Abstract

biomarcadores sensíveis e específicos da inibição da proteína quinase pode ser aproveitado para acelerar estudos de desenvolvimento de medicamentos em oncologia, associando respostas moleculares precoces com a inibição alvo. Neste estudo, utilizamos proteômica imparciais shotgun fosfotirosina (PY) para descobrir novos biomarcadores de resposta ao dasatinib, uma pequena inibidor de Src-seletiva molécula, em modelos pré-clínicos de cancro colorectal (CRC). Foi realizada imparciais proteômica espectrometria de espingarda PY massa para revelar o proteoma pY de HCT-116 células de carcinoma do cólon cultivadas, e depois estendido essa análise para tumores de xenoenxerto HCT-116 para identificar biomarcadores PY de dasatinib-resposta in vivo. Principais dasatinib-responsivo locais Py em tumores de xenoenxerto incluídos sites on-tipo delta proteína quinase C (PKCδ), proteína CUB contendo o domínio 1 (CDCP1), Tipo-II SH2-contendo o domínio inositol-5-fosfatase (Ship2), e receptor alfa da proteína-tirosina-fosfatase (RPTPα). O site pY313 PKCδ foi ainda apoiada como um biomarcador importante de inibição de Src mediada por dasatinib no HCT-116 xenotransplantes por imuno-histoquímica e immunoblotting com um anticorpo fosfoespec�ico. Redução de PKCδ pY313 foi adicionalmente correlacionada com a inibição mediada por Src e dasatinib de crescimento diminuída como esferóides de um painel de linhas celulares de CRC humanos. Estes estudos revelam PKCδ pY313 como uma leitura promissora de inibição de Src na CRC e potencialmente outros tumores sólidos e pode refletir a capacidade de resposta ao dasatinib em um subgrupo de cancros colo

Citation:. McKinley ET, Liu H, McDonald WH, Luo W, P Zhao, Coffey RJ, et ai. (2013) Globais fosfotirosina Proteomics Identifica PKCδ como um marcador de resposta ao Src A inibição do câncer colorretal. PLoS ONE 8 (11): e80207. doi: 10.1371 /journal.pone.0080207

editor: Laszlo Buday, da Academia de Ciências da Hungria, Hungria

Recebido: 19 de julho de 2013; Aceito: 30 de setembro de 2013; Publicação: 08 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 McKinley et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Estes estudos foram apoiados por doações do Instituto Nacional do Câncer: R25 CA136440, P50-951903; R01-CA140628; K25-CA127349; RC1-CA145138; R01-CA46413; e da Fundação Kleberg. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a fosforilação da tirosina é um mecanismo de sinalização chave que regula aspectos centrais do comportamento de células de mamíferos, incluindo a proliferação, motilidade, metabolismo, diferenciação e [1]. As proteínas tirosina quinases foram reconhecidas pela primeira vez como produtos de oncogenes virais, incluindo V-src e v-abl, e como receptores para factores de crescimento incluindo o EGF. sinalização aberrante por muitas das tirosina-quinases noventa convencionais codificadas pelo genoma humano tem sido associada a processos de doenças, incluindo o desenvolvimento e propagação do cancro [1,2].

A terapia direcionada com inibidores da tirosina quinase (TKI) é uma modalidade em expansão que permite a terapia do câncer personalizado [3,4]. Exemplos incluem o marco de imatinib inibidor de molécula pequena que trata eficazmente leucemia mielóide crónica impulsionado pelo BCR-ABL oncoproteína [5,6], assim como terapias para inibir BRAF mutante em cancros como o melanoma [7,8]. Molécula pequena TKI e anticorpos monoclonais neutralizantes que têm como alvo o receptor de EGF (EGFR) e /ou ErbB2 intimamente relacionados (HER2 /neu) tiveram sucesso no tratamento de carcinoma do pulmão de células não pequenas e carcinoma da mama [9,10].

No carcinoma colorectal (CRC), a grande maioria dos casos de exibir actividade elevada da família src quinases nonreceptor tirosina [11,12], que aumentam progressivamente em atividade como tumores progridem para doença metastática [13]. actividade de Src aberrante podem contribuir para a malignidade, impactando vários sistemas receptores, incluindo junções mediada por caderina célula-célula, adesões célula-ECM mediada pela integrina, e complexos de receptores activados incluindo o EGFR [14-16]. atividade de Src elevada no CRC prevê prognóstico clínico pobre [17]. Por conseguinte, tem havido um interesse considerável na Src como um alvo terapêutico em CRC e outros cancros [18-21]. Dasatinib, o inibidor de Src-selectiva clinicamente mais estudada, é um agente citostático eficaz inibidora de crescimento de tumor, invasão e metástase [22]. Além de cinases da família src, dasatinib inibe potentemente a BCR-ABL e foi mostrado recentemente como sendo superior ao imatinib como uma terapia para a leucemia mielógena crónica [23].

