Abstract

A que ocorre naturalmente ácido betulínico triterpen�de (BA) mostra polifarmacologia pronunciada variando de anti-inflamatório para atividades anti-lipogênicas. Evidências recentes sugerem que, em vez diversos eventos de sinalização celular pode ser atribuído ao mesmo comutador de montante comum no metabolismo celular. Neste estudo, portanto, nós examinamos as alterações metabólicas induzidas por administração BA (10 uM), com foco no metabolismo da glucose celular. Nós demonstramos que a BA eleva as taxas de captação de glicose celular e glicólise aeróbica em fibroblastos de rato embrionárias com concomitante redução da oxidação da glicose. Sem que produz sinais de óbvio BA morte celular leva a função mitocondrial comprometida, um aumento da expressão de proteínas de desacoplamento mitocondriais (UCP) 1 e 2, e quinase hepática B1 (LKB1) proteína quinase dependente de AMP-activação activado. activação AMPK representa o aumento da absorção de glucose e a glicólise que por sua vez são indispensáveis ​​para a viabilidade celular após tratamento BA. No geral, nós mostramos pela primeira vez, um impacto significativo da BA na bioenergética celular que pode ser um mediador central das ações pleiotrópicas de BA

Citation:. Heiss EH, Kramer MP, Atanasov AG, Beres H, Schachner D, Dirsch VM (2014) Alternar Glicosidases em resposta ao ácido betulínico em células não cancerosas. PLoS ONE 9 (12): e115683. doi: 10.1371 /journal.pone.0115683

editor: Mika Jēkabsons, Universidade do Mississippi, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de junho de 2014; Aceito: 01 de dezembro de 2014; Publicação: 22 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Heiss et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Fundo de Ciência Austríaco (número de concessão 23317) para EHH Herzfelder ‘Familienstiftung sche para EHH. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O ácido betulínico (3β-3-hidroxi-lup-20 (29) -en-28-óico; BA) é um triterpeno pentacíclico que ocorre naturalmente com um perfil de actividade multifacetada. Vários estudos revelaram entre outros anti-virais, anti-proliferativos, pró-apoptóticos e anti-inflamatórios, vasoprotetores, bem como anti-diabéticas e anti-lipogênicas propriedades para Ba e os seus derivados, tanto in

in vitro

e

in vivo

[1] – [11]. Em linha com a pletora de bioatividades relatados vários alvos moleculares têm sido propostos, incluindo o fator nuclear kB – [12], a proteína de ligação de esteróis elemento regulador – [7], e do NO endotelial via de sintase [5], o mitocondrial permeabilidade poro de transição (MPTP) [13], aciltransferase diacilglicerol [14], o receptor de ácido biliar TGR5 [6], lipases [15] ou proteína tirosina fosfatase 1B [16].

recentemente tornou-se cada vez mais apreciado que o programa metabólica não é um espectador passivo, mas um modulador activa de transdução de sinal e o fenótipo de uma célula [17]. Uma alteração no programa metabólica pode influenciar de uma só vez e múltiplos na primeira vista vias de sinalização não relacionada, e.g. fornecendo ou limitar substratos cruciais para o anabolismo, citoproteção ou modificações pós-translacionais, e ser visto como um determinante montante central do comportamento celular [18].

hipótese de que alguns dos bioatividades exercidas pela BA são uma consequência da bioenergética alterada nos propusemos a investigar o impacto da BA sobre o metabolismo da glicose.

