Abstract

RNAs não-codificantes (ncRNAs) são o produto dominante da transcrição eucariótica. Estes produtos variam de microRNAs (miRNAs curtas) para RNAs não-codificadores longos (intergênicas lincRNAs). RNAs circulares compostos por sequências ex�icas representam uma forma pouco estudado da ncRNA que foi descoberto mais de 20 anos atrás. Utilizando um ensaio de transcriptase reversa reação em cadeia da polimerase com base em TaqMan, foi analisada a relação entre a

cir-coceira

expressão e câncer colorretal (CRC), em um total de 45 CRCs e amostras de tecidos não tumorais adjacentes emparelhados. Descobrimos que

cir-coceira

expressão foi tipicamente regulada no CRC em comparação com o tecido peritumoral. Este resultado, assim como várias experiências de acompanhamento, mostrou que

cir-coceira

poderia aumentar o nível de

comichão, a qual está envolvida na inibição da via /β-catenina Wnt . Portanto, nossos resultados mostraram que

cir-coceira

desempenha um papel na CRC através da regulação da via Wnt /β-catenina

Citation:. Huang G, Zhu H, Shi Y, Wu W, Cai H, Chen X (2015)

cir-coceira

desempenha um papel inibitório no cancro colorectal, regulando a Wnt /β-catenina Caminho. PLoS ONE 10 (6): e0131225. doi: 10.1371 /journal.pone.0131225

editor: Yifeng Zhou, Faculdade de Medicina da Universidade de Soochow, CHINA

Recebido: 24 Abril 2015; Aceito: 30 de maio de 2015; Publicação: 25 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Wenzhou Ciência e Tecnologia Bureau Natural Science Foundation (Y20140700 Dr. XC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma neoplasia maligna que está situado no cólon ou do recto [1, 2]. CRC continua a ser uma das principais causas de mortalidade por câncer no mundo desenvolvido, em grande parte devido à sua propensão para metástase [3]. CRC um importante problema de saúde pública, como é o terceiro câncer mais comumente diagnosticado em homens ea segunda mais comum em mulheres. Tem havido muitos estudos comparativos demonstram mudanças epigenéticas intimamente associados com a ocorrência e desenvolvimento de CRC. Embora os resultados da investigação CRC são notáveis, os fatores etiológicos e mecanismos de patogénese subjacentes ao desenvolvimento CRC parece ser complexa e heterogênea.

Recentemente, RNA circular, um tipo de RNA não-codificante que normalmente não age através da codificação de uma proteína, verificou-se estar estreitamente relacionado com o desenvolvimento do tumor [4]. ARN circular é geralmente composto por mais do que um exão e é geralmente enriquecida com microARN funcional (miARN) sítios de ligação; por exemplo,

CDR1

contém vários sítios de ligação conservados para miRNA-7 (miR-7). Recentemente, um estudo relatou que

cir-coceira

é um RNA circular que se estende por vários exons de ubiquitina (Ub) ligase proteína (E3) (ITCH) [5-7]. O artigo indicou que

cir-coceira

abriga muitos locais de ligação de miRNA que se podem ligar à 3’UTR do

ITCH

, incluindo aqueles para miR-7, miR-17, miR-214 , o miR-128 e miR-216B [5, 8]. O estudo dos miRNAs é mais maduro do que o de RNA circular; miARNs são RNAs não-codificante de 21 nucleótidos de comprimento que têm um papel importante em numerosos processos biológicos em plantas e animais [9]. miARNs maduro desempenham papéis reguladores importantes no crescimento celular, proliferação, diferenciação e morte celular.

cir-coceira

desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão de CICAc [7].

alvos COMICHÃO ‘s

, incluindo p63, p73, e Notch1, são normalmente associados com a formação de tumores e quimio-sensibilidade, demonstrando a conexão de coceira para biologia do câncer [10]. pesquisa discutido anteriores RNA circular actividades anti-câncer em linhas celulares de melanoma maligno [11]. No entanto, não há estudos relatados sobre os papéis funcionais de RNA circular no CRC.

