando diferentes iniciadores de humano ou de ratinho genes. A sequência dos iniciadores são como descritos na Tabela S1. os níveis de expressão relativa foram normalizadas para expressão de GAPDH de acordo com a fórmula de 2 ^ (gene Ct de interesse-Ct GAPDH) .

In-vivo

tratamento BKM120

Para estudar o efeito da BKM-120 no crescimento do tumor

in vivo

, CD15 + e CD15- foram implantadas intracranialmente TPC para o cerebelos de ratos NSG secundárias ou por via subcutânea em ratinhos nu-nu. Para os tumores subcutâneos, 20 dias após o transplante, os ratinhos foram separados aleatoriamente em dois grupos: o Grupo 1 recebeu veículo (não tratado) e o Grupo 2 foi dado 30 mg /kg BKM-120 por sonda oral uma vez por dia durante 21 dias. dimensões do tumor foram registados todos os dias e terceiro volume do tumor foi medido utilizando a seguinte fórmula: volume = comprimento x 0,5 x (largura)

2. Para os tumores intracranianos, 40-50 dias após a implantação, os tumores foram verificados por ressonância magnética e divididos em grupos e tratados tal como descrito para os tumores subcutâneos. Medição do volume do tumor para tumor implantado por via subcutânea foi feita por pinças e para Tumor implantado intracraniana foi realizada por imagem de ressonância magnética (MRI). MRI foi realizada utilizando uma 1,0-t MRI. Os ratos foram anestesiados com 2% de isoflurano e os ratos foram então fotografada com um aspecto M2 de 1,0 Tesla scanner de pequenos animais (Aspect imageologia; Shoham, Israel). -T2 ponderada, as imagens foram obtidas usando um tempo de repetição de 2500 ms, um tempo de eco de 60 ms, uma espessura de corte de 1 mm, campo de visão de 35 mm e um tamanho de matriz de 184 x 184 (em resolução do plano de 35 /184 = 0,19 milímetro). Para os estudos de imagem de RM, os volumes dos tumores foram medidos por tumores segmentar manualmente usando qualquer software Image Browser da Varian ou do domínio público programa ImageJ Imagem (https://rsb.info.nih.gov/ij). imagens ponderadas em T2 foram por vezes usados ​​para ajudar a esclarecer margens do tumor.

isolamento tumor humano e propagação

tecido MB Humano para xenotransplantes derivados de pacientes foi obtido a partir da ressecção cirúrgica de tumores do Hospital Rady Children ( San Diego, CA). Todos os procedimentos que utilizam tecido humano foram aprovados pelos Institutional Review Boards de Hospital de Rady Children. Após a recuperação, o tecido foi dissociado mecanicamente em uma suspensão de uma única célula, então imediatamente injectados no cérebro de ratinhos NSG. Quando os ratos tornou-se sintomático, os tumores foram novamente dissociada em uma única célula suspensões e então re-transplantadas de volta para o cérebro dos exércitos ingênuos para estabelecer uma linha propagado para cada xenoenxerto derivado do paciente.

análise Microarray

SmoA1Tg

células tumorais foram separadas em populações CD15 + e CD15- e utilizado para o isolamento de RNA usando RNeasy Kit (Qiagen, Germantown, MD). a integridade de ARN foi avaliada usando um Agilent Bioanalyzer 2100. Amostras que apresentem a integridade do RNA (NIR) superior a 8,0 foram utilizados para a análise de micro-arranjo. O ARN foi marcado e hibridado para arranjos Affymetrix rato Genoma 1,0 ST. Os dados de matriz foram processados ​​pelo software de RMA. Análise de significância de software Microarray (SAM) foi utilizado para determinar a expressão diferencial com uma taxa de detecção falsa (FDR) 1% e uma dobra-mudança mínima de 2 a menos que indicado de outra forma. Mc_ui_heatmap foram gerados utilizando o pacote de R. dados de expressão de genes foram transformados em Z-pontuação e agrupamento hierárquico com uma distância Euclidiana foi aplicado para gerar os dendrogramas de linha e coluna. dados de microarranjos foram depositadas no banco de dados público GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), com o número de acesso GEO é GSE41717.

subclasse e análise submapa para comparar CD15 murino + TPCs para MB subgrupos humanos

