Abstract

Fundo

cancro da bexiga urotelial é o nono câncer mais comum. Apesar do tratamento cirúrgico e quimioterápico o prognóstico ainda é pobre, uma vez cancro da bexiga progride para um estado músculo-invasivo. Descoberta de novos marcadores de diagnóstico e processadores de efeitos fisiopatológicos pode ajudar a contribuir para novas opções de diagnóstico e terapêuticos. O microambiente da matriz extracelular por forma a matriz extracelular afecta criticamente funções de células tumorais e de células do estroma. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a possível implicação dos pequenos biglicam proteoglicanos ricos em leucina na progressão do câncer de bexiga urothelial humano.

Métodos e Resultados

Para este biópsias de tumores finalidade de 76 doentes com cancro da bexiga com diferentes estágios de tumor (PTA, o pT1-T4) foram investigados com relação a biglicam expressão e correlacionada com a longo prazo (10 anos) acompanhamento clínico. Curiosamente, a expressão de ARNm mais elevado biglicano foi associada a tumores de estádio mais elevadas e capacidade de invasão do músculo.

Em

vitro

knock-down de biglicam endógena em células de carcinoma urotelial humanos (células J82) aumento da proliferação, enquanto adição de biglicam recombinante e superexpressão de proliferação de células tumorais inibidas biglicam. Em linha com este efeito inibidor do crescimento de biglicam, o transplante de células J82 após knock-down de biglicam resultou em aumento significativo do crescimento de tumores xenoenxerto subcutâneo em ratinhos nus

em

vivo

. Além disso, o tratamento com dois anti-proliferativos, multi-receptor tirosina-quinase inibidores-sunitinib e sorafenib-fortemente regulada positivamente expressão biglicano. Colectivamente, os dados experimentais sugerem que a expressão elevada biglicano está associada à proliferação de células de tumor reduzida. Em conformidade, a análise de Kaplan-Meier revelou maior sobrevida em 10 anos em pacientes com alta expressão de mRNA biglicam em biópsias de tumores.

Conclusão

Em conclusão, os dados sugerem que biglicam é um inibidor endógeno da proliferação de células de cancro da bexiga que é regulada positivamente em resposta a inibidores de tirosina-quinase anti-proliferativas. Além disso, a alta expressão biglicam está associada com prognóstico favorável

Citation:. Niedworok C, Rocha K, Kretschmer I, Freudenberger T, Nagy N, Szarvas T, et al. (2013) papel inibitório do pequeno Leucina-Rich proteoglicano biglicam no cancro de bexiga. PLoS ONE 8 (11): e80084. doi: 10.1371 /journal.pone.0080084

editor: Nikos K Karamanos, University of Patras, Grécia |

Recebido: 02 de maio de 2013; Aceito: 09 de outubro de 2013; Publicação: 06 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Niedworok et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi financiado em parte pelo Ifores Programa das Clínicas da Universidade de Essen (D107-10800; https://www.uni-due.de/med/forschung/forschungsfoerderung/ifores.shtml) e pela Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG (FI 682 /4-1; https://gepris.dfg.de/gepris/OCTOPUS/;jsessionid=E43949FD6A49E805D72DE1129F1DB078?context=person displayMode=print findButton=Finden id=1433803 keywords_criterion=Jens+Fischer module=gepris nurProjekteMitAB=false task=showDetail). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

urotelial câncer de bexiga é o nono câncer maligno humana mais comum com a crescente incidência e prevalência [1]. invasiva cancro da bexiga não músculo é tratado por ressecção transuretral e terapia adjuvante instilação em caso de doença de alto grau ou em casos com múltiplos tumores, muitas vezes recorrentes. a doença invasiva não-muscular de baixa qualidade pode progredir para o músculo invasivo cancro da bexiga de alto risco. O tratamento de escolha para o câncer músculo da bexiga invasivo é cistectomia radical [2,3] que ainda fornece apenas uma baixa (~ 50%) sobrevida de 5 anos. a principal causa para essa sobrevivência devastador está ocorrendo com frequência progressão metastática nestes pacientes [6,7]. cisplatina em combinação com gemcitabina representa a opção de tratamento adjuvante de primeira linha para pacientes com bexiga localmente avançado ou metastático Câncer. As novas estratégias de quimioterapia, envolvendo inibidores da tirosina cinase do receptor, são actualmente investigada em modelos pré-clínicos e em estudos clínicos [4,5]. Assim, apesar das opções de tratamento cirúrgico e quimioterapêuticos a gravidade da doença e o prognóstico pobre urge para a descoberta de novos marcadores para a progressão da doença, bem como novas perspectivas sobre a fisiopatologia da progressão do cancro da bexiga.