Na avaliação TKI orientadas na oncologia clínica, há a necessidade de identificar marcadores relevantes que podem ser usados ​​para orientar a selecção da dose em desenvolvimento pré-clínico e para monitorizar a actividade anti-tumor em testes clínicos. Os biomarcadores podem também ser de valor na previsão de se um paciente é susceptível de se beneficiar de um tratamento em particular. Vários estudos têm utilizado diversas abordagens na tentativa de identificar tais marcadores [24-26]. Racionalmente, tais biomarcadores podem também ser locais específicos de tirosina que são fosforilados pela quinase (s) a ser inibida. Assim, é de interesse para caracterizar as vias de sinalização da cinase de tirosina que operam nas células tumorais. A fosforilação da tirosina em células tumorais pode ser sistemática e abrangente perfilado usando espectrometria de massa para analisar peptídeos enriquecido para fosfotirosina (PY) por imunoafinidade [27]. Nós já aplicou esta abordagem imparcial proteômica espingarda para obter uma análise aprofundada da fosforilação da tirosina em normal versus fibroblastos de rato Src-transformados, caracterizando, assim, o impacto global da Src oncogênico [28]. tirosina quinases Em outra aplicação desta abordagem, pi sinalização em uma grande amostragem de linhas celulares de cancro de pulmão de células não-pequenas e tumores sólidos revelou activadas [29].

Os objectivos do presente estudo foram usa shotgun pY proteômica para obter uma visão global da fosforilação de tirosina na linha celular de adenocarcinoma bem conhecido HCT-116 do cólon humano, e para estender a análise para tumores de xenoenxerto HCT-116 tratados com dasatinib para identificar biomarcadores PY dasatinibe-responsivo. Identificamos locais Py em proteínas sinalizadoras incluindo PKCδ CDCP1 e RPTPα como principais locais dasatinibe-responsive em tumores de xenoenxerto HCT-116 que podem ser úteis como biomarcadores preditivos de inibição SRC. Finalmente, utilizando culturas estabelecidas de esferóide a partir de uma série de linhas celulares de CRC humanos, observou-se uma correlação entre a inibição mediada por datatinib da proliferação e redução da PKCδ pY313. Nossos resultados revelam PKCδ pY313 como um biomarcador candidato para prever a resposta ao dasatinib no CRC.

Materiais e Métodos

Cultura celular e tratamento de drogas

HCT-116 (ATCC CCL- 247), Caco-2 (ATCC HTB37), Colo205 (ATCC CCL-222), NSO-1, DLD-1 (ATCC CCL-221) foram obtidas da ATCC e células Lim1215 [30] foram obtidas a partir de Robert Whitehead, Ludwig Institute for Cancer Research. As linhas celulares de CRC humanas foram mantidas como uma cultura em monocamada em densidade subconfluentes numa co 5%

2, 37 ° C, atmosfera. O meio de crescimento consistia em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM; Mediatech) para todas as linhas celulares excepto Colo205 que foi cultivado em RPMI (Cellgro). O meio de crescimento foi suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Atlanta Biologicals), 1% de antibióticos antifúngicos (Mediatech), e 100 ^ M de aminoácidos não-essenciais (Gibco-Invitrogen). Todas as células foram passadas utilizando 0,25% de tripsina-EDTA (Gibco).

O dasatinib (BMS-354825) foi gentilmente cedido por Richard Smykla da Bristol-Myers Squibb Oncology (Princeton, NJ). Dasatinib foi dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) numa solução de reserva 10 mM. HCT-116, Caco-2, Colo205, NSO-1, e as células DLD-1 foram tratadas com concentrações crescentes de dasatinib (0, 10, 100, 1000, 5000 nM) durante 24 h. No final do tratamento, o meio de cultura foi removido e as células foram recolhidas para análise.