Materiais e Métodos

Células, produtos químicos e anticorpos

tipo selvagem (WT) e isogênico AMPKα

1 – /- fibroblastos de rato embrionárias (MEF) e WT e LKB1 – /- MEF foram presentes amáveis ​​de Benoit Viollet, INSERM Paris, França e Reuben Shaw, do Instituto Scripps, La Jolla, EUA, relatada em [19] e [20] , respectivamente. Murino 3T3-L1, C2C12, células RAW 264.7 eram da LGC /ATCC (Wesel, Alemanha). As células endoteliais humanas primárias (HUVEC) foram de Lonza (Braine-L’Alleud, Bélgica). O ácido betulinico (99% de pureza) foi adquirido a partir de Biosolutions Halle GmbH (Halle, Alemanha). -Trítio identificada como 2-deoxiglicose (DOG) foi fornecido por NEN (Viena, Áustria). O CellTiterGlo, o CaspaseGlo- e os ensaios de citotoxicidade CytoTox96 não radioactivos veio da Promega (Mannheim, Alemanha). MitoTracker verde e vermelho MitoSox foram adquiridos a partir de Invitrogen (Viena, Áustria). placas de cultura de células especiais, cartuchos, solução de calibração, bem como kits de teste glicólise e estresse mitocondrial foram encomendados à cavalo marinho Biosciences. STO609 veio de Calbiochem. anti-AMPK (# 2532), anti-pAMPK (Thr172) (# 2535), anti-pACC (Ser79) (# 3661), o anti-LKB1 primário (# 3047) anti-PDHE1 (# 2784), bem como o anticorpos dirigidos contra enzimas glicolíticas (kit amostrador glicólise) veio da Cell Signaling Technology (Frankfurt am Main, Alemanha). Os anticorpos anti-GLUT1 e GLUT3 veio da Millipore (Viena, Áustria) (# CBL242; # AB1344), o UCP1 anti- ou 2 anticorpos foram encomendados à Abcam (Cambridge, UK) (# 10983, 77363), o anti-p -PDHE1 (Ser273) foi de Novus Biologicals (Cambridge, Reino Unido) (# NB11093479) e o anticorpo anti-actina foi de mpbio (Eschwege, Alemanha) (# 69100). Secundária a peroxidase de rábano (HRP) -coupled anticorpos anti-coelho e anti-murganho veio de Cell Signaling Technology mpbio e, respectivamente, e o anticorpo de HRP-anti-cabra foi de Santa Cruz (Heidelberg, Alemanha). Todos os outros produtos químicos eram da Sigma-Aldrich (Viena, Áustria). Todos os compostos de teste ou inibidores foram dissolvidos em DMSO, ao abrigo da luz tanto quanto possível, aliquotado e armazenado a -20 ° C. Para as experiências de células, a concentração final de DMSO foi mantida constante em todas as amostras e nunca excedeu 0,3% de DMSO.

Cultivo de células

Excepto para as células HUVEC foram rotineiramente subcultivados em meio essencial modificado de Dulbecco ( DMEM, 4,5 g /L de glucose a partir de Lonza), suplementado com soro a 10% inactivado pelo calor de vitelo fetal (Invitrogen) e 2 mM de glutamina (Lonza). As células HUVEC foram cultivadas em meio de crescimento endotelial (EGM1) e suplementos fornecido pela Lonza. Para a diferenciação de células 3T3-L1 para adipócitos maduros e de mioblastos C2C12 para miotubos protocolos padrão foram utilizados tal como descrito noutro local [21], [22]. As células foram rotineiramente testados como livres de micoplasma e mantidas em cultura 11 passagens (para HUVEC primário 5).

Determinação da

taxa de absorção de glicose celular

A determinação da captação de glicose celular taxa foi realizada como previamente descrito [23]. Resumidamente, as células foram preparadas em placas de 12 poços. Após tratamento como células indicadas foram equilibradas em tampão de Krebs Ringer padrão de fosfato (HEPES KRPH) contendo 0,2% de albumina de soro bovino (BSA) durante 20 minutos. A absorção de glucose foi iniciada por adição de 2-DOG enriquecida com 2-desoxi-D- (1H3) -glucose (concentrações finais de 0,1 mM e 0,45 uCi /ml). Após 15 min, a reacção foi interrompida por três lavagens rápidas com PBS gelado. A taxa de absorção de glucose foi determinada por contagem de cintilação líquida (Perkin Elmer, Brunn am Gebirge, Áustria) de lisados ​​de células (lise com NaOH 0,05 N em PBS), normalizado para o conteúdo de proteína avaliada pela Rotiquant ™ (Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha) ensaio de proteína e tempo de fixação (para obter a radioactividade incorporada por mg de proteína e minutos) e corrigida para a absorção de glucose mediada por não-transportador (que não é inibida por co-tratamento com citocalasina B (10 uM) durante o processo de absorção). Oligomicina A (2 mM, 4 h) serviu como controle positivo para o aumento da captação de glicose basal.

