Abstract

Fundo

5α-reductase 1 (5αR1) e 5α-redutase 2 (5αR2) converter a testosterona em di-hidrotestosterona o androgénio mais potente. 5αR2 é a principal isoenzima no tecido da próstata normal; no entanto, a maioria dos tumores de próstata aumentaram 5αR1 e diminuição da expressão 5αR2. 3 semanas de implantação do tumor Anteriormente, tratamento com finasteride (5αR2 inibidor) começado não teve efeito sobre o crescimento do tumor da próstata de rato Dunning R3327-H. Nós acreditamos que o tumor compensado para o tratamento finasterida, aumentando tumor expressão ou atividade 5αR1. Nossa hipótese é que o tratamento finasterida não alteraria significativamente o crescimento do tumor, mesmo se iniciado antes da implantação do tumor, enquanto que a dutasterida (inibidor 5αR1 e 5αR2) de tratamento iria diminuir o crescimento do tumor independentemente de se o tratamento foi iniciado antes ou depois da implantação do tumor.

Metodologia /As principais conclusões

ratinhos nus masculinos Sessenta 8 semanas de idade foram randomizados para controle, Pré e Pós-Finasteride e Pré e Pós-Dutasteride (83,3 mg da droga /kg de ração) grupos de dieta. Pré e pós-grupos começaram suas dietas de tratamento de 1-2 semanas antes ou 3 semanas após a injecção subcutânea de 1 × 10

5 WPE1-NA22 células cancerosas da próstata humana, respectivamente. Os tumores foram deixados crescer durante 22 semanas; áreas tumorais, peso corporal e ingestão de alimentos foram medidos semanalmente. Com pesos conclusão, próstata e vesícula seminal do estudo foram significativamente diminuído em todos os grupos de tratamento em comparação com o controlo; ingestão dutasterida diminuiu significativamente os pesos das vesículas seminais em comparação com a ingestão de finasterida. Nenhuma diferença foi medido na final áreas tumorais ou pesos de tumor entre grupos, provavelmente devido ao crescimento do tumor pobres. Em estudos de acompanhamento, a proliferação de WPE1-NA22 células cancerosas da próstata e RWPE-1 células epiteliais da próstata linha pai não foram alteradas pelo tratamento com testosterona, a dihidrotestosterona, ou Mibolerone, sugerindo que estas linhas celulares não são andrógeno-sensível.

Conclusão

a falta de resposta das células cancerosas da próstata WPE1-NA22 de andrógeno tratamento pode explicar o crescimento do tumor inadequada observou. Estudos adicionais são necessários para determinar se a finasterida e dutasteride são eficazes na redução do câncer de próstata desenvolvimento /crescimento

Citation:. Opoku-Acheampong AB, Nelsen MK, Unis D, Lindshield BL (2012) O Efeito da finasterida e dutasterida no crescimento de WPE1 NA22-cancro da próstata os xenoenxertos em ratinhos nus. PLoS ONE 7 (1): e29068. doi: 10.1371 /journal.pone.0029068

editor: Ming Tat Ling, Universidade de Tecnologia de Queensland, Austrália |

Recebido: 22 de Agosto de 2011; Aceito: 20 de novembro de 2011; Publicação: 05 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Opoku-Acheampong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O projeto descrito foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH) RR017686 Número Grant P20, o Programa Prêmio de Desenvolvimento Institucional do Centro Nacional de Recursos de Pesquisa e pelo Centro Johnson para Pesquisa do Câncer básica da Universidade Estadual do Kansas (http: //cancer.ksu .edu /). O seu conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Centro de Pesquisa Biomédica de Excelência para a função epitelial na saúde e na doença ou NIH. Esta é a contribuição não. 12-033-J da Estação Experimental Agrícola Kansas. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o tumor maligno mais comumente diagnosticado em homens, estimada em cerca de 30% dos casos de câncer em 2011 [1]. o crescimento do tumor da próstata é normalmente estimulada por androgénios. A testosterona, o principal androgénio circulante, é convertido pelas isoenzimas 5α-reductase 1 e 5α-reductase 2 no dihidrotestosterona mais potente, que se liga com até dez vezes mais elevada afinidade para o receptor de androgénio do que a testosterona [2], [3] . 5α-reductase 1 é a principal isoenzima no fígado humano e pele não-genital, enquanto 5α-reductase 2 é a principal isoenzima na próstata, epidídimo, vesícula seminal e pele genital [4].