Para este fim, o nosso objectivo de investigar mudanças específicas na micromilieu extracelular, tal como definido pela matriz extracelular (ECM) que estão associados com a progressão do cancro da bexiga e se a actividade biológica específica pode ser atribuída a moléculas candidatas . ECM é conhecido por afectar ambas, células de tumor e de estroma em relação às suas características fenotípicas que são relevantes para a progressão do cancro, tais como invasão, proliferação e apoptose. Além disso, a composição do micromilieu ECM é provavelmente parte da comunicação intercelular entre as células tumorais e do estroma. Proteoglicanos, os principais componentes da ECM, estão se tornando cada vez mais relevante para a biologia do câncer por causa de uma infinidade de funções que são fundamentais para as interacções tumor-estroma [8]. Os proteoglicanos são constituídos por uma proteína do núcleo e uma cadeia de glicosaminoglicano que está sujeita a modificações pós-translacionais. Ambas as proteínas do núcleo e as cadeias de glicosaminoglicanos contribuir para a função dos proteoglicanos no interior da ECM. proteoglicanos ricos em leucina pequenas (SLRP) são uma família de proteoglicanos extracelulares que são caracterizadas por repetições ricas em leucina na proteína do núcleo. Os SLRPs são segregados para o espaço extracelular, onde eles interagem com outras proteínas, incluindo os factores de crescimento, citocinas [9-11] e receptores transmembranares [12]. Biglicano (BGN) é um membro de SLRPs que interage com os receptores transmembranares do tipo purinérgico P2X7 e com o receptor de tipo Toll (TLR) 2 e TLR4 [13,14]. Os primeiros são envolvidos na activação do inflamassoma, enquanto a segunda causa a activação do sistema imune inato. Estas acções atribuem propriedades moduladores imunes para BGN que poderão ser de interesse para ambos, carcinogénese e a progressão do tumor, bem como para a metástase. Além disso, BGN foi mostrado para contribuir para a formação da rede de colagénio e de estabilidade, a fibrilogénese fibronectina, a diferenciação de fibroblastos e é proposto para contribuir para as respostas angiogénicas [15-18]. Em resumo, BGN provável modula a biologia do tumor efectuando mecanismos de controlo importantes, tais como as respostas imunes, a formação da matriz e a modulação da actividade do factor de crescimento. Isto é provavelmente conseguida por tanto, a sinalização celular directa evocada por BGN, bem como pela formação do microambiente através dos seus efeitos sobre a formação de colagénio e fibronectina matriz.

De acordo com o fato de que BGN exibe ambos, inibidor e promover efeitos sobre as células tumorais, os papéis controversos têm sido descritos para BGN em vários cancros. Por exemplo, no cancro gástrico e colorectal, bem como no adenocarcinoma do pâncreas, expressão BGN foi encontrado para ser correlacionado com o mau prognóstico [19-21]. Por outro lado, a sobre-expressão de BGN foi observada no cancro pancreático humano e verificou-se inibir o crescimento de células de cancro do pâncreas e

In vitro

[22]. Além disso, BGN infra-regulação foi associada com HER-2 transformação oncogénica /mediada pelo neu que foi fortemente associada com o fenótipo maligno dessas células [23]. Portanto, o papel de BGN na progressão do tumor provavelmente depende do tipo de tumor, estádio e diferenciação. Por conseguinte, estas questões têm de ser abordadas especificamente nas várias entidades tumorais. Além disso, a capacidade de resposta de BGN para intervenções terapêuticas não foi ainda investigado. Objetivo deste estudo foi avaliar, pela primeira vez a expressão eo papel dos BGN em pacientes com câncer de bexiga.