Avaliação do potencial de citotoxicidade via determinação da desidrogenase lançado lactato (LDH), os níveis de ATP, a clivagem caspase ea biomassa

MEFs foram cultivadas em placas de 96 poços (densidade de sementeira de 2,5 x 10

4 células /cavidade). Após o tratamento, conforme indicado que determinou a libertação de LDH (medida para a integridade da membrana), os níveis de ATP (medida para a viabilidade celular) e clivagem caspase (medida para a indução de apoptose) com o CytoTox96 não radioativo Ensaio de citotoxicidade, a CellTiterGlo luminescentes de viabilidade celular Assay eo CaspaseGlo 3/7 luminescentes ensaio, respectivamente. Todos os kits foram realizados de acordo com os protocolos fornecidos. A biomassa foi corado por meio decantar e incubando células fixadas com solução de violeta de cristal (0,5% (w /v) de violeta de cristal /20% (v /v) de MeOH) durante 5-10 minutos. Depois etapas completas de lavagem com água da torneira (a fim de se livrar do excesso de corante) e secagem do corante ligado foi solubilizado com uma solução de citrato de álcool (0,05 M /citrato de 50% (v /v) EtOH) e quantificados por leituras de absorvância a 595 nm. Absorbância e luminescência foram monitorizados num leitor Tecan (Grödig, Áustria) Sunrise e placa GeniosPro, respectivamente. Triton (1%), estaurosporina (1 M) ou uma combinação de oligomicina A (2 M) e DOG (10 mM) serviram como controlos positivos para os respectivos ensaios.

factor relacionado com E2 fator Nuclear 2 ( Nrf2) gene repórter dependente de ensaio

o ensaio de gene repórter Nrf2-dependente foi baseado na expressão de luciferase desencadeada por o elemento de resposta antioxidante activado (ARE) de glutationa murino

S

-transferase e executou como previamente descrito [24]. CDDO-IM, uma triterpen�de sintética (100 nM), serviu como controlo positivo e foi gentilmente cedido por Michael Sporn, Geisel School of Medicine, em Dartmouth, Hanover, NH, EUA.

análise Extracelular fluxo para a determinação de glycolytic e capacidades respiratórias

MEF foram semeadas em culturas de células de 24 poços placas revestidas com colagénio adequado (a partir Seahorse Biosciences; Copenhaga, Dinamarca), densidade celular de 2,7 x 10

4 células /poço). Após tratamento como indicado células foram mantidas em meio isento de soro (DMEM mais glutamina 2 mM, glucose 0 mM, 0 (teste de stress a glicólise) ou dois (teste de stress mitocondrial) piruvato mM, pH 7,35-7,40) a 37 ° C e CO ambiente

2 por uma hora antes de serem submetidos a glicólise (leitura: taxa de acidificação extracelular (ECAR) em mph /min) e mitocondrial (leitura: taxa de consumo de oxigênio (OCR) em pmole O

2 /min) testes de estresse . kits de teste apropriados veio do cavalo marinho Biosciences, foram realizadas de acordo com as instruções dos fabricantes e analisadas em um cavalo marinho 24XF

e extracelular fluxo analisador e software Wave (www.seahorsebio.com). Optimized concentrações de inibidor para MEF foram 2 uM oligomicina A, 1,5 uM carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP), 1 uM rotenona A, antimicina A 1 uM, e 2-DOG 100 mM. Normalização de massa celular foi realizada rotineiramente por coloração violeta cristal após a análise, a fim de explicar possíveis diferenças no número de células.

A determinação do lactato extracelular como marcador para glicólise

MEFs foram preparadas de placas de 24 poços. Após tratamento como células indicadas foram lavadas com PBS e depois incubadas com o padrão de Krebs Ringer HEPES Fosfato (KRPH) tampão suplementado com 0,2% de BSA e glucose 10 mM durante 2 horas. Em seguida, os sobrenadantes foram analisados ​​quanto ao seu teor de lactato através de um ensaio de fluorescência acoplado a enzima, e as células foram lisadas e o seu teor de proteína foi determinado. Resumidamente, um volume de sobrenadante (geralmente diluída 1:20) foi misturado com um volume de tampão de ensaio (tampão KRP com 10 uM Amplex Red, 1 U /ml de lactato-oxidase e 2,5 U /mL de peroxidase de rábano), incubou-se durante 10 minutos e, em seguida, ler num flourimeter a um comprimento de onda de excitação de 535 nm comprimento de onda e de emissão de 590 nm. A monitorização paralela de soluções com concentrações conhecidas de lactato facilitou uma leitura final do mol lactato de proteína /g * min.

determinação Flow-citometria de conteúdo mitocondrial e espécies reativas de oxigênio mitocondrial (ROS) de produção