MB subclasse e análise submap, o que permite uma plataforma cruzada de espécies cruzadas e comparação dos dados de microarray com base nas estatísticas de Kolmogorov-Smirnov (33), foi utilizado para comparar os tumores de murinos para o humano amostras MB descritos em [4]. O módulo de mapeamento da subclasse no pacote de software padrão Gene (www.broadinstitute.org/genepattern) foi utilizado para comparar o conjunto de dados do mouse para um conjunto de dados de expressão gênica composto por MB humanos primários classificados em subtipos moleculares (C1-C6) como definido na Cho et ai. e uma série de amostras de cerebelo normais e tumores rabdóides teratóides atípicos [4]. A análise dos resultados são representados como uma associação subclasse (SA) de matriz preenchida com valores de p para cada associação subclasse.

análise

Gene conjunto de enriquecimento (GSEA)

GSEA foi realizada como descrito em [ ,,,0],38]. Resumidamente, os genes foram ordenados com base na sua expressão diferencial entre duas classes (CD15 + vs. CD15-). Uma pontuação de enriquecimento (ES) foi então calculado para cada conjunto de genes. conjuntos de genes com um valor de p 0,05 foram incluídos como significativo. Para esta análise, foram utilizados conjuntos de genes com curadoria (c2) a partir MSigDB v.3.0 (https://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp). A análise PCA dos 22 genes de ponta identificados na avaliação submapa foram comparados entre barreira das espécies em CD15 +, CD15- e no banco de dados de expressão de genes MB tumor humano [4].

Resultados

PI- sinalização 3K é altamente elevados em CD15 + TPCs isolado do

SmoA1 TG em modelo de rato meduloblastoma

está bem estabelecido que CD15 é um marcador de células tumorais propagação no modelo de Ptc +/- de meduloblastoma SHH impulsionado [ ,,,0],23]. No presente estudo,

ND2SmoA1

rato transgénico modelo foi utilizado para caracterizar as vias de sinalização necessários para a proliferação de CD15 + TPCs. Primeiro, realizamos experimentos preliminares no nosso

SmoA1

modelo para validar que CD15 é um marcador da superfície celular para células tumorais propagação neste Shh impulsionado modelo de meduloblastoma. Para este efeito, num ensaio de transplante ortotópico foi estabelecida, na qual

SmoA1

PTEN + /+ tumor células foram separadas em fracções de CD15 + e CD15-, e 2 x 10

6 células de cada fracção foram estereotaxicamente implantados no cerebelo de

camundongos

nu /nu-nu. S1A figura mostra os dados de FACS de validação que pura CD15 + população é isolado a partir dos tumores. Como mostrado na Fig S1B, implantação de apenas CD15 + TPCs resultou em tumores secundários dentro de 10-12 semanas que se assemelhavam histologicamente os tumores primários a partir do qual as células foram derivadas (dados não apresentados). Na Fig S1B, demonstramos Ki67 coloração apenas nos tumores secundários derivados de CD15 + TPCs indicando o índice proliferativo maior destas células em relação à normal do cérebro. Além disso, nossos resultados demonstram que apenas CD15 + células de

SmoA1 PTEN + /+

meduloblastoma podem gerar tumores

in vivo

. De modo a avaliar ainda mais a células estaminais como células CD15 + propriedades de TPC, foi realizada análise por PCR em tempo real de uma série de marcadores de células tronco e os resultados demonstram que determinados marcadores de células estaminais e.g. oct4, KLF4, Sox2, CXCR4, pou5f1, NANOG, nestin e Musashi são altamente enriquecido no compartimento de CD15 + TPC no

SmoA1

Tg modelo de rato (S1C Fig). A fim de obter mais conhecimentos sobre o tumor propriedades das células CD15 + de propagação, foi realizada uma série de análises bioquímicas e genómicas de populações de células CD15 + e CD15- isoladas de

SmoA1

tumores Tg. Com base nesta análise, descobrimos que a CD15 + população isolada de Smo

A1

Tg modelo do rato de formulário neurospheres (dados não mostrados), exiba um padrão de expressão distinta e são altamente proliferativa como revelado pelo aumento do número de células viáveis ​​ao longo do tempo (Figura 1A, o painel esquerdo) e uma maior incorporação de BrdU nas células CD15 +, em comparação com células CD15- a partir do mesmo tumor (Fig 1A, painel da direita). Este resultado é também apoiada pela maior H

incorporação de timidina-3 (dados não mostrados) em células CD15 +, em comparação com células CD15-. Os dados apresentados na Tabela S2 e S2 figura mostra que os genes relacionados com a proliferação e a sobrevivência das células (Fig S2A), via de sinalização de SHH (S2B S2C fig) e angiogénese (Fig S2D) são altamente elevada na população CD15 +. No geral, estes dados indicam que a capacidade de propagação do tumor de células CD15 + está associada com uma maior capacidade para proliferar e uma diminuição da tendência para sofrer apoptose e diferenciação.