Materiais e Métodos

amostras tumorais

Análise de expressão gênica foi realizados em amostras de tecidos congelados de 76 pacientes (19x PTA, 15x pT1, 14x pt2, 14x pt3 e 14x pT4), que foram submetidos a tratamento cirúrgico devido a cancro da bexiga urothelial no Hospital Universitário de Essen, entre 1990 e 2004. Todas as amostras de tecido congelado foram cortadas e coradas com H e para verificar o seu conteúdo de tumor. Somente as amostras que contêm ≥ 70% de células tumorais foram submetidos para análise posterior. Além disso, 20 casos de carcinomas da bexiga embebidos em parafina (4x PTA – pT4) foram avaliados através de imuno-histoquímica. Todos os pacientes forneceram um consentimento informado por escrito eo Comitê de Ética do Hospital aprovou o protocolo do estudo. O objectivo primário do estudo foi câncer especi fi c sobrevivência (excluindo todas as outras causas de morte). A causa da morte foi obtida a partir de certi fi cados morte. Os indivíduos foram acompanhados desde a linha de base (data da cirurgia) levantamento até julho de 2009. tecido da bexiga normal foi tirado de pacientes que sofrem de doenças não-malignas (estenose pieloureteral, disfunção da bexiga neurogênica) e serviu como controle para análise da expressão gênica.

imunohistoquímica

a imuno-histoquímica foi realizada com base nos protocolos fornecidos pelo fabricante. Para BGN imunocoloração, as secções foram pré-tratadas com condroitinase ABC para expor os epitopos da proteína de núcleo BGN como descrito anteriormente [24]. Resumidamente, a digestão com chrondroitinase ABC foi realizada por tratamento das lâminas com condroitinase ABC, antes da incubação com o anticorpo primário a 37 ° C durante 1 hora. As secções de tecido foram subsequentemente incubadas durante 16 horas a 4 ° C com anticorpo de coelho anti-IgG-BGN (1: 250 gentilmente fornecida por Larry Fisher, National Institute of Dental Research, National Institutes of Health, Bethesda, EUA). Secções com omissão do anticorpo primário serviram como controlos negativos. A detecção foi realizada utilizando 3,3′-diaminobenzidina (DAB). As imagens foram captadas com uma Leica

® sistema DM2000 e áreas representativas de todas as lâminas coradas foram documentados. Além disso, a percentagem de células positivas Ki67 como um marcador de células em proliferação foi determinada em tumores de xenoenxerto (coelho anti-IgG de Ki67, 01:25, Novus Biologicals, Ltd., Cambridge, Reino Unido). A densidade média de microvasos (MVD) foi determinada como descrito anteriormente [25]. Resumidamente, um mínimo de duas secções de tecido separadas (10 uM) de 6 ratinhos de cada grupo foram coradas utilizando anticorpo policlonal de coelho primários CD31 (1:50, Abcam®, Cambridge, Reino Unido,) e o anticorpo secundário anti-coelho de cabra Alexa Fluor 568 (1 : 200, Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, Oregon, EUA). Imagens de toda a secção foram tiradas com um microscópio Zeiss Observer Z1 com 10x objetiva. Posteriormente, três áreas altamente vascularizadas de 0,49 milímetros

2 foram escolhidos para contar embarcações. Qualquer conjunto endotelial CD31-positiva distinta cela separada de vasos adjacentes foi definida como microvasos. Os valores resultantes foram calculadas para cada rato.

Análise de intensidades de coloração foi realizada utilizando ImageJ 1,46 software (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA) como descrito anteriormente [26].

A transcrição reversa quantitativa PCR em tempo real (RT -qPCR)

O ARN total foi isolado a partir de amostras tumorais congelados rapidamente usando kits RNeasy de ARN total (Qiagen, Hilden, Alemanha). a concentração e a pureza do RNA foram avaliados por medição fotométrica a 260 nm /280 nm. 1 ug de ARN foi utilizado para síntese de ADNc utilizando o Kit de Transcrição Reversa QuantiTect (Qiagen, Hilden, Alemanha). As reacções de PCR foram realizadas utilizando o Platinum® SYBR® verde qPCR SuperMix UDG-(Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) no sistema de PCR 7300 em tempo real (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha). O gene GAPDH foi utilizada para normalizar a expressão do gene alvo. níveis de expressão relativa foram calculados utilizando o

