Abstract

terapias-alvo têm sido usados ​​para combater diversos tipos de tumores; no entanto, poucos têm efetivamente melhorou a sobrevida global em mulheres com câncer epitelial de ovário, implorando para uma melhor compreensão desta doença mortal e identificação de motoristas essenciais da tumorigênese que podem ser direcionados de forma eficaz. Por isso, foi utilizada uma abordagem de triagem de perda de função para ajudar a identificar vulnerabilidades moleculares que podem representar pontos-chave de intervenção terapêutica. Utilizou-se uma tela de letalidade de alto rendimento utilizando uma biblioteca imparcial 24088 siRNA alvejando mais de 6000 genes druggable e estudados os seus efeitos sobre o crescimento e /ou a sobrevivência das linhas de células epiteliais do cancro do ovário (EOC). O topo 300 “sucessos” que afectam a viabilidade das células A1847 foram novamente testados em todas as linhas celulares EOC adicionais e linhas de células epiteliais do ovário não tumorigénica, humanas imortalizadas. Cinquenta e três genes candidatos foram encontrados para exibir efeitos em todas as linhas de células tumorigénicas testados. validação extensa destes sucessos refinado a lista de quatro candidatos de alta qualidade (

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

, e

PTN

). Estudos mecanísticos mostram que o silenciamento de três genes leva ao aumento da apoptose, enquanto que

HSPA5

silenciamento parece alterar o crescimento celular através da paragem do ciclo celular G1. Além disso, dois estudos de expressão gênica independentes mostram que

NDC80

,

NUF2

e

PTN

foram significativamente aberrante sobre-expressos em adenocarcinomas serosa. No geral, nossos resultados genómica funcional integrado com a genômica dados fornecem uma avenida imparcial importante para a identificação de alvos terapêuticos potenciais para a descoberta de medicamentos, que é uma necessidade clínica urgente e não atendida por câncer de ovário

Citation:. Sethi G, Pathak HB, Zhang H, Y Zhou, Einarson MB, Vathipadiekal V, et al. (2012) An RNA Interferência Letalidade tela do druggable Genoma Humano para identificar as vulnerabilidades moleculares no epitélio cancro do ovário. PLoS ONE 7 (10): e47086. doi: 10.1371 /journal.pone.0047086

editor: Alexander James Roy Bishop, Universidade do Texas Health Science Center em San Antonio, Estados Unidos da América

Recebido: 13 de junho de 2012; Aceito: 07 de setembro de 2012; Publicação: 09 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Sethi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado em parte por uma concessão do projeto do programa do Fundo Ovarian Cancer Research (https://www.ocrf.org) e uma subvenção do NCI (CA140323) para AKG. Os autores reconhecem o apoio da Universidade de Kansas Cancer Center e do Programa Scholar eminente autoridade Kansas Bioscience. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução câncer de ovário

epitelial é o segundo câncer ginecológico mais comum, e um dos mais mortais, entre as mulheres, com uma estimativa de 22,280 novos casos e 15.500 mortes por 2012. [1] Entre os diferentes tipos de câncer epitelial de ovário, que inclui, de células claras mucinoso e seroso do endométrio [2], [3], a maioria das mortes de cancro do ovário ocorrer em doentes com estádio avançado, cancro do ovário seroso de alto grau. [4] Como tal, existe uma necessidade urgente de novas abordagens terapêuticas para combater esta doença mortal.