Modelo animal

Todos os estudos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Vanderbilt e foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento animal. HCT-116 foram gerados em xenoenxertos de ratinhos nus atímicos (Harlan Sprague-Dawley) após a injecção subcutânea de 2-4 × 10

6 células. tumores palpáveis ​​foram detectados dentro de 2 a 4 semanas. Dasatinib foi reconstituída em DMSO. Imediatamente antes do tratamento, solução salina nove partes estéril foi adicionado à solução de fármaco. ratinhos portadores de tumor (0,5-1 cm de dimensão mais longa) foram administrados 100? L de dasatinib (60 mg /kg) ou veículo de DMSO /solução salina por sonda oral. Os animais receberam uma dose única ou tratados diariamente durante 5 dias consecutivos. Para cada regime de tratamento, grupos de animais foram sacrificados e os tumores foram excisados ​​4 h e 24 h após a administração final da droga.

Preparação de amostras de péptidos enriquecido-fosfotirosina

peptídeos trípticos foram enriquecidos em fosfotirosina preparado a partir de HCT-116 (culturas em monocamada em crescimento exponencial em aproximadamente 70% de confluência) e HCT-116 a partir de tumores de xenoenxerto. A lise celular, a digestão de proteínas e enriquecimento de imunoafinidade para PY-contendo peptídeos trípticos foi conseguida utilizando o Kit PhosphoScan (P-Tir-100; Cell Signaling Technology), de acordo com o protocolo do fabricante. No caso de células cultivadas, cada ronda de análise foi efectuada utilizando 60 mg de proteína celular total (obtido a partir de oito pratos 150 mm). A concentração de proteína foi determinada utilizando o BCA (Thermo Scientific), com albumina de soro bovino (BSA; Sigma) como padrão. Os lisados ​​de tumor foram preparados por homogeneização em gelo para dispersar o tecido congelado (cerca de 400 mg de peso húmido de tumores em 9 mL em tampão de lise PhosphoScan), seguido por breve sonicação e centrifugação (20.000 ×

g

durante 15 min) para material insolúvel clara. Os lisados ​​tumorais Límpido contendo aproximadamente 40 mg de proteína (como determinado por ensaio BCA) foram usadas na análise. peptídeos trípticos foram gerados os lisados ​​por tratamento durante a noite a 25 ° C com tripsina TPCK-(60: 1 proteína celular: tripsina).

A espectrometria de massa

LC-MS /MS dos ptidos foi realizada usando um instrumento de armadilha de ião híbrido linear /Orbitrap (LTQ-Orbitrap, Thermo-Fisher) equipado com um Eksigent NanoLC-AS1 amostrador automático, Eksigent NanoLC-1D além de bomba de alto desempenho cromatografia líquida (HPLC) (Eksigent), fonte de nano-electrospray e software Xcalibur controle de instrumentos. Os péptidos foram separados numa coluna capilar de sílica fundida (100 um x 18 cm) empacotada com resina de fase reversa (Júpiter C18, 3 um, 300 Â; Phenomenex), e acoplado com um em linha, de frita (gerado com silicato líquido Kasil) prendendo coluna (100 mm x 4 cm), também carregada com resina C18 (Júpiter C18, 5 um, 300 Â, Phenomenex) [31]. gradiente de eluição cromatográfica bifásica foi empregue em que a fase móvel A consistia de ácido fórmico a 0,1% e a fase móvel B consistia de ácido fórmico a 0,1% em acetonitrilo. A taxa de fluxo durante o carregamento e a fase de dessalinização do gradiente foi de 1,5 mL /min e durante a fase de separação foi de 500 nL /min. Um 184 min de gradiente foi efectuada com um período de lavagem de 10 min desviado para o lixo depois de o pré-coluna (100% de solvente A durante os primeiros 10 minutos seguido por um gradiente de 98% de solvente A, v /v, em 15 min) para permitir a remoção de quaisquer sais residuais. Após o período de lavagem, o gradiente foi aumentado para 35% de B em 125 minutos, seguido por um aumento para 90% de B em 140 minutos e mantida durante 9 minutos, antes de regressar às condições iniciais. Tandem espectros foram adquiridos utilizando um modo de digitalização dependente dos dados em que se completa MS varredura (m /z 300-2000) foi adquirida na Orbitrap com uma resolução de 60.000. O tempo máximo de injecção foi de 1 s. Dados dependentes scans MS /MS foram adquiridos para os cinco mais intensas íons de a verificação completa usando uma largura de isolamento de 2 m /z, um tempo de ativação de 30 ms, uma energia de colisão normalizado 30%, e um tempo máximo de injecção de 150 ms .