Neste estudo, a hipótese de que

cir-coceira

desempenha um papel semelhante no CRC. Para testar esta hipótese, desenvolvemos um método para delinear as diferenças de transcrição em

cir-coceira

entre CRC e os tecidos não neoplásicas adjacentes emparelhados.

Materiais e Métodos

Estudo assuntos

Todos os sujeitos deste estudo foram homogêneos chineses han. Quarenta e cinco amostras de tecido paracancerous CRC e correspondentes foram obtidas de pacientes no Primeiro Hospital Filiado de Wenzhou Medical College (Wenzhou). Não houve restrições sobre a idade, estágio de CRC, sexo ou histologia. No recrutamento, cada sujeito consentimento informado foi obtido por meio do agendamento de uma entrevista em que eles receberam um questionário estruturado. Este estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional de Wenzhou Medical College. As características clínicas de todos os pacientes estão listadas na Tabela 1.

cultura celular

O CRC linhas de células HCT116 humana e SW480 foram adquiridos a partir do celular Bank of Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências, Xangai Instituto de Biologia celular e foram passadas por menos de 6 meses.

Construção do plasmídeo RNA circular

Nós construímos o plasmídeo RNA circular utilizado neste estudo. O método de construção foi publicado anteriormente [8]. A construção resultante (

pcDNA3

.

1-cir-coceira

) foi verificada por sequenciação directa.

extração de RNA e em tempo real, reação em cadeia da polimerase quantitativa

o ARN total foi isolado a partir de células e tecidos, utilizando o reagente TRIzol de acordo com as instruções do fabricante. A expressão do gene relativa de

cir-coceira

foi determinada utilizando qPCR, que é baseado no método de TaqMan.

GAPDH foi usada como um controlo do padrão interno, e todas as reacções foram realizadas em triplicado [12, 13]. Os iniciadores utilizados para a amplificação é o qPCR GCAGAGGCCAACACTGGAA para a frente, o TCCTTGAAGCTGACTACGCTGAG inversa, o CCGTCCGGAACTATGAACAACAATGGCA sonda.

RNase R digestão

A reacção de digestão de ARNase R foi realizada seguindo procedimentos publicados anteriormente. As reacções de digestão e de precipitação foram repetidos duas vezes com uma proporção de 3 U de enzima /mg de ARN [14].

As transfecções transientes e ensaios de luciferase

células HCT116 e SW480 foram transfectadas com o repórter plasmídeos descritos acima, utilizando Lipofectamine 2000. as culas foram co-transfectadas com os miARNs de acordo com as instruções do fabricante [15]. Cada grupo incluiu 6 repetições, e experiências independentes em triplicado foram realizadas.

actinomicina D ensaio

células HCT116 e SW480 foram transientemente transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 e foram co-transfectadas com ARNm, tal como indicado, durante 24 h . As células foram então expostas a actinomicina D. As células foram colhidas, e a estabilidade da

cir-coceira

mRNA foi analisada por meio de PCR quantitativa de transcrição reversa (qRT-PCR). O ensaio foi realizado de acordo com o artigo anterior.

Western blot

análise de Western blot para avaliar Wnt3a, β-catenina e expressão β-acção foi levada a cabo tal como descrito anteriormente [16].

a viabilidade celular ensaio

a viabilidade celular foi medida utilizando o sistema de contagem celular Kit-8 (CCK-8) de acordo com as instruções do fabricante. Foram 6 repetições para cada grupo, e os experimentos foram repetidos pelo menos 3 vezes.