-ΔΔCq o método 2. Foram utilizadas as seguintes sequências iniciadoras:. BGN humana, CTCCTCCAGGTGGTCTATCT frente, GGTTGTTGAAGAGGCTGATG e GAPDH humana, GTGAAGGTCGGAGTCAACG frente reversa, TGAGGTCAATGAAGGGGTC

cultura celular

células J82 foram cultivadas em meio RPMI contendo 10% de fetal de soro de bovino. Inibidores de tirosina-quinase receptora e sorafenib sunitinib foram usadas como uma solução em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração de 10 uM (sorafenib) e 1 uM (sunitinib) e DMSO foi usado como controle. As células foram semeadas a uma densidade de 1×10

5 células por poço em pratos de 6 poços de cultura (Sigma-Aldrich

®, Hamburgo, Alemanha), resultando em 60-70% de confluência das culturas no dia seguinte. Subsequentemente, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS, Gibco

®) e cultivadas em meio isento de soro durante 6 horas. O meio foi então removido e foi adicionado meio contendo 10% de soro e a respectiva inibidor da tirosina-cinase do receptor. 12, 24 e 48 horas após a estimulação, o sobrenadante foi colhido e utilizado para imunotransferência, enquanto que as células foram colhidas para análise de ARNm tal como descrito antes [27]. Purificada BGN (recombinante humana BGN, R D Systems ® GmbH, Wiesbaden, Alemanha) foi adicionado à cultura em 0,01-1? G /ml (0,26-26 nM). a síntese de ADN foi analisada utilizando [

3H] -timidina ensaio como descrito anteriormente [28]. As experiências adicionais para determinar o efeito de BGN sobre a proliferação de células de tumor foram realizadas após a sementeira das células a 10.000 células /3,9 cm

2 PlusMinus BGN recombinante em 2% de soro fetal de vitelo como especificado acima. Após 7 dias o número de células foi determinada utilizando um FACS e Flow-Count (Beckman Coulter, Krefeld, Alemanha) como padrão interno. Três experiências independentes foram executadas, cada uma delas com seis repetições.

imunotransferência

As células foram cultivadas e os sobrenadantes do meio foram colhidas no dia 7 após a transdução lentiviral (ver abaixo). isolamento BGN e a detecção por análise de Western blot foi realizada tal como descrito anteriormente [29], utilizando o anticorpo policlonal BGN coelho LF159 (1: 500, gentilmente fornecida por Larry Fisher, National Institute of Dental Research, National Institutes of Health, Bethesda, EUA) ou anti-BGN (1: 1000, Santa Cruz, Heidelberg, Alemanha). p-tubulina foi detectado utilizando o anticorpo de ratinho anti ab11323-β-tubulina (1: 5000, Abcam®, Cambridge, Reino Unido). A quantificação foi conseguida utilizando anticorpos secundários fluorescentes e o infravermelho Odyssey Sistema de tratamento de imagens (LI-COR Biosciences, Lincoln, EUA). Condroitinase ABC (0,4 U /amostra, Sigma-Aldrich, Hamburgo, Alemanha) foi usada para remover gag-cadeias, como indicado. Meio derivado de células musculares lisas coronárias humanas (Promocell, Heidelberg, Alemanha) foi utilizada como um controlo positivo para imunoblots BGN.

transdução Lentivirus

J82 células foram cultivadas até 60-70% de confluência. Para knock-down BGN em células de cancro da bexiga J82 humanos, short RNA hairpin (shRNA) sequência de direccionamento BGN (forward: 5’CCGGGAACATGAACTGCATCGAGATCTCGATGCAGTTCATGTTCTTTTTTG-3 ‘) no vector pLKO.1 foi usada (Sigma-Aldrich, Hamburgo, Alemanha). Mexidos shRNA foi usado para o grupo de controlo. Lentivirus BGN sobreexpressão foi realizada como descrito anteriormente [16]. Produção do vector, a cultura de células de rim embrionário humano (HEK-293T), colheita das partículas recombinantes e transdução lentiviral de células cancerosas humanas J82 uroteliais foi efectuada tal como descrito antes para a sobre-expressão de lentivírus e knock-down dos genes da matriz [16,26]. a sobre-expressão de proteoglicano BGN foi realizada utilizando o ADNc completo de biglicano como referenciado antes [16]. Para

in vivo

experimentos células J82 foram transduzidas com uma multiplicidade de infecção de 1:10 para o knock-down. As células foram colhidas no dia 7 após a transdução lentiviral e BGN knock-down ou sobre-expressão foi verificada por meio de RT-qPCR antes de ensaios funcionais adicionais.