O desenvolvimento de novas terapias, especialmente na época de tratamentos direcionados e medicina personalizada, é normalmente acionada por entender o subjacente biologia, bioquímica e biologia molecular de células de tumor e as suas vizinhas de segmentação microambientes alterações genéticas. [5] Este é um tema comum na descoberta de drogas e pode fornecer especificidade, mas geralmente não podem oferecer abrangência na segmentação. As células cancerosas podem evoluir que não têm as alterações genéticas alvo ou que são resistentes e podem causar doença progressiva. [5] Portanto, é essencial para expandir o nosso armamento de terapias, mas mais importante o nosso conceito de alvos importantes de drogas. A natureza evolutiva do câncer implica, ao contrário da sabedoria convencional, que as características essenciais de qualquer terapêutica para a cura ou controle de câncer consistente deve ser independente das vias particulares de evolução das células tumorais, e independente de quaisquer alterações genéticas ou epigenéticas particulares. Embora a complexidade genética e epigenética do cancro é quase ilimitada, a evolução das células tumorais é limitado. [6], [7] A célula maligna resultará, se e somente se, as alterações causar maquinaria celular normal, para levar a cabo os processos de proliferação e invasão.

atuais esforços de descoberta de drogas tendem a se concentrar em comumente mutado vias de transdução de sinal, por exemplo, uma série de receptores de factores de crescimento e moduladores de jusante (fosfatases e cinases) que trabalham em conjunto para promover o crescimento, mas não são a maquinaria central. Portanto, foi realizada não enviesada de alto rendimento (HTS telas letalidade) de pequenos RNAs interferentes (siRNAs) para identificar genes que são essenciais para o crescimento de células de tumor de ovário e de sobrevivência. Os top hits foram amplamente validado e seu valor clínico avaliado. No geral, achamos

NDC80

,

NUF2

e

PTN

vulnerabilidades moleculares como importantes, que representam alvos terapêuticos potencialmente importantes no câncer de ovário.

Resultados

HTS do Genoma druggable

a tela de ARNi de alto rendimento primária foi realizada (como ilustrado na Figura S1A) usando o druggable Genoma Humano biblioteca (Dharmacon) (Tabela S1) que consiste de 24,088 siRNAs segmentação 6.022 genes utilizando células A1847, uma linha de células epiteliais carcinoma do ovário (EOC), que consistentemente produziram dados de transfecção reprodutíveis em condições HTS. poços de referência internos de controlo positivas e negativas foram incluídos em cada placa para permitir o cálculo da eficiência de transfecção (ver Informações Suplementares S1 para obter detalhes adicionais). As células A1847 foram transfectadas utilizando condições HTS como descrito na secção Materiais e Métodos. As pontuações normalizadas de viabilidade (definidos como a amostra (intensidade de fluorescência

) /(mediana intensidade de fluorescência

referência)) obtidos através das HTS exibida uma distribuição de Gauss (Figura S1B). Após a análise de dados estatísticos (ver Informações Suplementares S1), foram selecionados um total de 300 genes que representam ~ 5% dos genes alvejados por esta biblioteca para inclusão na próxima rodada de triagem.

HTS de um painel de EOC linhas de células usando um subconjunto do genoma druggable

em seguida, determinou-se que dos 300 genes identificados como remate do ecrã primário afectada mutuamente o crescimento e sobrevivência celular através de múltiplas linhas de células EOC usando uma biblioteca de siRNA independente (Tabela S2). Esta nova biblioteca orientada foi projetado usando um inteiramente novo conjunto de quatro sequências de siRNA segmentação cada gene, a fim de minimizar os potenciais falsos positivos a partir do ecrã principal, devido aos efeitos fora do alvo. Esta estratégia de usar um conjunto diferente de piscinas siRNA para as telas secundárias tem sido adotada como um passo revalidação em si. [8] condições de transfecção para sete linhas celulares adicionais ovarianos tumorigênicos (A2780, CP70, C30, OVCAR5, OVCAR8, SKOV3 e UPN275) foram então optimizados para HTS (Tabela S3). Estes sete novas linhas celulares EOC e a linha de células A1847 foram então sujeitas a HTS que utilizam a biblioteca subconjunto segmentação dos 300 genes. Uma pontuação viabilidade foi derivado para todas as 300 piscinas siRNA em cada linha celular (mostrado graficamente na Figura 1A), que variaram entre 0,09-1,20 as linhas celulares. “Hits” para cada uma das linhas de células oito foram selecionados com base em ambos significância estatística (taxa de descoberta de falsas (FDR) 0,05) e significado biológico (pontuação viabilidade 0,85) (ver Informação Suplementar S1 para obter detalhes adicionais). Um mapa de calor através das visitas de cada linha celular EOC gerada utilizando MultiExperiment Visualizador [9], [10] e o ponto de intersecção das visitas de entre as linhas de células são mostradas esquematicamente na Figura 2A. Um total de 53 sucessos foram considerados significativos em todas as oito linhas celulares EOC (Figura 2A e Tabela S4). O coeficiente médio de correlação (r) para as repetições técnicas em todas as linhas celulares foi de 0,91 ± 0,03 (Figura S2A).