A inibição da produção de andrógenos e /ou bloquear sua ação são abordagens comuns para a luta contra o câncer de próstata [5]. A maioria dos estudos relata um aumento 5α-reductase 1 e diminuiu 5α-redutase expressão dois ARNm ou actividade no cancro da próstata [6] – [9]. Outros relataram um aumento 5α-redutase uma expressão de mRNA e não há mudanças significativas no 5α-redutase expressão 2 mRNA no cancro da próstata contra tecidos normais [10], aumentou a expressão de ambas as isoenzimas no cancro da próstata [5], ou perda de expressão de ambas as isoenzimas em cancro da próstata metastático [11]. Dois inibidores 5α-redutase, finasterida (5α-redutase 2 inibidor) e dutasterida (5α-reductase 1 e 2 de inibidor), são comumente utilizados para tratar a hiperplasia benigna da próstata (HBP) [12]. Estes inibidores 5α-reductase também pode ser utilizado para prevenir ou tratar o cancro da próstata, reduzindo os níveis de di-hidrotestosterona [13].

Em apoio a esta possibilidade, finasterida diminuição da prevalência do cancro da próstata em 24,8% no Prostate Cancer Prevention Trial ( TPCP) [14]. Do mesmo modo, na redução de Dutasteride de Eventos da próstata (REDUZIR) julgamento, dutasterida reduziu a incidência de câncer de próstata em 23% [15]; no entanto, com base nos resultados destes ensaios, a Food and Drug Administration (FDA) reviu recentemente as informações de segurança para ambas as drogas afirmar que as drogas aumentam o risco dos pacientes para o desenvolvimento de câncer de próstata de alto grau [16]. Em modelos animais, dutasterida, mas não finasterida, inibiu o crescimento de Dunning R-3327H tumores de próstata de rato [17]. Em ratinhos nus portadores de xenoenxertos de LNCaP de cancro da próstata humano, tanto a finasterida e dutasterida reduziu o crescimento do tumor, embora dutasterida foi mais eficaz a uma dose equimolar [17]. Em ratos, a finasterida diminuiu significativamente os pesos dos tecidos andrógeno-sensíveis, mas não diminuiu o crescimento do tumor Dunning R-3327H [18]

Nestes estudos com animais, finasteride e dutasteride administração começou depois que os tumores foram estabelecidos.; finasterida administração iniciada antes do implante do tumor pode ser mais eficaz. Por outro lado, independentemente de quando o tratamento é iniciado finasterida, células de cancro da próstata pode compensar 5α-redutase 2 inibição, aumentando 5α-redutase uma expressão e /ou actividade; Assim, o efeito inibidor dual da dutasterida pode oferecer uma vantagem sobre a finasterida. Foi examinado o efeito de finasterida e dutasterida dietas começado 1 semana antes ou 3 semanas após a injecção subcutânea de células de cancro da próstata humano WPE1 NA22-nos flancos traseiros de ratinhos nus do sexo masculino. Utilizou-se WPE1-NA22 xenoenxertos de cancro da próstata, porque estas células cancerosas humanas podem ser cultivadas in

in vitro

, ainda formam tumores não invasivos com taxas de crescimento e patologias semelhantes ao tumor Dunning R-3327H [19], [20].

Materiais e Métodos

O Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal (IACUC) da Universidade Estadual do Kansas aprovou todos os procedimentos com animais (protocolo 2794).

Linhas Celulares

de cancro da próstata WPE1-NA22 e RWPE-1 células epiteliais da próstata (ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas em meio de queratinócito isento de soro contendo extracto de pituitária bovina e o factor de crescimento epidérmico (GIBCO Invitrogen, Carlsband, CA). Para o estudo em animais, células NA22-WPE1 foram cultivadas em 75 cm

2 frascos (Fisher Scientific, Pittsburg, PA), removidas com tripsina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), e foram centrifugadas durante 7 minutos a 130 x g a 37 ° C. O sobrenadante foi removido e as células foram reconstituídos em Matrigel ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) a uma concentração de 5000 células /mL. Vinte microlitros de Matrigel ™ ~ 1 × contendo 10

5 células cancerosas WPE1-NA22 foi injectada em cada flanco traseiro de ratinhos nus utilizando um suporte de seringa de Hamilton (Hamilton, Reno, NV), equipado com uma seringa de 1 mL e um calibre 25 8/5 in. agulha (ambos da BD Biosciences).