MEF foram cultivadas em placas de 12 ou 6- poços (densidade de sementeira de 1,5 x 10

4 ou 3 × 10

4 células por poço) e tratados conforme indicado. Para a determinação das células conteúdo mitocondrial foram coradas com 50 nM MitoTracker Green (Invitrogen) por 20 minutos e, em seguida, analisados ​​no canal verde (FL1, ex 488 nm; em 530/30 nm) da FACS Calibur (BD Biosciences, Schwechat, Áustria). A média arbitrária de fluorescência verde foi tomada como medida pelo conteúdo mitocondrial após correcção para autofluorescência [25], [26]. Valinomicina serviu como controlo para o potencial de independência do sinal MitoTracker Green. Para a determinação de células de produção de ROS mitocondrial foram incubadas com 5 ^ M MitoSox vermelho (Invitrogen) durante 10 min e em seguida analisadas quanto à sua fluorescência vermelha corrigido-autofluorescência (canal FL2, ex 488 nm; em 585/42 nm) no citómetro de fluxo. A média de fluorescência arbitrárias vermelho foi tomada como leitura para mitocondrial ROS produzido. Antimicina A (2 uM) serviu como controlo positivo neste ensaio.

extracção de proteína, SDS-poliacrilamida de electroforese e imunotransferência análise

MEFs foram preparadas em placas de 6 poços e tratadas como indicado. A análise de imunotransferência incluindo a extracção de proteínas, run gel, transferência, imunodetecção e avaliação densitométrica foram realizadas conforme descrito em outro lugar [23]. Para a detecção de GLUT1 e 3 amostras não foram fervidas antes da electroforese de forma a impedir a agregação e a precipitação. Para a detecção de proteínas de tamanho semelhante (por exemplo, forma fosforilada contra proteína total) duas membranas idênticos fora do mesmo extractos de proteína foram preparados e avaliados, a fim de evitar potenciais artefactos ou sinais ambíguos devido à remoção incompleta.

Estatísticas

Para as análises estatísticas experimentos foram realizados pelo menos três vezes (n≥3; experimentos independentes (réplicas biológicas)). Os gráficos de barras representam a média + SD. Dois grupos foram comparadas pelo teste t de Student, mais grupos foram analisados ​​por um ou ANOVA de duas vias, dependendo do número de variáveis ​​nos conjuntos de dados investigados, seguida do teste post hoc de Dunnett ou Bonferroni. Todas as análises estatísticas foram feitas com o GraphPad Prism. Diferenças com valores de p . 0,05 foram considerados como significativos e são designados com *

Resultados

BA aumenta celular glucose captação

Inicialmente foi avaliada a taxa de captação celular de glicose após tratamento com BA em diferentes tipos de células, incluindo células endoteliais primárias humanas (HUVEC), imortalizadas macrófagos murinos (RAW264.7), myo diferenciada rato (C2C12) – e adipócitos (3T3-L1), bem como os fibroblastos embrionários de murídeo (MEF). Nós consistentemente observada uma absorção aumentada basais de glucose em todos os tipos de células em cerca de 50 a 100% (Fig. 1A) com BA, a uma concentração a 10 uM (concentração quase óptima para todas as linhas celulares utilizadas como determinada através de experiências de concentração-resposta; S1 FIG.). A oligomicina A, um inibidor da ATP sintase mitocondrial, foi utilizado como controlo positivo. Estes achados sugerem um aumento independente geral e tipo de célula da incorporação de glicose pela BA. A adição de concentrações saturantes de insulina de adipócitos e miócitos diferenciados, dois tipos de células de glicose no escoamento sensíveis à insulina principais, levou a um aumento da absorção de glucose celular na parte superior do efeito BA (Fig. 1B) que aponta para uma acção independente da insulina de BA.