telas em um painel de linhas celulares EOC e Hio. Oito linhas de células de A. EOC foram transfectadas com ARNsi inversa de segmentação 300 genes identificados a partir do rastreio primário da linha celular A1847 utilizando parâmetros optimizados de transfecção para cada linha celular (ver Tabela S3). Cada círculo representa uma pontuação viabilidade média de repetições técnicas seguintes silenciamento de um gene particular. A linha pontilhada cinza representa o valor de corte para a pontuação viabilidade (0,85) para selecionar hits. linhas de células B. Três Hio foram transfectadas usando parâmetros otimizados para cada (ver Tabela S3).

A. Uma representação mapa de calor dos escores de viabilidade para oito EOC e três linhas de células HIO obtidos a partir de telas secundárias da biblioteca siRNA segmentação 300 genes. Todos os valores de pontuação de viabilidade variar entre 0,12 e 1,53. Tons de verde representam viabilidade ( 0,80) reduzido, tons de vermelho representa um aumento na viabilidade ( 0,80), eo preto representa uma pontuação de viabilidade de 0,80. O mapa de calor foi gerado usando MultiExperiment Viewer. diagramas florais no show de amarelo e azul o número de acessos em todo quer a oito EOC ou três linhas celulares Hio, respectivamente, e a intersecção dos hits dentro de cada grupo. B. Um diagrama de Venn mostra o número de acessos em comum entre o Hios e EOCs eo número atinge exclusivo para cada grupo.

O sistema de classificação biológica PANTHER [11] mostrou que “os processos metabólicos” foi a maior categoria (~43%) para que estes 53 genes pertencia (Figura S3A). Especificamente, quando a caracterização funcional destes genes foi realizada utilizando o software Engenho Pathway Analysis (IPA), mostrou-se que os 53 golpes foram enriquecidas para genes relacionados com a síntese de proteínas que envolvem proteínas ribossomais e factores de alongamento (Figura S3B). Relatórios recentes forneceram provas de que para além do envolvimento da síntese de proteínas, proteínas ribossomais e factores de alongamento tem um papel na regulação do ciclo celular e na sobrevivência. [12], [13], [14], [15] Medicamentos visando componentes moleculares diferentes envolvidas na maquinaria de síntese de proteínas já estão em ensaios clínicos para vários tipos de tumores, incluindo da mama, do cólon, e cancros colorrectais [16], [17], [18], suportando o potencial de translação dos nossos visitas. Caracterização de rede utilizando o software IPA mostrou que os genes na rede com a mais elevada pontuação exibiu os seus efeitos a jusante através de, ERK1 /2 e AKT, genes essenciais para a sobrevivência que têm sido implicados como mediadores das principais vias oncogénicas em cancro do ovário (Figura S3C) [19 ], [20], [21], [22].