Animals, Estudo Dietas e Design by

Dois grupos de 30 (total 60) 8 semanas de idade camundongos nu masculino (Charles Rivers, Wilmington, MA) foram alojados individualmente em condições estéreis. Os ratinhos foram monitorizados diariamente, pesados ​​semanalmente, e fornecidas dietas e água

ad libitum

. AIN93-G tratamento dietas (dietas de Pesquisa, New Brunswick, NJ) dutasterida contido (fornecido pela GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, Research Triangle Park, NC) e finasterida (Kemprotec, Middlesbrough, Reino Unido) a 83,3 mg /kg de ração, projetado para fornecer ~ 10 mg de fármaco /kg de peso corporal, que foi a dose dutasterida meio utilizado por Xu e colegas [17]. Após a recepção, os ratos foram aclimatados por 1 semana antes de ser randomizados para controle, pré-finasterida, Pós-finasterida, Pré-Dutasteride, e os grupos de Pós-Dutasteride (n = 10-12, Figura 1). Cinco ratos não completaram o estudo por razões de saúde não relacionados com o crescimento do tumor. Pré e pós-grupos começaram suas dietas de tratamento de 1-2 semanas antes ou 3 semanas após a injeção de células WPE1-NA22, respectivamente. O ponto de tempo de três semanas após a injecção foi escolhido porque Canene-Adams e colegas iniciado tratamento com finasteride, ao mesmo ponto [18]. O estudo foi encerrado 22 semanas de implantação pós-tumor. Os ratinhos foram sujeitos a eutanásia por CO

2 inalação e o sangue foi imediatamente tirado através de punção cardíaca e centrifugado durante 1 minuto a 2000 x g para se obter soro. Os tecidos foram dissecados, flash congelado em nitrogênio líquido e armazenadas em um freezer a -80 ° C.

Pré e pós-grupos começaram suas dietas de tratamento de 1-2 semanas anteriores ou 3 semanas após a célula WPE1-NA22 injecção, respectivamente. O estudo foi encerrado 22 semanas de implantação pós-tumor

área do tumor foi calculado usando a fórmula para a área de uma elipse:. Área = π * (comprimento /2) * (largura /2). A área média do tumor num grupo foi calculada pela soma das áreas tumorais individuais para o grupo, em seguida, dividindo-se pelo número total de locais de tumor no grupo. Zeros foram registrados para locais de tumor sem tumores mensuráveis.

In Vitro

andrógeno Tratamento e Viabilidade Celular

células

WPE1-NA22 (número de passagens ≤7) e as células

RWPE-1 (número de passagem ≤6) foram colocadas em placas a 10.000 células por poço em placas de 96 poços (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Vinte e quatro horas após o plaqueamento, ambas as linhas celulares foram tratadas com testosterona (0,1 nM-30 nM), a di-hidrotestosterona (0,03 nM-100 nM, ambos da Sigma Aldrich, St. Louis, MO), e mibolerona androgénio sintético (0,01 NM- 20 nM, PerkinElmer, Waltham, MA) em 0,1% de etanol. Meios de androgénio e tratamentos foram preparados diariamente e trocado a cada 24 horas durante o período de tratamento de 5 dias. A viabilidade celular foi quantificada utilizando o CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay (Promega Corporation, Madison, WI) com um leitor de placas Bio-Tek uQuant (BioTek, Winooski, VT). Os resultados apresentados são de 4 repetições das experiências