Para melhorar a detecção de fosfopeptídeos, um algoritmo dependentes de dados adicionais no software Xcalibur foi habilitado em que a presença de uma perda neutra de fosfato predominante (97,97, 48,99 e 32,66 m /unidades z) provocaria o aquisição de um MS /MS /MS [32]. Para permitir a recolha de espectros MS /MS a partir de péptidos menor abundância, ex iões alvo seleccionados para o MS /MS foram excluídos dinamicamente com um comprimento lista de 150 iões e um tempo de 60 s. “Seleção precursor monoisotópico” foi ativado e estados de carga de 1+ e 4+ foram tidos em consideração para MS /MS. O instrumento foi operado no modo de visualização para permitir a recolha simultânea de espectros MS /MS durante a verificação Orbitrap. Condições gerais de espectrometria de massa eram como se segue: voltagem de pulverização, 2,2 kV; sem bainha e fluxo de gás auxiliar; ião temperatura do tubo de transferência, 200 ° C; e lente do tubo de tensão de 80 V.

pesquisa de banco de dados, filtragem e falso-descoberta determinação da taxa de

Métodos foram semelhantes às estratégias de banco de dados em busca descrito anteriormente [28], com pequenas modificações. arquivos RAW Thermo foram transformados em arquivos DTA usando o algoritmo ScanSifter (Universidade Vanderbilt), em seguida, procurou por TurboSEQUEST v.27 (rev. 12) algoritmo (Thermo Electron) contra o rato subconjunto /humano de banco de dados UniRef100, que foi revertida para calcular o taxa de falso-descoberta. As pesquisas foram realizadas as seguintes modificações permitindo diferenciais: 57 em cisteína (por carboxyimidomethylation de iodoacetamida), 16 em metionina (oxidação), e 80 em Ser, Thr, ou Tyr (fosforilação). A MS /MS /MS espectros também foram pesquisados ​​para um deslocamento de massa -18 em Ser, Thr, Tyr ou para ter em conta a perda de água, que resulta da perda neutra de ácido fosfórico. tolerâncias péptido e iões fragmento foram ajustados para 2,5 Da e 1,0 Da, respectivamente.

taxa de falso-descoberta foi então estimada a partir de jogos de péptidos com as sequências inversas multiplicado por dois e dividido pelo número total de visitas peptídicas. Peptídeos obtidos a partir de algoritmos de pesquisa de banco de dados com taxa de falso-discovery 5% foram posteriormente filtrados por três etapas adicionais. Em primeiro lugar, o limiar de pontuação foi criado dependendo da categoria do peptídeo. Para péptidos de carga 1, os péptidos foram escolhidos com xcorr maior do que ou igual a 1, RSP inferior ou igual a 5, e Sp maior do que ou igual a 350; para cobrar 2 peptídeos, limite foi fixado em xcorr 1,8, RSP 5 e Sp 350; Para a carga 3 péptidos, o limiar foi estabelecido em 2,5 xcorr, Rsp 5, Sp e 350. Em segundo lugar, apenas os péptidos com pelo menos uma de tirosina e um fosforilação foram retidos. Finalmente, dos hits de péptidos restantes, apenas a pTyr contendo péptidos com pelo menos um dos três critérios adicionais foram retidos: (1) pelo menos dois espectros correspondente tinha valores xcorr acima limiar alto (3.3 para a carga de 3, 2.2 para a carga de dois , e 1,5 para a carga de 1), (2) o local pTyr foi independentemente identificados a partir de duas ou mais distintas péptidos, ou (3) o local pTyr havia sido identificado, independentemente, em outro lugar e incluído no online resource PhosphoSite de

in vivo sítios de fosforilação

, versão 1.5 (https://www.phosphosite.org), mantido pela Cell Signaling Technology, Inc.