modelo de xenoenxerto de

Homem NMRI nu /nu ratinhos nus foram utilizados para xeno das células tumorais J82 humanos e análise do crescimento do tumor xenoenxerto. Cada grupo consistia de 6 animais. As células (1×10

6 células tumorais em suspensão em 100 ul de PBS) foram injectadas bilateralmente nos flancos de cada animal. Posteriormente, os animais foram monitorizados durante 7 semanas. A medição do tamanho do tumor foi realizada duas vezes por semana. Os animais foram então sacrificados e o tecido do tumor, do fígado e de pulmão foram colhidas. As secções congeladas foram preparadas a partir de todas as amostras de tumor para as secções de coloração, de pulmão e fígado BGN foram preparados para a H E de coloração de pesquisa para metástase. A Facilidade locais animal, bem como a LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW) aprovou as experiências com animais e os protocolos de tratamento e monitorização.

A análise estatística

dados de expressão gênica foram analisados ​​por análise de variância e teste de Bonferroni post hoc ou pelo

t

Student conforme apropriado. Os dados são apresentados como média ± S.E.M. A significância estatística foi atribuído ao nível do

p Art 0,05. Dados relativos aos resultados clínicos de parâmetros do paciente foram falta de distribuição normal, indicando o uso de não-paramétrico, teste bicaudal de Wilcoxon rank sum (Mann-Whitney) para comparações entre os grupos emparelhados. Análise de dados de sobrevivência dos pacientes foram realizadas usando o algoritmo de padrão de Kaplan-Meier (Proc LIFETEST, SAS-PC 9.3, SAS-Institute, Cary, EUA). Para a separação óptima dos grupos no que diz respeito à expressão BGN relativa, pontos de corte variáveis ​​foram avaliadas e os valores de p teste log-rank foram registrados. separação óptima dos dois grupos correspondentes a um valor de p mínima foi encontrada em um valor BGN expressão relativa de 0,09. Para a análise multivariada foram utilizados Cox modelos de regressão de riscos proporcionais. Todas as análises estatísticas foram calculados usando o software de análise estatística SPSS® IBM (versão 18.0, Chicago, IL, EUA).

Ética declaração

O protocolo do estudo e do processo de aprovação foi aprovado pelo Comitê da Universidade de Duisburg-Essen, Alemanha Ética e cada paciente fornecido um consentimento informado por escrito. O número do projeto foi 07-3537 para armazenar material de tumor congelado e parafinado fresco e os dados clínicos relevantes.

Os experimentos ratos foram realizados de acordo com as regras e normas do LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW) e do Biotério local do Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. O LANUV aprovou os experimentos e confirmou o cumprimento das normas de qualidade. O projeto é identificado pelo número 87-51.04.2010.A149.

Resultados

expressão de mRNA BGN no cancro da bexiga humana

Em primeiro lugar, as amostras de 76 pacientes com diferentes estágios de câncer de bexiga foram analisados ​​em relação à expressão de mRNA BGN e comparados com a expressão em tecido de bexiga saudável. Curiosamente, foram detectadas diferenças significativas nos níveis de expressão de mRNA em relação à capacidade de invasão tumoral (Figura 1A), classificação (Figura 1B) e estadiamento (Figura 1C), sugerindo aumento mRNA BGN em estágios progrediu de câncer de bexiga. No entanto, apesar desta associação positiva com tumor encenação análise multivariada revelou que o nível de expressão de mRNA BGN (

p

= 0,155) não foi um fator prognóstico independente. Em contraste, o estágio do tumor (

p

= 0,012) e comprometimento de linfonodos (

p

= 0,039) foram fatores prognósticos independentes para a sobrevida específica para o câncer como esperado (Tabela 1). Além disso, não houve correlação entre a expressão eo tempo mRNA BGN à aparência de metástase (

p

= 0,862), a progressão da doença (

p

= 0,624) ou recorrência da doença (

p

= 0,142). BGN foi maior em amostras de tumor de fêmeas em comparação com os dos machos (4,86 vezes contra 1,66 vezes de controlo, respectivamente,

P

= 0,003) e em fumadores em comparação com aqueles dos não fumadores (3,40 vezes ; fumantes 2,01 vezes, respectivamente,