(A) diferentes tipos de células (adipócitos diferenciados (3T3-L1), miotubos diferenciadas (C2C12), células endoteliais (HUVEC), macrófagos (RAW264.7) e fibroblastos embrionários de murídeo (MEF)) foram tratados com 10 BA uM (+) ou 0,1% de DMSO (-) durante 16 h antes da sua taxa de absorção celular de glucose foi determinada como descrito. A oligomicina A (OL, 2 ^ M durante 4 h) serviu como controlo positivo para o aumento da captação de glicose basal. O gráfico de barras que mostra as taxas de captação de glicose em relação à média do respectivo controlo de DMSO (n = 3 (isto é, três experiências independentes, cada um em triplicado); * P 0,05 vs Ctrl DMSO, ANOVA). (B) adipócitos diferenciados (esquerda) e miócitos (direita) foram tratados com BA (10 mM) durante 16 horas anteriores ao soro fome e estímulo de insulina (15 min; 3T3-L1: 15 nM de insulina; C2C12: 100 nM de insulina). Em seguida, foi determinada a absorção de glucose celular. Os gráficos de barras representam as taxas de captação de glicose em relação à média do respectivo controlo de veículo não estimulado. (N = 3 (i.e. três experiências independentes, cada um em triplicado); média + SD; * p 0,05 vs Ctrl DMSO não estimulada, ° P 0,05 vs Ctrl DMSO estimulada por insulina, ANOVA de duas vias, de Bonferroni). Oligomicina A (OL, 2 M para 4 h) serviu como controle positivo para o aumento da captação de glicose basal.

BA não induz a morte celular em MEF

Como o aumento da captação de glicose pode indicar stress celular e citotoxicidade, e BA foi demonstrado exercer efeitos pró-apoptóticos em vários tipos de células (do cancro), o próximo determinado se a captação de glicose elevada observada está associada com morte celular subsequente. Foram tratados MEF, o tipo de célula seleccionada para todos os estudos posteriores, com 10? M BA durante 48 h e determinou-se a libertação relativa de lactato desidrogenase (LDH; rácio de matriz extracelular e total) como leitura para a morte celular e desintegração da membrana (Fig. 2A) , a activação de caspases como leitura para a indução de apoptose (Fig. 2B), os níveis de ATP como sinal de viabilidade de células geral (Fig. 2C) e a ligação de violeta de cristal como mancha de biomassa simples (Fig. 2D). BA a 10 uM e 30 uM não induziu quaisquer alterações significativas em comparação com células de controlo tratadas com DMSO. Assim, o aumento da captação de glicose observada após exposição BA é improvável devido a morte celular iminente. Além disso, a BA não desencadear a activação do factor relacionado com factor nuclear factor de transcrição E2 2 (Nrf2) como mostrado em um ensaio de gene repórter Nrf2-dependente. activação Nrf2 é bem conhecido, como indicador para uma resposta ao stress celular após exposição a xenobióticos (S2 Fig.). A ausência de toxicidade até concentrações de 30? M também pode ser confirmado para células endoteliais, adipócitos e miócitos (S3 Fig.) E suporta a noção geral da toxicidade câncer seletiva de BA.

MEF foram tratados com BA (10 pM e 30 uM) durante 48 h antes de serem submetidas a determinação da integridade da membrana (% libertação de LDH) (a), o potencial de acontecimentos pró-apoptóticos (activação de caspase 3/7) (B), dos níveis de ATP (C ) e biomassa (D). Os gráficos de barras mostram compilação de três experimentos independentes (expressas como dobra do DMSO valor no B, C e D média), cada um em quatro (média + SD, * p 0,05, ANOVA, pós-teste de Dunnett contra DMSO ctrl). Estaurosporina (Stauro, 1 M para 6 h), triton (1% para 1 h) ou uma combinação de oligomicina A (OL, 2 M) e DOG (10 mM, 5 h) serviram como controlos positivos nos ensaios

BA eleva aeróbica glicólise

em seguida, estavam interessados ​​no destino metabólico da glicose ingerida. A taxa glicolítica foi investigada por meio de análise de fluxo extracelular. Observou-se que as células tratadas-BA mostrou uma significativamente maior taxa de acidificação extracelular (ECAR) após a adição de glucose do que os seus homólogos tratados com veículo (Fig. 3A e B). Em um ensaio complementar a determinação dos níveis de lactato extracelular estamos constantemente monitorados produção de lactato elevada por células tratadas com Ba (S4 Fig.). Estes resultados indicam uma taxa mais elevada em glicolítica BA células tratadas e excluir uma influência de um putativo membranosa V-ATPase para a acidificação observada. A capacidade glicolítica máxima (ECAR após a adição oligomicina e inibição da produção de ATP mitocondrial) é comparável entre DMSO e células tratadas com BA. Consequentemente, as células tratadas com BA possuem uma diminuição significativa capacidade ociosa glycolytic (ΔECAR