HTS de Non-tumorigênicos Hio Lines

em seguida, determinou-se que dos hits teve o maior efeito sobre as linhas de células EOC e pouco ou nenhum efeito sobre o ser humano não-tumorigénico linhas celulares imortalizadas superfície epitelial do ovário (HIO). Nós, portanto, exibido os 53 acessos para efeitos sobre a viabilidade das três linhas celulares Hio (HIO80, HIO120 e HIO117). Embora estávamos interessados ​​na triagem apenas os 53 hits, a fim de manter o mesmo formato de triagem e minimizar quaisquer diferenças técnicas em como as telas de siRNA foram realizadas para as linhas de células Hio, mais uma vez utilizado o costume biblioteca siRNA visando todos os 300 genes. A pontuação de viabilidade foi obtido de acordo com o silenciamento de cada gene (Figura 1B). O coeficiente médio de correlação entre repetições técnicas para as três linhas de células de hio (Figura S2B, R média = 0,90 ± 0,03) foi semelhante ao das linhas de células de AOE.

batidas para as linhas celulares foram seleccionadas como Hio descrito acima (pontuação viabilidade normalizada 0,85 e FDR 5%). Um total de 74 batidas foram identificados comum a todas as três linhas de células de hio (Figura 2A). Um diagrama de Venn mostra a interseção dos hits entre o EOC e as linhas de células Hio na figura 2B. Quarenta e sete acertos foram em comum entre os dois grupos. No entanto, havia seis acessos únicos para as linhas de células de EOC (genes que afectaram a viabilidade de todas as oito linhas de células de EOC mas não todas as três linhas de células de Hio) que seleccionado para posterior validação. Nós também selecionou um gene adicional,

NUF2

, para estudos de validação.

NUF2

, embora não uma batida única para as linhas de células EOC, apresentada a pontuação mais baixa taxa de viabilidade, definido como a razão da viabilidade média normalizada das linhas celulares EOC para a viabilidade média normalizada das linhas celulares Hio (Tabela S4). Estes sete genes (

BCAR3

,

HSPA5

,

NAMPT

,

NDC80

,

NUF2

,

PTN

e,

RPS19

) foram posteriormente analisadas para os efeitos potenciais fora do alvo.

Deconvolution de siRNA Pools

para excluir efeitos fora do alvo, nós individualmente avaliou o quatro siRNAs das piscinas siRNA utilizados nas telas secundárias dirigidas às sete genes. Os siRNAs 28 individuais na tela de desconvolução (Tabela S5) foram avaliados no painel de linhas celulares de AOE. A fim de aceitar qualquer um dos sete genes como possuindo, efeitos válidos no-alvo sobre a viabilidade de linhagens de células EOC, se necessário que pelo menos dois dos quatro siRNAs individuais de segmentação cada gene resultou numa pontuação viabilidade de 0,85 ou menos com um FDR de menos do que 5% em todos os oito das linhas celulares de AOE. [23], [24] Com base nestes critérios rigorosos, quatro genes,

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

, e

PTN

, foram considerado no alvo, as batidas validados (Figura 3A e Tabela 1). Em seguida, nós reunidas as duas espécies mais eficazes siRNA (destacada em verde, Tabela S5) visando cada um dos quatro genes e quantificado o nível de redução da viabilidade celular para cada linha de células. Estas piscinas siRNA óptimas resultou em redução superior a 30% na viabilidade das células através de uma maioria das linhas celulares de EOC (Figura 3B).

. Os sete visitas seleccionadas para estudos posteriores foram validados através da realização de telas de desconvolução onde siRNAs individuais que foram inicialmente uma parte de uma piscina de quatro ARNsi nas telas secundárias foram avaliadas quanto aos seus efeitos sobre a viabilidade celular. Para cada hit que está sendo validado, as pontuações médias normalizadas de viabilidade (± SD) após o silenciamento de genes utilizando cada uma das quatro espécies de siRNAs avaliados nas oito linhas celulares EOC são mostrados. Foram considerados sucessos no-alvo se contagens de viabilidade de menos do que 0,85 foram observados para todas as oito linhas de células de EOC em pelo menos duas espécies de ARNip independentes um gene alvo. Os gráficos de barras representam as oito linhas celulares EOC, na seguinte ordem: A1847, A2780, C30, CP70, OVCAR5, OVCAR8, SKOV3 e UPN275. B. Os dois siRNAs mais eficazes que visem cada gene foram reunidas (12,5 nM cada espécie siRNA) eo efeito sobre a viabilidade celular foi quantificada. As barras representam os oito linhas de células de AOE como descrito no Painel AC qRT-PCR foi realizada em todas as oito linhas de células de EOC seguintes silenciamento de genes durante 72 h utilizando um conjunto dos dois siRNAs mais eficazes identificadas a partir dos estudos de desconvolução a partir do painel A para os quatro hits que foram determinados para estar no alvo. O asterisco representa