Análise estatística

A correlação entre a expressão de

cir-coceira

eo

gene ITCH

em tecidos CRC foi determinada utilizando análise de uma via de variância e modelos de regressão linear. As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste t emparelhado um, de Student 2-atado. A

P

-valor de . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Identificação da RNA circular

Dois conjuntos de

ITCH

iniciadores foram desenhados para este estudo: um conjunto divergente para amplificar somente a forma circular e uma convergente definida para amplificar as formas lineares. Confirmou-se que a forma circular foi amplificado utilizando os iniciadores divergentes. ADNc e ADN genómico foram utilizados como os controlos. Tal como esperado, nenhuma amplificação foi observada usando os iniciadores divergentes no ADN genómico. GAPDH foi usada como o controlo linear (Fig 1A).

(A) iniciadores convergentes pode amplificar ARN circulares e RNAs lineares. iniciadores divergentes amplificar ARN circulares apenas no ADNc em comparação com o ADN genómico (ADNg). GAPDH é o controle linear. (B) O

cir-coceira

foi expressa em um nível superior em cerca de 75,6% dos tecidos adjacentes CRC comparação para combinar tecidos CRC. O nível de expressão de

cir-coceira

foi analisada por qRT-PCR baseado em Taq-man e normalizadas para

GAPDH

. Os dados estão representados como a média ± SEM de três experiências independentes. (C) iniciadores aleatórios e iniciadores oligodT foram utilizadas, respectivamente, nas experiências de transcrição reversa. O previu

cir-coceira

está ausente em poli amostras enriquecidas (A). (D) A previsão do

cir-coceira

é reagir contra a tratamento RNase R. teste t de 2 caudas do estudante foram usadas no ensaio, as diferenças entre os grupos * p 0,05 em relação ao controle.

A expressão de

cir-coceira

no CRC e os tecidos circundantes

Foi utilizado o conjunto divergente de primers e utilizou uma base TaqMan- ensaio de qRT-PCR para validar a presença do RNA circular em 45 tecidos de CRC e tecidos emparelhados não-cancerosas.

cir-coceira

foi expressa a um nível superior em cerca de 75,6% dos tecidos CRC comparada com a das amostras não cancerosos correspondentes (Fig 1B).

Caracterização de

Cir -ITCH

em células CRC

construímos um vector para expressar

cir-coceira nas células na sequência do estudo anterior e, em seguida, realizou experimentos. Os plasmídeos construídos foram transitoriamente transfectados em células HCT116 e SW480.

Nos experimentos de transcrição reversa, foram utilizados iniciadores aleatórios e iniciadores oligo (dT). Os produtos circulares foram reduzidos nas amostras de poliA-enriquecidos em comparação com os produtos lineares. Ao usar o oligo (dT) iniciadores, a quantidade de expressão (normalizado para GAPDH) de linear

COCEIRA

foi significativamente mais elevada do que a de circular

COCEIRA

(Fig 1C) [11].

Nós usamos a enzima RNase R, exoribonuclease altamente processive 3′-5 ‘, para testar as nossas previsões das características de RNA circulares. Este exonuclease degrada moléculas de RNA lineares em uma “direção 3’-5, mas não funciona em RNAs circulares [17, 18]. Como esperado, em contraste com os RNAs de controlo lineares, os quais foram degradados, o ARN circular predito era resistente ao tratamento com RNase R (Figura 1D).

Interacção entre

cir-coceira

e miARN

recentemente, ARN circular tem sido identificada como uma classe abundante de transcritos reguladoras que funcionam como esponjas de miARN [5, 8]. O software miRanda foi utilizado para prever o alvo miRNA. A sequência dos microARNs previstos locais de ligação foram apresentados na Tabela 2. Verificou-se que o miR-7, o miR-20a, e miR-214 pode ligar-se à região 3 ‘não traduzida (UTR) de

COCEIRA e

cir-coceira

. Portanto, nós inserido o

ITCH

sequência de ligação em psiCHECK-2 e repórteres de luciferase construídos para estes 3 miRNAs por transitoriamente co-transfecção las em células HCT116. A construção tinha reduzido de forma significativa a actividade da luciferase para miR-7, o miR-20a, e miR-214 numa forma dependente da concentração nas células de controlo HCT116 (1 pmol miARN-7: 1,02 ± 0,028 contra 1,236 ± 0,068,