maximal- ECAR

basal) (Fig. 3B). Estes dados mostram que a BA dirige células para uma exploração plena do seu potencial glicolítico em desfavor da oxidação da glicose (Fig. 3C). Um aumento da fosforilação observada de piruvato desidrogenase E1 (PDHE1) ainda alusão a um interruptor glycolytic após tratamento BA. A fosforilação PDHE1 torna menos activo e interfere com a descarboxilação oxidativa do piruvato em acetil-CoA favorecendo a redução de piruvato em lactato (Fig. 3D). No entanto, mais experimentos serão necessários para avaliar de forma inequívoca ao que fosforilação medida PDHE contribui a glicólise quase máxima nas células tratadas com BA. O nível de várias enzimas glicolíticas investigados expressão não foi alterado (Fig S5.), Que, no entanto, não exclui uma actividade enzimática alterada devido à covalente ou modificação alostérica. A expressão do transportador de glucose GLUT1 foi elevada após tratamento BA durante 16 h enquanto que os níveis de GLUT3 não foi alterada (Fig. 3E). GLUT2 /4 não eram detectáveis ​​no nosso MEF.

MEF foram tratadas com 10? M BA ou DMSO (0,1%) durante 16 horas antes de serem submetidos a um teste de stress a glicólise, conforme descrito em “Materiais e Métodos”. Em (A), a taxa de acidificação extracelular (ECAR) está representado em cima células expor, sucessivamente, à glicose (10 mM), oligomicina A (2 uM) e desoxiglucose (DOG, 100 mM) (média + SD; compilado dados em bruto a partir de três experiências independentes com quatro repetições técnicas cada). Em (B) esses dados são analisados ​​em termos de basal (ECAR glycolytic após a adição de glicose), máxima (ECAR glycolytic após oligomicina) e poupar (actividade menos basal máxima) atividade glicolítica (média + SD, * p 0,05, teste t , DMSO versus BA). A quantificação baseia-se no valor no ponto de tempo final de cada condição de tratamento. Em (C) e valores de OCR ECAR (de DMSO e células tratadas com BA (16 h)) após a adição de glucose foram representados graficamente contra o outro de visualizar a mudança de oxidação de glicose para a glicólise. A mudança observada após a adição de oligomicina A é adicionado ao lote como uma referência. (D) MEF foram tratadas com DMSO (0,1%, D) e 10 uM ba para os períodos de tempo indicados antes de lisados ​​de células totais foram submetidos a análises de imunotransferência para pPDHE1 (Ser273) e PDHE1 total (peso molecular 43 kDa). borrões representativas dos três experimentos são mostrados. O gráfico abaixo mostra compilado valores densitométricos de pPDHE /PDHE (n = 3; média + SD; * p 0,05; teste-t; DMSO vs BA em cada ponto de tempo). (E) MEF foram tratados com BA 10 uM ou DMSO (0,1%) durante 16 horas antes de serem submetidos a análise de imunotransferência para GLUT1 (~ 50 kDa), GLUT3 (~55 kDa) e actina (42 kDa). borrões representativas dos três experimentos independentes são mostrados. O gráfico abaixo mostra compilado valores densitométricos de GLUT1 /actina e GLUT3 /actina, respectivamente (n = 3; média + SD; * p 0,05; teste t; DMSO vs BA em cada ponto de tempo)

.

BA prejudica a função mitocondrial

Como aumentou a glicólise aeróbica pode compensar uma produção de ATP prejudicada pela fosforilação oxidativa nós próxima examinou a função mitocondrial após o tratamento BA. Observou-se um aumento da produção de ROS mitocondrial (Fig. 4A) e a expressão elevada de proteínas de desacoplamento UCP1 e UCP2 no MEF tratados com BA (Fig. 4B). O conteúdo total de mitocondrial permaneceram inalterados (Fig. 4C). função mitocondrial alterada foi confirmada em um teste de estresse mitocondrial e análise de fluxo extracelular. As células apresentaram uma ligeira redução taxa de consumo de oxigénio basal (OCR), um acoplamento de redução do consumo de oxigênio para a produção de ATP mitocondrial (Δ (OCR

basal-OCR

oligomicina), diminuiu a respiração máxima (OCR após a dissipação do gradiente de prótons por FCCP), uma reduzida capacidade de reposição respiratória (Δ (OCR