Análise Estatística

Os dados foram analisados ​​usando SAS 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, Carolina do Norte), com p . 0,05 considerado estatisticamente significativo. ANCOVA com a coorte como co-variável foi inicialmente utilizado para analisar os resultados de estudos animais. A covariável foi removido porque não conta para uma quantidade significativa de variância em todas as análises, e ANOVA com teste de Tukey foi utilizado em dados obtidos a partir de duas coortes. logaritmos naturais foram usados ​​para transformar dados quando os dados não cumpria os pressupostos do modelo. Kruskal Wallis não paramétrico ANOVA one-way foi utilizada para a incidência de tumores. Dados de viabilidade celular de tratamento de andrógeno foram analisados ​​utilizando ANOVA com teste de Dunnett

Resultados

peso corporal final do Grupo Pré-Finasteride foram significativamente maiores do que o controle (Tabela 1, p 0,05). apesar não há diferenças na ingestão de alimentos diária ou a eficiência alimentar (dados não mostrados) entre os grupos. a incidência tumoral foi elevada, 86,4% a 95,5%, com nenhuma diferença entre os grupos (Figura 2). Não houve diferença nos pesos de tumor e áreas de tumor entre os grupos (Tabela 1 e Figura 3), provavelmente um resultado do crescimento do tumor pobres. O maior diâmetro médio do tumor em qualquer grupo foi de 4,33 mm. Apesar de não alterar o crescimento do tumor, tanto finasterida e dutasterida próstata diminuiu significativamente e os pesos das vesículas seminais como uma percentagem do peso corporal (P 0,05). Além disso, houve uma diminuição significativa nos pesos das vesículas seminais em grupos dutasterida contra grupos de finasterida (Tabela 1)

Zeros foram registrados para locais de tumor sem tumor.; diferenças não significativas entre os grupos

Zeros foram registrados para locais de tumor sem tumores.; Nenhuma diferença significativa entre os grupos.

Estas reduções em tecidos andrógeno-sensíveis sugerem que a finasterida e dutasteride estavam exercendo sua ação anti-androgênica. Uma explicação para o fraco crescimento é que as células WPE1-NA22 não são andrógeno-sensíveis como os seus pais RWPE-1 próstata humana células epiteliais [21]. Assim, WPE1-NA22 e células RWPE-1 foram tratados com concentrações variadas de testosterona, di-hidrotestosterona, e o androgénio sintético mibolerona. Não houve diferença no número de células em qualquer linha de células quando tratadas com concentrações variadas de andrógenos (Figuras 4 e 5).

Discussão

Neste estudo, nós examinamos os efeitos de dois inibidores da 5α-redutase, finasterida e dutasterida, pré- e pós-injecção do tumor no crescimento de xenoenxertos de WPE1-NA22 em ratinhos nus. incidência de tumores foi alta para todos os grupos que variam de 86,4% a 95,5%, semelhante ao ~92-99% relatados em anteriores Dunning R-3327H estudos de câncer de próstata de ratos [18], [22]. A fraco crescimento de xenoenxertos WPE1-NA22 em ratinhos nus foi uma surpresa tendo em conta que o volume do tumor de xenoenxerto foi anteriormente relatado como sendo de 0,2 cm

3 7 semanas após o implante [20]. Back-cálculo Este é um diâmetro do tumor de ~7.26 mm, que é muito maior do que observamos em qualquer momento durante o nosso estudo

.

Uma diferença metodológica entre os estudos que provavelmente contribuíram para as diferenças no crescimento do tumor é a diferença do número de células cancerosas WPE1-NA22 injetadas nos flancos de ratinhos. Webber e colegas injectados subcutaneamente 5 × 10

5 células NA22-WPE1, cinco vezes mais do que as células injectadas neste estudo [20]. Menos células foram injectados por causa da preocupação de que o crescimento do tumor seria demasiado rápida, dado o tamanho relatado de 7 semanas, em comparação com tumores Dunning R-3327H que não são palpáveis ​​até à implantação do tumor 9-10 semanas [18], [22] . Duas outras explicações possíveis para o fraco crescimento de xenoenxertos WPE1 NA22-se que os ratinhos nus foram gerar uma resposta imune contra as células cancerosas ou as células que não foram sensíveis androgen-, de modo androgénios não estimulou o seu crescimento.