P

= 0,05; 40 pmol miRNA-7: 0,808 ± 0,052 contra 1,236 ± 0,068,

P

= 0,02; 1 pmol miRNA-20a: 2,09 ± 0,123 contra 2,498 ± 0,068,

P

= 0,02; 40 pmol miRNA-20a: 1.887 ± 2.498 0.11versus ± 0,068,

P

= 0,006; 1 pmol miRNA-214: 1,511 ± 0,059 contra 1,88 ± 0,043,

P

= 0,03; 40 pmol miRNA-214: 1,38 ± 0,058 em comparação com 1,88 ± 0,043,

P

= 0,006). Resultados semelhantes foram encontrados quando repetiu as mesmas experiências no controle SW480 células.

Foi realizado o mesmo experimento em

cir-coceira

células hiper-expressão. Os resultados mostraram que não houve diferenças significativas na atividade luciferase quando o psiCHECK-2-

ITCH

site de liga�o ao com miR-7 e miR-20a foi transfectado em células HCT116 e SW480, mas que havia uma diferença significativa para miR-214 (1 pmol miRNA-7: 1.147 ± 0.041 contra 1.236 ± 0.042,

P

= 0,069; 40 pmol miRNA-7: 1,138 ± 0,015 contra 1,236 ± 0,042,

P

= 0,12; 1 pmol miRNA-20a: 2,424 ± 0,017 contra 2,526 ± 0,058,

P

= 0,11; 40 pmol miRNA-20a: 2,345 ± 0,04 contra 2,526 ± 0,058,

P

= 0,069 ; 1 pmol miRNA-214: 1,539 ± 0,038 contra 1,877 ± 0,039,

P

= 0,001; 40 pmol miRNA-214: 1,407 ± 0,051 contra 1,877 ± 0,039,

P

= 0,004) ( Fig 2A).

(a) a actividade de luciferase relativa do psiCHECK-2-coceira constrói co-transfectadas com o miR-20a, miR-7, o miR-214 e inibidor em células HCT116 e SW480. Em

cir-coceira

células hiper-expressão, não houve diferenças significativas na atividade luciferase quando psiCHECK-2-

ITCH

site de liga�o ao com miRNAs foram co-transfectados em células HCT116 e SW480. Seis réplicas para cada grupo, e a experiência repetida pelo menos três vezes. Os dados são média ± SEM. células HCT116 e SW480 (B) depois transfectadas com

células cir-coceira Comprar e controle foram, respectivamente transfectadas com miR-20a, miR-7 e inibidor por 24 horas e foram, então, expostos a actinomicina D para 1, 2 e 3 h. As células foram colhidas e a estabilidade da

cir-coceira

mRNA foi analisada por qRT-PCR em relação ao tempo 0, depois bloquear a síntese de ARN novo com actinomicina D; Os dados são média ± SEM, normalizada para

GAPDH

.

células HCT116 e SW480 transfectadas com o plasmídeo construído foram tratadas com actinomicina D, na presença de 1 ou 40 pmol de miR-7 e miR-20a, e o ARN total foi colhido nos pontos de tempo indicados. Os resultados mostram que nas células de controle, o

cir-coceira

níveis manteve-se em 20-30%; no entanto, houve pouca mudança no

cir-coceira

níveis nas células HCT116 após incubação com actinomicina D. Nós repetimos estes experimentos em células SW480 com os mesmos resultados (Fig 2B).