máxima-OCR

basal)), bem como um aumento do vazamento de protões (Δ (OCR

oligomicina – OCR

a + R) ) quando tratados com BA, durante 16 h (Fig. 4E e F). Estes dados indicam que o tratamento com a BA interfere com a função mitocondrial, no entanto, ligeiramente como qualquer diminuição na viabilidade celular é desencadeada por BA (ver Fig. 2). é claro Tempo experiências revelaram que a respiração desacoplado (evidente na diminuição de OCR usados ​​para a produção de ATP em S6A Fig.) correlacionada com a indução dependente do tempo da UCP (S6B Fig.). no entanto, os problemas se a indução da UCP representa o desacoplamento observado ou se a própria BA molécula como bastante hidrofóbica com um valor de pKa de 5,5 é um desacoplador fracos necessitam de mais pesquisas. Notavelmente, mediante incubações curtas com BA (1-3 h) basal OCR tende a ser aumentada em comparação com células de controlo de DMSO como esperado para a respiração mitocondrial desacoplada (S6A Fig.). A redução posterior do OCR vista nas células tratadas com BA pode ser devido ainda adaptativa elusiva ou mecanismos adicionais desencadeadas pela triterpenóide, tais como a dissipação do potencial da membrana mitocondrial ao longo do tempo ou um fluxo de electrões prejudicada através da cadeia respiratória.

(a) MEF foram tratados com 10 BA uM ou 0,1% de DMSO durante 16 h antes de serem submetidas a análise citométrica de fluxo da produção de ROS mitocondrial com o uso de MitoSox vermelho e antimicina a (2 uM, 1 h) como controlo positivo . (N = 3 (cada um em duplicado ou triplicado); média + DP, * p 0,05, teste t). (B) MEF foram tratadas com DMSO ou 10 ^ M BA durante 16 h antes de lisados ​​de células totais foram submetidos a análise de Western blot para UCP1, UCP2 (banda no ~25-35 kDa) e actina (42 kDa) como controlo de carga. blots representativos de três experiências independentes estão representados. O gráfico abaixo mostra compilado valores densitométricos de UCP1 /actina e UCP2 /actina, respectivamente (n = 3; média + SD; * p 0,05; teste-t; DMSO vs BA). (C) MEF foram tratados com BA ou 10 uM de 0,1% de DMSO durante 16 h antes de serem submetidas a análise citométrica de fluxo do conteúdo mitocondrial usando MitoTracker Green. Valinomicina (200 nM, 16 h), um disruptor conhecido do potencial de membrana mitocondrial serviu como controlo para o sinal de potencial-independente de MitoTracker Green. MEF foram tratados com BA 10 uM ou DMSO (0,1%) durante 16 horas antes de serem submetidos a um teste de stress mitocondrial, conforme descrito em Materiais. Em (D) a taxa de consumo de oxigénio média (OCR) de três experiências independentes é representado sobre as células que expõem sucessivamente a oligomicina (2 uM), FCCP (1,5 uM) e antimicina A + rotenona (A + R; 1 + 1 | iM). Em (E) esses dados são analisados ​​em termos de taxa de consumo de oxigênio em condições basais, o consumo de oxigênio para a síntese de ATP, frequência respiratória máxima, capacidade respiratória de reposição e vazamento de prótons (média + SD, * p 0,05, teste t, DMSO vs . BA).

BA ativa proteína quinase ativada pela AMP (AMPK)

função mitocondrial reduzida tem sido associada com a ativação da AMPK (revisto em [27]), um centro de metabólica hub mestre. ativação da AMPK pode ainda explicar um aumento da captação de glicose e compensatória taxa glicolítica [28], [29]. Por isso, investigou se BA leva a AMPK activado. Usando a análise de imunotransferência observou-se um aumento transiente da AMPK fosforilação na treonina 172, indicativo de actividade elevada AMPK, em BA tratado versus as células de controlo (Fig. 5a). AMPK activação foi ainda corroborada pelo aumento da fosforilação da acetil-CoA carboxilase (ACC), a serina 79, um alvo a jusante comum de AMPK. O uso de isogénicas WT MEF e AMPK homólogos knockout revelou que o aumento da captação de glicose, o aumento da expressão do transportador de glucose GLUT1 e metabolismo da glicose através da glicólise elevada eram dependentes da presença de AMPK (Fig. 5B, C, D). No entanto, BA induziu uma redução comparável da função mitocondrial (por exemplo, redução da respiração máxima em aproximadamente 40% em relação ao controlo de DMSO) em ambos WT e AMPK – /- MEF. Este achado colocado disfunção mitocondrial activação a montante de AMPK (Fig. 5E) estando em linha com a activação observada de AMPK, indução de GLUT1, uma absorção de glucose elevada, e um aumento da taxa glicolítica mediante desacoplamento imposta-FCCP leve (S7 Fig.). De nota, AMPK – /- células mostraram uma taxa de consumo de oxigênio geralmente inferiores WT MEF, provavelmente, em parte devido ao seu reduzido número de mitocôndrias (S8 Fig.). Comparando WT e células deficientes em quinase do fígado B1 (LKB1), a AMPK cinase que responde a uma proporção alterada de AMP /ATP [30], sugeriu LKB1 como o principal quinase AMPK envolvidos: LKB1 – /- células exibidas diminuída AMPK fosforilação em mediante tratamento BA (Fig. 5F).