PTN

níveis de ARNm que estão abaixo do nível de detecção após o tratamento de siARN (isto é, completa knockdown de ARNm). análise de mancha de D. Ocidental foi realizada seguindo o silenciamento de genes, quer para 72 h (

HSPA5

,

NDC80

, e

PTN

) ou 120 h (

NUF2

) para determinar o nível de knockdown ao nível da proteína em células A1847. borrões imuno foram quantificados utilizando software Alphaview, versão 3.3 (Biosciences celular).

Como uma verificação adicional sobre a capacidade de siRNAs para direcionar corretamente seus mRNAs, foi utilizada a piscina óptima dos dois siRNAs mais eficazes (Figura 3B) e realizada RT-PCR quantitativa para determinar o nível de ARNm de knockdown após transfecção dos siRNAs reunidas para cada linha celular (Figura 3C). níveis de RNA mensageiro de

HSPA5,

NDC80

,

NUF2

, e

PTN

em todas as oito linhas celulares EOC foram mostrados para ser reduzida por um média de 67%, 87%, 77%, e 96%, respectivamente. análise de Western blot após a transfecção de uma linha celular EOC, A1847, foi concluída como um meio adicional para demonstrar a especificidade das piscinas siRNA, avaliando os níveis celulares das respectivas proteínas para os mRNAs sendo alvejados. Todos os quatro piscinas siRNA regulada para baixo os níveis de proteína de seus respectivos alvos de mRNA por ~ 50% ou mais nesta linha celular (Figura 3D).

Efeitos sobre a apoptose e ciclo celular progressão

A nossa parâmetro de ponto final de viabilidade de células que foi utilizado para identificar as visitas nos estudos HTS fornece informação limitada sobre o mecanismo da diminuição da viabilidade celular /crescimento induzida por silenciamento do gene. Nós, portanto, investigou os efeitos funcionais de segmentação cada um dos quatro hits validados na progressão da apoptose e ciclo celular usando duas linhas de células EOC, A1847 e A2780. Nós transfectados nestas linhas celulares com um conjunto de duas sequências de siRNA mais eficazes (12,5 nM cada ARNsi, o mesmo pool de ARNsi utilizada para a RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) e transferências de Western análise) para cada um dos quatro hits validados (

HSPA5, NDC80, NUF2

e

PTN

) e mediu os efeitos na apoptose celular e progressão do ciclo 72 h após a transfecção em placas de 96 poços. Em células A2780, knockdown de todos os quatro genes resultou em um aumento de células apoptóticas tal como medida por coloração positiva de anexina V usando um citómetro de fluxo de goiaba em relação às células transfectadas com

GL2

-targeting ARNsi de controlo (Figura 4A). Em média, houve um aumento de 2,5 vezes nas células apoptóticas. No entanto, nestas células, não houve nenhum efeito significativo sobre o ciclo celular após knockdown destes quatro hits (Figura 4B).

células A1847 e A2780 foram transfectadas com

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

,

PTN

ou

GL2

siRNAs. Setenta e duas horas após a transfecção, as células foram colhidas e processadas para análise de apoptose ou a progressão do ciclo celular. A. C. A fracção de células apoptóticas foi medida por coloração de anexina V seguido por enumeração usando um citómetro de fluxo de goiaba (Millipore). A dobra-mudança de células apoptóticas é mostrado (média ± DP, n = 3). B D. A fracção de células em cada fase do ciclo celular foi medido por coloração com iodeto de propídio seguido por enumeração usando o instrumento de goiaba. O fold-change para cada fase do ciclo celular é mostrado (média ± SD, n = 3).