Todos os dados de espectrometria de massa originais dos experimentos tumorais xenograph foi feito publicamente disponível através o Coro on-line recurso de dados de espectrometria de massa (https://chorusproject.org/). Com uma conta de usuário Chorus, qualquer subconjunto destes dados brutos pode ser baixado ou visualizado online. Em alternativa, estes dados podem ser baixados diretamente como um arquivo de 2,8 GB, sem registrar em:. Https://chorusproject.org/anonymous/download/experiment/-2997969850554343767)

Os anticorpos e immunoblotting

amostras de células foram recolhidos após 24 h de exposição dasatinib. amostras de tumor de xenoenxerto foram colhidas 4 h ou 24 h após a administração final de dasatinib. Os tumores foram congelados em azoto líquido, em seguida, homogeneizou-se e diluiu-se para 1 mg /mL em tampão de lise. Entre 20 e 40 ug de proteína total a partir de cada amostra foi carregada em 7,5-12% de gel SDS-PAGE e resolvido por electroforese antes da transferência para membranas de PVDF (PerkinElmer). As membranas foram bloqueadas durante a noite a 4 ° C em Tris-solução salina tamponada com 0,1% de Tween-20 (TBST) contendo 5% w /v de leite em pó seco sem gordura. Posteriormente, as membranas foram coradas imunologicamente com anticorpos para p-Src Y416 (Cell Signaling # 6943S), o total de Src (Cell Signaling # 2107), p-PKCδ Y313 (Cell Signaling # 2055S), o total de PKC (Cell Signaling # 2058), p RPTP Y789 (Cell Signaling # 4481S), RPTP total (Upstate # 07-472), β-actina (Cell Signaling # 4967) e β-tubulina (Cell Signaling # 2128). Apalpamento ocorreu durante 1 h à temperatura ambiente com anticorpos diluídos, como sugerido pelos fornecedores em TBST com albumina de soro bovino 3% (BSA), seguido por incubação durante 1 h à temperatura ambiente com o anticorpo secundário de rábano silvestre conjugado com peroxidase de espécies apropriadas (Jackson ImmunoReserach) diluído a 1: 5000 em TBST contendo 3% de BSA. Ocidental relâmpago

TM Plus-ECL (PerkinElmer) substrato foi utilizado para a detecção em um Xenogen IVIS 200. A densitometria foi realizada utilizando Imagem Vivendo 3,2 software (Caliper).

Spheroid análise de crescimento

imagens microscópicas de série de esferóides de células a partir de 0, 24, 48 e 72 h após o tratamento dasatinib foram importados para o pacote de software ImageJ (NIH). As imagens foram automaticamente convertidos em binário e buracos na imagem binária foram fechadas usando a função Buracos preencher ImageJ. A ferramenta Varinha Seleção foi usado para segmentar todos os pixels conectados a partir do esferóide, eo número de pixels neste domínio foi registrado. área total de cada esferóide foi normalizada para o ponto de tempo de 24 h.

A imuno-histoquímica

Imediatamente após o sacrifício, as amostras de tumor de tumor excisado foram fixados em formalina a 10% durante 24 h e transferida para 70% etanol. As amostras foram depois processadas para inclusão em parafina e seccionados antes da imunocoloração. Seguindo o seccionamento, as amostras de tecido foram desparafinizadas, re-hidratadas, e o passo de recuperação de antigénio foi realizado utilizando um tampão citrato (pH 6,0) solução aplicada durante 20 minutos a 105 ° C, seguido por 10 minutos à temperatura ambiente. As amostras foram então tratadas com

20

2 para eliminar a actividade da peroxidase endógena 3% h. Os cortes foram subsequentemente bloqueados com um reagente de bloqueio de proteína livre de soro durante 20 minutos. As secções em série foram incubados durante a noite com uma diluição 1: 100 de anticorpo (Cell Signaling # 2055S) p-PKCδ pY313 ou p-Ship2 Y986 /987 (Cell Signaling # 2008). Detecção de anticorpos primários utilizados sistemas Envision + (Dako) com um polímero marcado com peroxidase de rábano silvestre (30 minutos de incubação), seguido pela adição de substrato DAB (5 minutos de incubação). amostras coradas foram fotografadas em ampliação de 40x e analisadas quanto à expressão de marcadores histológicos.

Resultados

O proteoma fosfotirosina de 116 HCT-células humanas cultivadas colorretais

Nós já realizou uma análise abrangente do proteoma fosfotirosina de Src- fibroblastos de rato transformada

em vitro

[28]. O objetivo deste estudo foi realizar uma análise semelhante para caracterizar o proteoma pY da linha de células CRC humana e, em seguida, estender a abordagem de pesquisa para potenciais biomarcadores PY de dasatinib-responsividade em tumores de xenoenxerto HCT-116.