Associação de

cir-coceira Comprar e

ITCH

no CRC

recentemente,

cir-coceira

foi relatado para regular a expressão do gene através de seu papel como um miRNA esponja, protegendo assim os genes-alvo dos miRNAs. Por isso, testamos a correlação entre a

cir-coceira Comprar e

ITCH

em um adicional de 15 pares de CRC adjuvantes tecidos não cancerosos. Os resultados mostraram que os pacientes com maior

cir-coceira

níveis de expressão nos tecidos CRC teve um aumento da regulação substancial de linear

ITCH

(R

2 = 0,32,

P Art 0,01; a Fig. 3A)

(a) as correlações lineares entre os

cir-coceira

níveis de expressão e linear

ITCH

foram testados. O valor da expressão relativa foi normalizada pela

GAPDH

nível de expressão. foi realizada (B) Ensaio de repórter de luciferase Um TCF. A actividade de luciferase foi normalizada para a actividade da luciferase de Renilla. (C) Os níveis de proteína de Wnt3a e β-catenina foi avaliada em células de CRC HCT116 (células e células SW480) por transferência de Western. (D) O nível de mRNA de

c-myc

e

cyclinD1

foi detectado por RT-PCR quantitativo após transfectadas com

cir-coceira

ou controlar células em células CRC. (A parte superior é

c-myc

e o inferior é

cyclinD1

) Os dados são a média ± SEM e representativos de três experiências independentes. células HCT116 e SW480 (E) foram semeadas em placas de 96 poços após a transf sido, e a proliferação celular foi realizada por dia durante 3 dias, utilizando o ensaio CCK-8. Seis réplicas para cada grupo, e a experiência repetida três vezes. Os dados são média ± SEM. *

P

. 0,05 em comparação com controles

cir-coceira

está envolvido na regulação da via de sinalização Wnt /β-catenina in vivo

proteína ITCH ubiquitinates a forma fosforilada de Dvl2 e promove a sua degradação, inibindo assim a sinalização Wnt canônica [19]. Para verificar ainda se

cir-coceira

regula a via de sinalização /β-catenina Wnt em células CRC, foi utilizado um ensaio de repórter luciferase β-catenina /TCF-responsivo. Os resultados mostraram que a superexpressão do prurido inibiu a actividade de flash para cima de uma maneira dependente da dose (Fig 3B). A níveis Wnt3a β-catenina e foram analysised utilizando Western blot em células com

COCEIRA

hiperexpressão, e como mostrado na Fig 3C, houve uma diminuição óbvia nos níveis de β-catenina, enquanto não houve alteração na expressão Wnt3a. Em seguida, testamos a expressão de

c-myc

e

cyclinD1

, dois genes alvo da via de sinalização Wnt /β-catenina em células transfectadas, com

cir-coceira

. Sua expressão também foi suprimida (Fig 3D).

cir-coceira

modula o crescimento de células

Realizamos CCK-8 ensaios para testar os efeitos do

cir- COCEIRA

sobre a proliferação celular em células de CRC. Observou-se uma diminuição consistente na proliferação de células de HCT116 (28% -39% de redução) e as células SW480 (15% -33% de redução) quando

cir-coceira

foi sobre-expresso em níveis fisiológicos através da CCK-8 ensaios comparada com a do controlo (Fig 3E).

Discussão

neste estudo, identificamos

cir-coceira

no CRC e descobriu que ele foi dramaticamente jusante regulada nos tecidos CRC usando um ensaio de transcriptase reversa reação em cadeia da polimerase com base em TaqMan, indicando a função potencial dos

cir-coceira

no CRC. Uma série de experimentos ilustrado a correlação entre o

cir-coceira Comprar e miRNAs, demonstrando que

cir-coceira

desempenha um papel importante como uma esponja miRNA no processo de desenvolvimento CRC.

Milhares de lincRNAs foram identificados em seres humanos e ratinhos, e muitos estão intimamente relacionadas com o desenvolvimento de vários tipos de cancro, tal como carcinoma do esófago de células escamosas (CICAc) e carcinoma do endométrio [20, 21]. ARN circular é um tipo de lincRNA que desempenha um papel no desenvolvimento do tumor. Para nosso conhecimento,

ITCH

é uma das ligases de proteína ubiquitina E3, que visa especificamente p73 [22], Dvl2 [19], e Notch1 [23], os quais são normalmente associados com a formação de tumores e quimio-sensibilidade.