P

= 0,008, Tabela 2)

BGN ARNm foi investigada em 76 doentes com cancro da bexiga por meio de RT-qPCR e comparação com o tecido não maligno da bexiga. . Um aumento significativo da expressão de ARNm BGN foi detectado no músculo-invasivo em comparação com tumores não invasivos (A) e em alto grau em comparação com tumores de baixo grau (B). Além disso, a expressão de ARNm BGN correlacionado com o aumento da fase de tumor (C). n = 76 pacientes, *

p

. 0,05, ***

p = 0,0003

sobrevivência específicos de cancro

Variáveis ​​

HR

95% CI

p

Stage (músculo invasivo) 1.4881.090-2.0300.012Grade (alta qualidade) 2.1260.954-4.7400.065Lymphnodes (N +) 2.4001.045-5.5090.039BGN (alta ) 0.9460.876-1.0210.155Table 1. estágio do tumor e estado dos linfonodos são parâmetros prognósticos independentes para a sobrevida específica para o câncer de bexiga.

em uma análise de regressão de sobrevivência de risco multivariada Cox proporcional n = 76 pacientes em estágio do tumor e estado dos linfonodos foram capazes de prever a sobrevida específica para o câncer independente de outros parâmetros,

p

-Valores 0,05 foram determinados como significativo. CSV Baixar CSV

BGN expressão do gene

P

valuesΣ = 76median Idade (intervalo) ≤ 65 352,81 (0.06-24.33) 0,847 65 n1.95 (0,06-8,28) Sexo Masculino 591,66 (0,06-8,28) 0,003 Female 174,86 (0,16-24,33) Stage Ta 191.00 (0,13-4,01) 0,986 T1 151,06 (0,12-4,26) 0,512 T2 141.30 (0,06-5,53) 0.069 T3 143,78 (0,23-12,62) 0,909 T4 145,21 (0,24-24,33) Non-invasive 341,03 (0,12-4,26) 0,004 músculo-invasivo 423,37 (0,06-24,33) Votação G1 130,76 (0,12-4,01) 0,919 G2 271,08 (0,13-4,26) 0,002 G3 363,80 (0,06-24,33) de baixo grau (G 1-2) 380,97 (0.12-4.26) 0,001 Alto grau (G 3) 373,76 (0,06-24,33) Linfonodo N0 /Nx622.05 (0,06-24,33) 0,196 N 143,66 (0,23-15,3) Primer 433,01 (0,12-24,33) 0.883Recurrent 331,44 (0,06-8,08) fumar SIM 422,01 (0,06-24,33) 0,008 nenhum 233,40 (0.13-15.28) níveis de expressão 18Table 2. BGN mRNA desconhecidos são elevados em O tumor de músculo invasivos, tumores de alto grau, não-fumantes e pacientes gênero feminino. níveis de n = 76 pacientes com câncer de bexiga

mRNA expressão do gene. Os dados foram obtidos a partir de amostras de tumores de flash-congelado. A análise de regressão de sobrevivência de riscos proporcionais de Cox univariada foi utilizado para análise de dados, um

p

-valor 0,05 foi considerado como significativo. CSV Baixar

expressão da proteína BGN CSV em carcinomas da bexiga humanos

coloração BGN em amostras de tumores humanos reveladas apenas sinais fracos no tecido estromal de não-invasivo Ta e T1 (Figura 2A). BGN intensidade de coloração aumentada em tumores de estádio músculo-invasiva (Figura 2B e C). Como esperado, a morfologia do tumor em estágios superficiais foi semelhante à morfologia normal da bexiga com uma clara diferenciação entre o tecido tumoral e o tecido estromal. Em estágios mais elevados de tumor (T4), células do estroma e as células tumorais foram misturados entre si e ambos os tipos de células mostrou associação com BGN coloração (Figura 2B e C). No entanto, porque BGN é um proteoglicano segregada a fonte celular não pode ser deduzida a partir de imunocoloração de tecidos. A quantificação da fração de área positiva confirmou o aumento da intensidade de coloração de BGN em tumores de estádio músculo-invasiva (T2-4) em comparação com não-muscular Ta invasivo e estágios T1 (Figura 2D). Além disso, foi detectada uma correlação da fracção de área positiva BGN e invasividade do tumor (

P

= 0,0025, Figura 2E).