Inicialmente, procurou-se caracterizar o proteoma pY de células cultivadas HCT-116, na ausência de tratamento com dasatinib. A partir de 15 corridas independentes LC-MS /MS (5 réplicas biológicas, cada uma suportada por 3 replicados técnicas), foram identificados péptidos 249 PY distintas. Esses peptídeos representam 162 locais PY distintos sobre 116 proteínas diferentes. Critérios para a retenção de peptídeo incluído valor xcorr de alto limiar e identificação em Uma réplica biológica. Tabela S1 mostra os péptidos retidos agrupados de acordo com uma classificação funcional, pi posição ácido amino local, do número de isolamentos independentes (contagens espectrais), e valores mais altos xcorr. A lista de peptídeos PY acumulados e dados de contagem espectral fornece uma visão global do PY actividades de sinalização de células HCT-116 sob as condições de cultura de células monocamada. Cerca de metade dos sítios listados representam PY proteína-quinases (44/162) e outras proteínas de sinalização (38/162), enquanto que outros 25% dos sítios estão em proteínas associadas com a adesão celular e o citoesqueleto de actina (40/162) (Figura 1A).

Em células cultivadas HCT-116, foram identificados 162 sites de Py, que representam 116 proteínas distintas (A). Proteínas classificados nas categorias gerais de Adesão e citoesqueleto, proteínas quinases, e Outras conta Sinalização para aproximadamente três quartos do total. Dos locais PY sobre cinases proteicas, a grande maioria são de tirosina-quinases convencionais e “Grupo CMGC” proteína-quinases, que inclui as CDKs, ERK /MAPK, a GSK-3, e outras quinases de especificidade dupla. Ver Tabela 1 e Tabela 2 para obter uma lista dos sites mais frequentemente identificadas por contagem espectral em células HCT-116. Todos os locais 162 estão apresentados na Tabela S1, juntamente com a informação de chave, incluindo o número de entrada UniProt, fosfopéptidos detectados na análise por LC-MS /MS, e o total de IDs espectrais. Em tumores de xenoenxerto HCT-116, foram identificados 71 locais que Py representa 58 proteínas distintas (B). critérios de retenção para os locais eram 7 ou mais IDs espectrais em tumores e de detecção também no HCT-116 células em cultura. Os 71 PY sítios representam 58 proteínas distintas. locais de tumores que satisfazem os critérios de retenção têm uma distribuição funcional muito semelhante ao de sítios identificados em células em cultura. Veja a Tabela 3 e Tabela 4 para obter uma lista dos melhores sites por contagem espectral no HCT-116 xenotransplantes. Todos os 71 sites são apresentados na Tabela S2, juntamente com informações-chave, incluindo o número UniProt ID, fosfopeptídeos detectadas na análise LC-MS /MS, e o número de IDs espectrais de

contra

tumores tratados com dasatinib não tratados.

Entre os locais PY proteína quinase, foram identificados 24 locais em 14 diferentes tirosina quinases e 15 sites em 14 diferentes quinases CMGC. quinases CMGC (um grupo de classificação amplo que inclui CDKs, ERK /MAPK, GSK-3, e as famílias de quinases dual-especificidade) foram destaque entre os sites mais frequentemente identificados HCT-116 (Tabela 1). CDK1 pY15 foi o local mais detectada com 146 contagens espectrais. Um site alça de ativação domínio quinase (pY1234) sobre o TEM, crescimento de hepatócitos receptor tirosina quinase fator, foi o segundo local mais frequentemente identificados no perfil de células cultivadas HCT-116 com 74 contagens espectrais. Outros sites topo do ranking no quinases CMGC (incluindo PRP4, ERK2, DYRK1 e GSK-3) também residem no domínio quinase ativação laços onde fosforilação indica o estado activado. Nós identificamos um número de sites no HCT-116 células que não foram observados na nossa extensa análise prévia de MEFs [28], Tabela 2.

Protein

classe funcional

site

IDs

CDK1Protein quinase: CMGCY15146METProtein quinase: tirosina * Y123474PRP4Protein quinase: CMGC * Y84969CDCP1Adhesion: Cell /ECM Y70747PaxillinAdhesion: Cell /ECMY11841ERK2Protein quinase: CMGC * Y18736SHBOther SignalingY24632Annexin A2Other SignalingY2429DYRK1AProtein quinase: CMGCY32126SHBOther SignalingY26824LAP2 /ErbinOther SignalingY110424Catenin δ-1Adhesion: Cell /CellY22824GSK-3Protein quinase: CMGC * Y27922Table 1. Todos os sites fosfotirosina mais frequentemente identificado em 116 HCT-células cultivadas