(a) MEF foram tratadas com DMSO (0,1%) ou BA (10 uM) para os períodos de tempo indicados. Os lisados ​​celulares totais foram submetidos a análise de immunoblot para pAMPK (Thr172) e AMPK total (60 kDa) (painel da esquerda) ou pAMPK (Thr172), pACC (Ser79) (~245 kDa) e actina (42 kDa) (painel da direita). borrões representativas dos três experimentos independentes são retratados. Os gráficos abaixo ilustram compilado valores densitométricos de pAMPK /ou AMPK pACC /actina, respectivamente (n = 3; média + SD; * p 0,05; teste-t; DMSO vs BA em cada ponto de tempo). WT e AMPK – /- MEF foram tratadas com DMSO ou BA (10 uM) durante 16 h. Em seguida, as taxas de absorção de glucose celulares (B) foram avaliadas (n = 3 (em triplicado); média + DP, * p 0,05, ANOVA, pós-teste de Dunnett vs DMSO ctrl), bem como os níveis de GLUT1 expressão (50 kDa), AMPK (60 kDa) e actina (42 kDa) por análise de western blot (C). Um blot representativo é descrito de três experiências independentes. O gráfico abaixo mostra compilado valores densitométricos de GLUT1 /actina, respectivamente (n = 3; média + SD; * p 0,05; teste-t; DMSO vs BA). Em células (D) foram sujeitas a determinação da taxa de acidificação extracelular (ECAR) como descrito na Fig. 3. Os resultados representativos de três experiências independentes (com três repetições técnicos de cada) são mostrados (média + SD, * p 0,05, teste t). (E) WT e a AMPK – /- MEF foram tratadas com DMSO (0,1%) ou BA (10 uM) durante 16 h antes de serem submetidos a um teste de stress mitocondrial e análise de fluxo extracelular. dados compilados de três experimentos independentes são representados (média + SD). (F) WT e LKB1 – /- MEF foram tratados com BA (10 M) para os períodos de tempo indicados antes de lisados ​​celulares totais foram submetidos à análise immunoblot para pAMPK (Thr172), AMPK (60 kDa), LKB1 (~ 50 kDa ) e actina (42 kDa). borrões representativas dos três experimentos independentes são retratados. O gráfico abaixo mostra compilado valores densitométricos de pAMPK /AMPK, respectivamente (n = 3; média + SD; * p 0,05; ANOVA, Dunnett (vs 0 h tratamento com BA)

Estes dados. mostrou que a BA função mitocondrial ligeiramente alterada, desencadeada ativação da AMPK via LKB1 que por sua vez provocou o aumento da ingestão de glicose e mudou o metabolismo da glicose celular da oxidação de glicólise aeróbica.

BA torna as células dependentes de glicose

Intrigado pela constatação de que a BA impulsiona células em atividade glicolítica reforçada nós próxima testado se as células BA prestados glicose viciado. para isso, avaliou a viabilidade celular (níveis de ATP, biomassa) do MEF tratados com veículo ou BA na ausência e presença de glicose por 48 h . para as células com privação de glicose que adicionado manitol como o equilíbrio osmótico. as células de controlo tratadas com DMSO bem suportado com depleção de glicose, como é evidente a partir da biomassa inalterado e os níveis de ATP em comparação com a condição “além de glicose”. na ausência da glucose as células até mostrou um reprodutível tendência para níveis elevados de ATP que pode ser explicado pela oxidação mitocondrial forçada de substratos (por exemplo, ácidos gordos contidos no soro) com um rendimento mais elevado do que o ATP glicose.