A – C, BGN imunocoloração foi realizada em secções de tecido embebidos em parafina. (A), Ta; (B), T2; (C), T4. (D), análise de imagem quantitativa do BGN em tumores não invasivos (Ta, T1) e as fases tumorais de músculo-invasiva (T2-T4). (E), a correlação de BGN fração de área positiva com o estadiamento do tumor. n = 5 biópsias de pacientes de cada estágio do tumor, ***

p Art 0,0001, **

p

= 0,0025

efeito antiproliferativa dos BGN no. células de câncer de bexiga humanos

in vitro

Os resultados de amostras de cancro da bexiga humanos sugerem que a expressão BGN associada com a progressão do tumor. Para obter insights mecanicistas, foram investigados os efeitos potenciais de BGN no fenótipo celular tumor

in vitro

como detalhado abaixo. Em primeiro lugar, uma imunotransferência de BGN secretada foi realizada a partir de meio condicionado da linha celular de cancro da bexiga humano, J82 (Figura 3A). Como detectada na amostra de células J82 sem condroitinase ABC digestão BGN proteoglicanos foi lançado em quantidades relativamente pequenas para o meio. Além disso, a proteína do núcleo BGN foi detectado nestas amostras bem. Como um controlo para as células que segregam grandes quantidades de BGN proteoglicano, a imunotransferência de meio condicionado derivado de células musculares lisas vasculares coronárias humanas foi incluído (duas pistas do lado esquerdo). A imunotransferência revelou ainda que BGN recombinante utilizada nas experiências subsequentes consistia principalmente de proteína do núcleo, porque as bandas não foram deslocados por condroitinase ABC (Figura 3A) e rodar com o tamanho típico para a proteína do núcleo. Em seguida, a proteína biglicano núcleo recombinante foi utilizado num ensaio de proliferação (Figura 3B). A adição de 0,26-26 nM BGN núcleo (0,01-1 ug /ml) causaram uma inibição dependente da dose da proliferação de células em células J82 (Figura 3B). Finalmente, para definir a base para um

in vivo

experimento xenotransplante e para desvendar o papel de BGN endógena, lentiviral knock-down de BGN foi realizada na linha celular de cancro da bexiga humana, J82. Importante, knock-down de BGN causou aumento da proliferação (shBGN 1,39 ± 0,06 vezes de controlo,

P

0,05), que foi revertida por adição (2,6 nM) de BGN exógena (0,83 vezes de ± controle 0,06) (Figura 3C). A adição de BGN exógeno para as células transduzidas com shRNA mexidos causou uma tendência para proliferação diminuída. Em seguida, a proliferação foi determinada após a sobre-expressão de BGN humano. Cortesia para o efeito pró-proliferativa após BGN knock-down, BGN superexpressão resultou numa redução significativa da síntese de ADN, em comparação com o controlo de vector vazio (oeBGN, 0,50 ± 0,06 vezes de controlo; PCL-1, 1,0 ± 0,09 vezes de controle, Figura 3C).

(A) Immunoblotting de BGN purificada a partir de meio condicionado de células de carcinoma da bexiga J82 humanos e de BGN PlusMinus condroitinase ABC recombinante digestão. Como controlo de meio condicionado a partir de células humanas coronárias vasculares de músculo liso (CaSMC) foi usado porque estas células são conhecidos para segregar grandes quantidades de BGN proteoglicano (duas pistas esquerda). Condroitinase ABC foi aplicado como um controlo adicional (pista da direita) (B) As células J82 foram incubadas em baixo teor de soro (2%) com quantidades crescentes de número BGN e célula recombinante foi determinada por análise FACS depois de 7 dias; n = 3. imagens microscópicas de luz representativas são mostrados. células (C) J82 humano ou foram lentivirally transduzidas para knock-down expressão BGN ou para superexpressão BGN humano. Os respectivos controles eram células transduzidas com shRNA mexidos (SCR) ou controlo de vector vazio (PCL-1). Além disso, foi usada BGN recombinante. Nove dias após a transdução, foi determinada a proliferação conforme evidenciado pela síntese de DNA. O BGN knock-down teve um efeito proliferativo que foi revertida por adição de BGN recombinante (2,6 nM = 100 ng /ml). A sobre-expressão de BGN resultou na síntese de DNA reduzida; n = 5, *

p Art 0,05.