* site em proteína quinase domínio loop Das abreviações:. CDCP1, CUB domínio contendo proteína 1; CDK1, proteína de controlo da divisão celular 2 homólogo; DYRK1A, especificidade dupla fosforilação de tirosina-quinase regulada-1A; ERK2, Mitogen-activated protein quinase 1; A GSK-3, glicogénio-sintase-quinase-3 (alfa e beta); MET, receptor do fator de crescimento de hepatócitos; PRP4, serina /treonina-proteína-quinase homólogo PRP4; SHB, SH2 proteína adaptadora B. contendo domínio CSV Baixar CSV Protein

classe funcional

site

IDs

CDCP1Adhesion: Cell /ECMY70747DCBLD2MiscellaneousY75019PKCδProtein Kinase: AGCY31318FAT1Adhesion: Cell /CellY424416MST1R /RONProtein Kinase: tirosina * Y123815Annexin A2Other SignalingY3014DCBLD2MiscellaneousY73214TYK2Protein kinase: TyrosineY29213FYNProtein kinase: tirosina ** Y21311LYNProtein kinase: tirosina ** Y19311Table 2. sites de fosfotirosina não encontrada na análise anterior extenso de MEFs cultivadas

(28)

* site em proteína quinase alça de ativação de domínio ** site em Src-quinase família SH2 domainAbbreviations: CDCP1, CUB domínio contendo proteína 1; DCBLD2, Discoidin, CUB e LCCL proteína 2 contendo domínio; FAT1, protocadherin Gordura 1; Fyn, tirosina-cinase de proteína Fyn; LYN, tirosina-cinase de proteína Lyn; MST1R /RON; Macrófagos estimulante do receptor de proteína; PKCδ, proteína quinase tipo C delta; TYK2, não-receptor de tirosina-cinase de proteína TYK2. CSV Baixar CSV

O proteoma fosfotirosina de HCT-116 tumores de xenoenxerto

Após ter obtido o perfil pY de HCT-116 células em cultura, a estratégia proteômica pY foi então utilizado para identificar locais PY HCT-116 que são proeminente em tumores de xenoenxerto e que tem potencial para servir como biomarcadores para resposta dasatinib. tumores de xenoenxerto HCT-116 subcutâneos foram estabelecidos em ratinhos nus atímicos e péptidos trípticos PY-enriquecidos foram preparados a partir de cada um dos 3 tumores de ambos os ratinhos tratados com veículo e de ratinhos tratados com 4 horas antes de 60 mg /kg de dasatinib. Cada preparação de péptido foi analisada por meio de três repetições de LC-MS /MS é executado para obter os perfis PY tumorais. A partir desta análise, 71 locais Py, que representam 58 proteínas diferentes, foram reconhecidos como sendo proeminente nos tumores de xenoenxerto, bem como a ser detectada nas células cultivadas (Tabela S2). Semelhante ao perfil de células de cultura, a maior parte destes locais foram em proteínas sinalizadoras (incluindo muitas proteínas quinases) e /proteínas associadas ao citoesqueleto de adesão (Figura 1B). As tirosina-quinases e proteína-quinases CMGC foram novamente proeminente no perfil do tumor. Sites sobre CMGC quinases dominaram a lista dos locais de tumor mais frequentemente identificados incluindo CDK1 Tyr15, e os sites de loop de ativação na p38 MAPK, PRP4, ERK1, ERK2 e GSK-3 (Tabela 3).

Protein Classe

Funcional

site

IDs (não tratada, 4h DAS)

CDCP1Adhesion: Cell /ECM Y70790, 14CDK1Protein Kinase: CMGCY1585, 80PKCδProtein Kinase: AGCY31372, 10p38α MAPKProtein Kinase: CMGC * Y18259 , 35PRP4Protein Cinase: CMGC * Y84949, 45ERK2Protein Cinase: CMGC * Y18735, 31ERK1Protein Cinase: CMGC * Y20430, 27RPTPαOther SignalingY79827, 1β-actinCytoskeletonY5522, 24GSK 3Protein-quinase: CMGC * Y27919, 22Annexin A2Other SignalingY3019, 5Histone H4MiscellaneousY8919, 17Table 3. sítios de fosfotirosina mais frequentemente identificado em tumores não tratados xenoenxerto HCT-116: comparação com os animais tratados com dasatinib