Nas células A1847, knockdown de três genes (

NDC80

,

NUF2

e

PTN) resultou num aumento de 1,7 vezes nas células apoptóticas em relação às células transfectadas com

GL2

-targeting ARNsi de controlo (Figura 4C). Knockdown de

HSPA5

não resultou em qualquer aumento significativo na apoptose (Figura 4C). No entanto, conseguimos observar que a sua knockdown deu origem a um aumento de 2 vezes na população de células na fase G1 do ciclo celular e uma diminuição de 2 vezes correspondente na fase G2 /M (Figura 4D). Knockdown de

NDC80

,

NUF2

, e

PTN

em células A1847 resultou num ligeiro aumento no número de células na fase S (Figura 4D). No entanto, este aumento foi, em média, menos de 1,5 vezes e não pareceu ser altamente estatisticamente significativa. Knockdown destes quatro genes não teve um efeito mensurável sobre a sobrevivência das células HIO80 não tumorigénicas (Figura S4).

Avaliação da Validated bate em amostras clínicas

adenocarcinoma seroso é o principal subtipo de câncer epitelial de ovário. A fim de avaliar o significado clínico potencial dos quatro hits validados, pesquisamos O Cancer Genome Atlas (TCGA) do banco de dados adenocarcinoma seroso do ovário. [25] Os dados de expressão de gene sobre as quatro hits validados de 494 adenocarcinomas serosos foram obtidos a partir do portal TCGA (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp). Expressão de

NDC80

,

NUF2

, e

PTN

é up-regulada por ≥1.5 vezes em 98%, 99% e 37% das amostras de tumor, respectivamente (Figura 5); No entanto, apenas 1% das amostras mostraram sobreexpressão ≥1.5 vezes para

HSPA5

com aproximadamente 87% das amostras que mostram a expressão reduzida em relação ao normal (Figura 5). Nenhum destes genes são mutados em mais do que 1% das amostras (dados não mostrados). Nós próxima analisados ​​variação do número de cópia (CNV) e metilação de DNA para

NDC80

,

NUF2

e

PTN

usando o banco de dados TCGA. análise CNV demonstraram baixo número de cópias nível de ganhos ( 1,2 vezes) em 12%, 39% e 36% das amostras para

NDC80, NUF2 e PTN,

respectivamente, e uma perda do número de cópias em 41% das amostras para o gene

HSPA5

. Houve uma correlação fraca, mas estatisticamente significativa entre a expressão do gene e do número de cópias para os três genes em toda 494 amostras (Figura S5A). Além disso, para estes três genes verificou-se que, em média, as amostras com o ganho de número de cópias exibiram um aumento de 1,6 vezes na expressão do gene, em comparação com amostras sem ganho de número de cópias (valor de p 0,0001, 0,0001, e 0,05 para

NDC80

,

NUF2

e

PTN,

respectivamente (Figura S5B) Analisou-se as alterações na metilação do DNA também foram associados com expressão aberrante As regiões promotoras.. de

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

e

PTN Quais são hypomethylated (β 0,25). em ≥94% das amostras tumorais no entanto, nós não encontrou qualquer correlação estatisticamente significativa entre a expressão e metilação do promotor para qualquer um desses genes no conjunto de dados TCGA (dados não mostrados).

os dados TCGA definidas em 494 adenocarcinomas seroso do ovário foi consultado para determinar os níveis de expressão de mRNA (log

2 (tumor rácio /normal)) de

NDC80

,

NUF2

,

PTN,

e

HSPA5

. Estes dados são como gráficos de barras com o cinza linhas tracejadas indicam a percentagem de amostras com 1,5 vezes, 3 vezes, 5 vezes e superexpressão de 10 vezes em comparação com amostras normais incomparáveis ​​no conjunto de dados TCGA.