CD15 + isoladas a partir de TPCs

SmoA1

Tg modelo do rato meduloblastoma são altamente proliferativa e mostra elevada sinalização PI-3K (A) O painel esquerdo mostra a proliferação de células CD15 + e CD15- isoladas de

Smo A1

tumores. Separadas por FACS CD15 + CD15- células de tumor e (n = 4) foram cultivadas durante 48 horas em meio isento de soro, seguido por adição de AlamarBlue® e incubação das placas a 37 ° C em 5% de CO

2, durante 6 horas. sinais de fluorescência foram lidos como emissão a 590 nm após excitação a 560 nm. painel direito mostra a incorporação de BrdU em CD15 + e as células CD15- isolados do Smo A1 Tg. CD15 + e CD15- de tumores foram pulsadas com Smo BrDU como descrito em Materiais e Métodos. (B) CD15 + separadas por FACS e as células CD15- foram analisadas quanto à expressão de PTEN e fosforilação de Akt, 4EBP1, p70S6K e Erk. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Análise (C) PCR quantitativa de ARNm para a expressão de PTEN em células separadas por FACS CD15 + CD15- e (n = 3). os níveis de expressão relativa foram normalizadas para expressão de GAPDH. Experiência foi repetida 3 vezes com resultados semelhantes.

PI-3K /AKT tem demonstrado ser importante para a proliferação de TPCs em ambos os tumores sólidos e leucemia [31-33]. A fim de examinar o potencial papel mecanicista para a via de sinalização PI-3K na propagação TPC e sobrevivência no meduloblastoma, determinou-se o estado de ativação relativa da PI-3K /AKT em CD15 + TPCs vs. CD15- não TPCs. A análise Western blot revelaram que CD15 + células têm menores níveis basais de expressão de PTEN e tem um eixo de sinalização PI-3K activadas em comparação com as células CD15-, mostrando um aumento substancial na fosfo-AKT, fosfo-S6 e fosfo-4EBP1 (Fig 1B). Estes resultados foram confirmados pelos níveis aumentados de ARNm de PTEN detectado na população CD15-, em comparação com as células CD15 + (Fig 1C). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a expressão de PTEN é reprimidos e sinalização PI-3K é elevada em CD15 + TPC, em comparação com a população CD15-.

segmentação preferencial de TPC por inibidores de PI-3K

in vitro

os resultados anteriores demonstram que a sinalização de PI-3K é regulada positivamente em células CD15 + TPC como determinado pelos níveis mais baixos de PTEN e a activação de AKT. Assim, a hipótese de que o tratamento de células CD15 + com inibidores da PI-3K seria preferencialmente bloquear a proliferação de CD15 + TPCs. Para isso, foram utilizados um painel de inibidores de PI-3K, SF1126 [39], BEZ-235 [40] (produtos químicos Selleck), PF4691502 [41] (produtos químicos Selleck) e BKM120 [42] (Novartis). Cisplatina, TMZ e NVP-LDE-225 foram comprados de Selleck Chemicals. Os resultados na figura 2A mostram que, embora a dose inibidores da PI-3K dependente reduzir a proliferação tanto de células CD15 + e CD15- TPCs isolado a partir de

SmoA1

modelo de ratinho Tg, foi mais potente contra CD15 + população. A IC

50 para BKM120, BEZ, PF4691502 e SF1126 é 0,156 uM, 0,167 uM, 2,6 uM e 4,3 uM para células CD15 + e 6,17 uM, 5,54 uM, 4,8 uM e 19,9 ^ M ou células CD15-, respectivamente. Trabalho anterior sugeriu que BKM120 tem uma excelente penetração de barreira hematoencefálica [42]. Por isso, escolhemos BKM120 para os nossos

In vivo

estudos. As terapias atuais para crianças mais novas com meduloblastoma incluíram o uso de abordagens quimioterápicos multiagentes incluindo os agentes quimioterápicos, a temozolomida, cisplatina [43, 44] e NVP-LDE225, um antagonista Smo desenvolvido pela Novartis [45]. Assim, examinamos a citotoxicidade relativa destas drogas em células CD15 + contra células tumorais CD15-. Para estas experiências, as células CD15 + e CD15- isoladas de Smo

A1

modelo de Tg foram tratados com BKM120, cisplatina, TMZ, NVP-LDE225 ou combinação de BKM120 com cisplatina ou TMZ ou NVP-LDE225. Curiosamente, cisplatina (IC