* site na alça de ativação da proteína quinase domínio Abreviaturas:. CDCP1; proteína contendo o domínio CUB 1-; CDK1, proteína de controlo da divisão celular 2 homólogo; ERK1, Mitogen-activated protein quinase 3; ERK2, Mitogen-activated protein quinase 1; A GSK-3, glicogénio-sintase-quinase-3 (alfa e beta); p38a MAPK, Mitogen-activated protein quinase 14; PKCδ, proteína quinase tipo C delta; PRP4, serina /treonina-proteína-quinase homólogo PRP4; RPTPα, o receptor de tipo de tirosina-fosfatase de proteína alfa. CSV Baixar CSV

CDCP1 pY707 (90 contagens espectrais), PKCδ pY313 (72 contagens espectrais), e PKCδ pY334 (14 acusações espectrais) estavam entre os locais mais frequentemente identificadas em tumores de xenoenxerto não tratados. tratamento com dasatinib reduziu consideravelmente a frequência de identificação de todos os três locais (Tabela 3, Tabela 4), de acordo com suas metas sendo de quinases Src-família. Em contraste, os sites na quinases CMGC (não considerados para ser fosforilada por quinases sensível ao dasatinib) foram identificados com frequências semelhantes nos tumores não tratados e tratados com dasatinib. Outros locais de dasatinib-responsivo aparentes entre os mais frequentemente identificado em tumores tratados com veículo incluídos no pY798 RPTPα pY30 e em anexina A2 (Tabela 3). RPTPαpY798 foi identificado em 27 de espectros a partir de tumores não tratados, mas apenas uma vez, em amostras tratadas com dasatinib.

Protein

classe funcional

site

IDs (não tratados, 4h DAS)

Raig-1Outros SignalingY34715, 1PKCδProtein Quinase: AGCY33414, 0SHC1Other SignalingY42713, 0α-enolaseMetabolic EnzymeY4413, 3SHIP2Other SignalingY98611, 0Table 4. outros locais de relevo dasatinibe-responsive fosfotirosina identificados em não tratados HCT-116 tumores de xenoenxerto: comparação com os animais tratados com dasatinib

Abreviaturas: PKCδ, tipo de proteína quinase C delta;. PRP4, serina /treonina-proteína-quinase homólogo PRP4; Raig-1, retinóico proteína induzida por ácido 3; protein 1 SHC1, SHC-transformação; Ship2, fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato 5-fosfatase 2. CSV Baixar CSV

Immunoblotting valida a capacidade de resposta dasatinib de PKCδ pY313 e RPTPα pY798 locais no HCT-116 xenotransplante de tumores

da dasatinib mais proeminente Sites PY -responsive identificados a partir da análise phosphoproteomic de HCT-116 tumores de xenoenxerto (Tabela 3, Tabela 4), anticorpos específicos para fosfo estão comercialmente disponíveis para PKCδ pY313, Ship2 pY986 /987 e RPTPα pY798. Estes anticorpos foram utilizados para validar o dasatinib responsividade destes locais relativos à inibição de Src (determinado utilizando um anticorpo contra o sítio fosfoespec�ico autofosforilação do Src pY416). Para os locais tanto o PKCδ pY313 e RPTPα pY798, imunotransferência com anticorpos específicos para a fosfo indicou uma redução marcante da fosforilação em 4 h tumores tratados com dasatinib concomitantemente com a inibição de Src (Figura 2A). O estado de fosforilação destes resíduos voltou aos níveis da linha de base cerca de 24 horas pós-tratamento, o que sugere a durabilidade de inibição de Src neste modelo foi transitório com uma única administração.

Immonoblot análise de PKCδ pY313 e RPTPα pY798 em tumores de xenoenxerto em relação a Src pY416 após uma única dose farmacológica (A) ou 5 doses diárias de dasatinib (B). tecidos de xenoenxertos foram avaliados 4 h e 24 h após a exposição ao dasatinib. Ambos PKCδ pY313 e RPTPα pY798 correlacionar com a inibição de Src em xenoenxertos HCT-116. Além de uma dose única, no estado estacionário regimes de tratamento (B) resultou numa inibição de Src prolongada como medida 24 h após a exposição ao dasatinib e correlacionada com a diminuição dos níveis de PKCδ pY313 e RPTPα pY798.

Para avaliar o efeito da duração do tratamento dasatinib sobre a durabilidade de inibição de Src, HCT-116 tumores tratados com 5 doses diárias de dasatinib foram avaliados por análise de western blot para determinar a resposta dos resíduos identificados sob a administração do fármaco em estado estacionário.