Knock-down de BGN acelera o crescimento J82 xenotransplante em ratinhos nus

células J82 transduzidas com shRNA alvo BGN e mexidos shRNA foram xenoenxerto em ratinhos nu /nu nua para investigar o efeito de BGN infra-regulação também

in vivo

. Medição do volume de tumor de xenoenxerto revelou uma elevação significativa do crescimento do tumor no grupo de knock-down BGN em comparação com o grupo de controlo tratado com mexidos shRNA 49 dias após a injecção das células (dia 49, shBGN 374.7mm

2 ± 82,8 milímetros

2, mexidos shRNA 204,2 mm

2 ± 28,5 mm

2, n = 6,

p Art 0,001, Figura 4). Os tumores eram de aparência firme, sem sinais de necrose e apenas um dos tumores no grupo de shBGN foi infiltrar o tecido circundante (neste caso as nervuras inferiores). Nenhum dos tumores no grupo de controlo foi infiltração do tecido circundante. Não houve crescimento visível metastático de células tumorais no pulmão e fígado, tal como avaliado por histologia. A análise imuno-histoquímica Em seguida mostrou que BGN coloração ainda foi reduzida no grupo knock-down BGN (BGN fracção área positiva no grupo shBGN 10,82 ± 2,3% e 25,25 ± 2,4% no grupo de controlo shRNA mexidos) após 7 semanas (Figura 5 A-C). É importante, de acordo com o

In vitro

dados mostrados na Figura 3, a proliferação de células tumorais foi aumentada após BGN knock-down como evidenciado por coloração de Ki67 em comparação com o controlo (Ki67 fracção área positiva no grupo shBGN 16,68 ± 2,1 % e 7,18 ± 1,2% no grupo de controle shRNA mexidos,

p

= 0,005, Figura 5D-F). vascularização do tumor não foi afetada como evidenciado por coloração CD31 (Figura 5G-I).

Depois de knock-down de BGN em células J82 humanos

em

vitro

as células transduzidas Injectaram-se bilateralmente nos flancos dos ratos e o crescimento do tumor foi monitorizado nua ao longo de um período de 7 semanas. Como resultado, o volume do tumor foi significativamente maior após a aplicação de células J82 transduzidas com shRNA segmentação BGN em comparação com o controlo scrambled (375 mm

2 vs. 204 mm

2); n = 6, ***

p Art 0,001.

Os tumores de xenoenxerto foram colhidas após 7 semanas e processado para imunocoloração e análise morfológica. BGN imunocoloração e análise de imagem revelou diminuição da expressão BGN comparação com o controlo scrambled (A, B). A fracção de coloração positiva BGN área foi de 25,3% nos controlos contra 10,8% em tumores de xenoenxerto de células derivadas de shBGN, n = 6, **

p = 0,0087

(C). Em seguida, o índice de proliferação foi avaliada utilizando o antigénio Ki67. Em comparação com o controlo (D) a percentagem da fracção de células positivas a área Ki67 foi significativamente elevados em tumores compostos por células shBGN J82 (E, F transduzidas; 7,2% vs. 16,7%, n = 6, **

p

= 0,005). (GI) A densidade média de microvasos (MVD), como determinado por imunocoloração CD31 não foi afectada nos tumores de xenoenxerto, n = 6.

inibidores multi-cinase do receptor de tirosina induzir BGN

O

in vivo

e

in vitro

dados descritos acima fortemente sugerido que BGN é um inibidor do crescimento em células de câncer de bexiga humanos. Até à data foram descritos há moduladores terapêuticos de expressão BGN em câncer. Assim, foi investigado o efeito de inibidores de moléculas pequenas de quinase de tirosina receptor na expressão BGN. Para este efeito, os inibidores de tirosina-quinase de vários receptores, e sorafenib sunitinib, foram utilizados em concentrações que são conhecidos por inibir a proliferação de células de cancro, incluindo cancro da bexiga (J82) células [30-32]. A morfologia celular não foi afectada dentro de 24 horas de tratamento com sorafenib e sunitinib. Digno de nota, o tratamento com sorafenib (10 uM) e sunitinib (1 fiM) resultou em forte aumento da regulação da expressão de ARNm BGN após 24 horas (Figura 6A).