50 11,4 uM para células CD15 + e 4,5 uM para células CD15-) e TMZ (IC

50 30 uM para células CD15 + e 20 uM para células CD15-) não tem qualquer efeito, enquanto NVP- EF-225 (IC

50 2,8 uM para células CD15 + e 2,5 uM para células CD15-) tem muito menos efeito sobre a sobrevivência de células CD15 + (Figura 2B), o que sugere que a CSC /TPCs são resistentes à quimioterapia convencional. S3A e S3B Fig mostra o efeito dependente da dose de cisplatina e células TMZ sobre CD15 + e CD15-. NVP-LDE-225 mostrou efeitos citotóxicos em doses elevadas em células CD15 + e CD15-, sem efeito significativo a 100 nM conc. (S3A S3B fig) É interessante notar a combinação de BKM120 cisplatina e BKM120 TMZ não resultou em aumento de actividade de citotoxicidade nas células CD15 + (Figura 2B). No entanto, a combinação dos BKM120 e NVP-LDE225 mostrou sinergia nas células CD15 + (Figura 2B). A seguir determinada, se inibidores da PI-3K pode bloquear a cascata elevada sinalização PI-3K em CD15 + TPCs. Tratamento de CD15 + células com diferentes doses de BKM120 durante 30 minutos, a fosforilação inibida de AKT, seus jusante PRAS40 alvo e mTOR substratos PS6, p4EBP1 de um modo dependente da dose (Fig 2C) exibindo uma diminuição dramática a 2.0 uM e inibição quase completa a 10,0 uM. análise de PCR em tempo real demonstraram que 2 concentração M de BKM120 suprimiu completamente a expressão de genes da via SHH viz.,

Gli1

,

Gli2

,

N-Myc

,

C-Myc

, e

ciclina D1-

(Fig 2D).

segmentação preferencial de TPCs por inibidores de PI-3K

in vitro

(a) Efeito de inibidores de PI-3K sobre a proliferação de células CD15 + e CD15-. As células CD15 + e CD15- foram cultivadas em meio livre de soro contendo nenhum aditivo, DMSO (veículo), BKM-120, BEZ-235, PF-04691502, e SF1126 no cone diferente. Após 48 h, foi adicionada AlamarBlue® e as placas foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2, durante 6 horas. sinais de fluorescência foram lidos como emissão a 590 nm após excitação a 560 nm. As células CD15 + e CD15- (B) foram tratadas com 100 nM Conc. de cisplatina, TMZ, NVP-EF-225 isoladamente ou em combinação com BKM 120 e analisadas quanto à viabilidade celular utilizando Azul de Alamar. (C) CD15 + foram tratados com TPCs BKM120 durante 30 minutos seguido de estimulação com IGF (50 ng /ml). Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por Western blot para a fosforilação de substratos de sinalização de PI-3K. (D) A expressão relativa de genes de vias SHH em BKM120 tratada (0,2, 2,0 uM) e não tratada CD15 + TPCs. os níveis de expressão relativa foram normalizadas para GAPDH. Gráficos apresentam significa ± SEM de 3-4 ratos em cada grupo para B e D. A significância estatística é avaliada por duas amostras

t

-test onde * denota

P Art 0,05, ** denota

P Restaurant 0,01 e *** denota

P Art 0,001. Experimento foi repetido 4-5 vezes com resultados semelhantes

sensibilidade diferencial de CD15 + vs células CD15- a PI-3 quinase inibidor.; A inibição da via PI-3K suprime a proliferação através da indução de paragem do ciclo celular e induzir a apoptose em células CD15 + TPCs mas não em células CD15-

A seguir foi investigado se os inibidores da PI-3K pode induzir a paragem do ciclo celular no compartimento de células CD15 + TPC . Para isso, numa primeira fase, as percentagens de base de células CD15 + e CD15- em diferentes fases do ciclo celular e descobriu que 67% 26% do CD15- TPCs estavam na fase G0-G1 em relação a fase S, respectivamente, enquanto que CD15 + células compreendem 48% e 45% das células na fase G0-G1 em relação a fase S, respectivamente (Figura 3A). Além disso o tratamento de células CD15 + TPCs com BKM120 resultou em paragem do ciclo celular com um aumento proporcional na G0-G1 e uma diminuição no número de células na fase S do ciclo celular (Figura 3A, painel esquerdo), enquanto que o tratamento de CD15- células com BKM120 não mostrou qualquer alteração na percentagem de células em G0-G1 em relação a fase S do ciclo celular (Figura 3A, painel da direita).