Embora as funções de miARNs estão longe de estarem totalmente compreendidas, prevê-se que aproximadamente 30% dos genes codificantes de proteínas são controlados por miARNs [24], e alguns estudos têm sugerido que a miARN pode ligar-se a três ‘-UTR de

ITCH

para diminuir a sua expressão [25]. Memczak et ai. (2013) e Hansen et ai. (2011) propuseram que a proteína 1 (CDR1) lócus relacionada degeneração cerebelar-abriga 70 partidas conservadas para a semente de miR-7. Esta característica marcante sugeriu que o RNA circular tem uma possível função como uma esponja de miARN [5, 8, 26]. Pesquisas anteriores mostraram que

cir-coceira

age como uma esponja para miR-7, miR-17 e miR-214, ao passo que no presente estudo, verificou-se que nas linhas celulares de CRC, miR-7 e miR-20a infra-regular

ITCH

expressão através da ligação à sua 3′-UTR. Além disso, esses miRNAs são sempre nutria pelo

cir-coceira

. Em nosso estudo,

cir-coceira

não agir como uma esponja para miR-214. Para nosso conhecimento, expressão ectópica de miR-214 suprime a proliferação, migração e invasão in vitro, enquanto que miR-214 knockdown promove a proliferação, migração e invasão em linhas celulares de CRC [27].

miRNAs têm sido associado ao câncer. Cima miR-7 expressão tenha sido descrito em uma variedade de tipos de tumor, incluindo CRC, e tem sido implicado na oncogenese, classificação e progressão do cancro [28]. miR-20a contribui para o aumento da proliferação e invasão de células de CRC [29]. Com base nesta informação, os nossos dados verifica o trabalho de nossos predecessores. A partir dos dados acima, foi demonstrado que

cir-coceira

participa no desenvolvimento da CRC através da regulação da atividade miRNA.

regulação aberrante da via de sinalização Wnt emergiu como um tema predominante em biologia do câncer, e é crucial para o aparecimento e progressão da CRC humano. Cerca de 90% dos cancros do cólon esporádicos mostram a sinalização de Wnt aberrante [30].

cir-coceira

actua como uma esponja de miARN e aumenta o nível de

comichão, a qual está envolvida na via /β-catenina Wnt. De acordo com a investigação anterior, comichão pode promover a ubiquitinação e degradação de Dvl2 fosforilada e, por conseguinte, inibir a sinalização de Wnt canónica [19]. Um ensaio de repórter de luciferase β-catenina /TCF-responsivo foi usada para examinar se um único gene regula a via de sinalização /β-catenina Wnt. O nosso estudo e outros resultados anteriores relataram que a sobre-expressão de

cir-coceira

suprimiu significativamente a atividade transcricional TCF relativa.

Os oncogenes

c-myc

e

cyclinD1

são proteínas efectoras do sinal karyomitosis, que podem desencadear e regulam a transcrição de genes relacionados com a proliferação. Eles são frequentemente sobre-expressa em vários tumores humanos, incluindo CRC [31]. Nossos resultados mostraram que em células transfectadas com

cir-coceira

, a expressão de

c-myc

e

cyclinD1

foi marcadamente diminuída. Portanto, sugerimos que

cir-coceira

tem um efeito inibitório sobre a via Wnt canônico.

cir-coceira

desempenha um papel anti-tumor, controlando a atividade miRNA, e tem um papel inibitório na via Wnt canônica, inibindo

c-myc

e

cyclinD1

expressão.

Em resumo, o nosso presente estudo indica que a esponja miRNA

cir-coceira

representa uma nova geração de tecnologia para a inibição miRNA.

cir-coceira

está envolvida na via /β-catenina Wnt, e por inibir esta via, que desempenha um papel na CRC.

Reconhecimentos

Este trabalho foi apoiado pela concessão de Wenzhou Ciência e Tecnologia Bureau Natural Science Foundation (Y20140700).