Nos propusemos a investigar a última possibilidade de tratamento de células WPE1-NA22 e sua linha de células-mãe, RWPE-1 próstata humana células epiteliais com uma variedade de concentrações de três andrógenos. Anteriormente, o crescimento de células RWPE-1 aumentou de uma forma dependente da dose quando tratado com mibolerona em doses de 0,01-10 nM [21]. As concentrações de andrógenos usados ​​no nosso

in vitro

estudos foram baseados em vários estudos que examinaram a resposta proliferativa aos três andrógenos [21], [23] – [25]. intraprostática níveis fisiológicos tanto de testosterona (~ 0,2 nM-0,7 nM) [26] e di-hidrotestosterona (5 nM-18 nM) [17], [27], [28] nos seres humanos cair dentro da gama de concentrações utilizadas. Para Mibolerone, foram utilizadas as concentrações de Bello e colegas [21], mas nós também dobrou sua concentração superior para o nosso maior concentração.

Curiosamente, não houve diferença no número de células em qualquer linha de células em resposta a vários concentrações dos respectivos tratamentos de androgénio. Nós tentou repetir a metodologia de Bello e colegas; a única diferença é que usamos o ensaio MTS enquanto eles usaram um ensaio de azul de metileno para quantificar a viabilidade celular [21].

A falta de sensibilidade androgênica de ambas as células podem explicar o crescimento do tumor pobres observado. Além disso apoiar nossas descobertas são que o receptor de androgénio, nuclear 5α-reductase 2, e os níveis de proteína 5α-reductase 1 citosólicas são indetectáveis ​​no RWPE-1 células [29]. As linhas de células derivadas desta linha progenitora susceptível têm níveis semelhantes destas proteínas metabolismo /A acção dos androgénios chave. Além disso, ambas as linhas de células são cultivadas em meio sem soro fetal de bovino e androgénios exógenos, o que significa que é livre de androgénio. Tomados em conjunto, estes resultados devem ser considerados antes de usar ou interpretação dos resultados de RWPE-1 e suas linhas celulares derivadas cancerígenas.

Outro resultado surpreendente foi o significativamente maior peso corporal no grupo pré-Finasteride sem uma alteração nos alimentos ingestão ou a eficiência alimentar. Com base na tendência de crescimento no grupo pré-finasterida, acreditamos que o grupo era mais pesado na randomização, embora as diferenças de peso corporal não foram significativas na época. O grupo de pré-finasterida já foi significativamente mais pesado que o Pré-Dutasteride grupo 1 semana após a randomização, apesar das diferenças insignificantes na ingestão de alimentos (o grupo Pré-Dutasteride consumido numericamente mais durante aquela semana), que apoia a nossa crença. Finasterida foi encontrado para aumentar ligeiramente o ganho de peso em homens com cancro da próstata [30], mas a ingestão a longo termo não aumentou os pesos corporais dos ratos [31]. Dietas em todos os grupos de tratamento foram bem toleradas sem efeitos adversos observados.

A magnitude da redução dos pesos da próstata e das vesículas seminais em resposta à dutasterida e finasterida foram semelhantes aos relatados anteriormente [18], [32], [33]. Encontramos também uma diminuição significativa nos pesos das vesículas seminais em grupos dutasterida contra grupos de finasterida. Para o melhor de nosso conhecimento, nós somos os primeiros a relatar que os resultados dutasterida em maior magnitude de diminuição no peso vesículas seminais do que o finasteride. Ratos no nosso estudo consumidos cerca de 13 mg /kg /dia de finasterida ou dutasterida, que é maior do que a 5 mg /kg /dia de finasterida usada por Canene e colaboradores [18], mas semelhante à dose dutasterida meio utilizado por Xu e colegas [17].

em resumo, embora não vimos um efeito de ambos os inibidores sobre o crescimento de WPE1-NA22 xenotransplante

in vivo

, resulta da próstata e vesículas seminais indicam que o inibidores foram eficazes na inibição da enzima respectiva (s) 5α-redutase. Mais pesquisas em diferentes modelos serão necessários para responder a nossa pergunta de pesquisa; No entanto, nossos resultados questionam a tumorigenicidade de células WPE1-NA22 em camundongos nus e o andrógeno-sensibilidade do WPE1-NA22 e células RWPE-1.