Validação de relevância clínica em uma coorte independente

Para estabelecer ainda mais o potencial associação com patogênese da doença, examinamos a expressão dos quatro principais sucessos validados em um gene independente de perfis conjunto de dados de amostras de tumores ovarianos primários . Foram avaliados [26] perfis de amostras microdissecados, fase tardia, carcinomas ovarianos serosas alto grau (n = 53) e microdissecados humano do ovário epitelial superfície (mangueira) (n = 10) expressão do gene. Os níveis de expressão normalizadas para todas as amostras de tumor são mostradas na Figura 6A. Verificou-se que 48/53 (90%) das amostras de tumor foram sobre-expressam

NDC80

de 1,5 vezes ou mais. Da mesma forma, 53/53 amostras (100%) para

NUF2 Comprar e 24/53 amostras (42%) para

PTN

foram encontrados para ser sobre-expresso por ≥1.5 vezes. Estes dados correlacionam-se bem com os dados sobre TCGA expressão em amostras de tumor de ovário.

HSPA5

foi sobre-expresso em 8/53 (15%) das amostras. O aumento nos níveis médios de ARNm através das amostras tumorais em relação às amostras normais HOSE foi estatisticamente significativa para todos os quatro genes (p 0,005) (Figura 6B). Também avaliamos o valor prognóstico desses genes através da realização de análise de sobrevivência de Kaplan-Meier das medições de intensidade a partir dos dados de microarranjos dos quatro genes com os dados clínicos correspondentes de cada paciente. Análise de sobrevivência de Kaplan-Meier para

NUF2

sugerem que um elevado nível de expressão de mRNA foi relacionada com mau prognóstico nestes doentes (Figura S6A). Análise para os outros três genes não foi estatisticamente significativa. (dados não mostrados). Um valor prognóstico semelhante de

NUF2

níveis de mRNA foi encontrado a partir de análise de sobrevivência dos dados TCGA (Figura S6B).

A. São mostrados os níveis de expressão do gene de 53 adenocarcinomas serosos normalizados para a média níveis de expressão génica medidos em tecido normal do ovário (n = 10). B. São mostrados os níveis de expressão do gene médios ao longo dos adenocarcinomas serosa para

NDC80

,

NUF2, PTN

e

HSPA5.

Um t-teste bilateral indica que o aumento da expressão do gene em amostras de tumor é estatisticamente significativo em relação ao tecido normal. *** = P 0,0005; ** = P 0,005; * = P . 0,05

Discussão

As altas taxas de desgaste dos projectos de desenvolvimento de drogas para terapias específicas [27], exige a identificação e validação de novos alvos moleculares druggable, com o seu papel no câncer de ovário claramente definidos para minimizar o fracasso da droga durante o pipeline de desenvolvimento. Usando uma abordagem de triagem RNAi integrada para atingir mais de 6.000 genes druggable que identificamos 53 que foram necessários para o crescimento e sobrevivência através de um painel de linhas celulares EOC; sete delas eram predominantemente ativa em células tumorigénicas e foram considerados para estudos de deconvolução e validação adicionais. Quatro candidatos dos sete (

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

, e

PTN

) finalmente provou ser sucessos válidos para células Edc com efeitos mínimos sobre as células Hio não tumorigénicas.

os estudos de triagem de perda de função relatados neste trabalho nos forneceu um instantâneo genômica funcional de novas vulnerabilidades moleculares no câncer epitelial de ovário fora do reino da comumente alvo vias de sinalização molecular. Nós estudamos os quatro alvos validados (

HSPA5

,

NDC80

,

NUF2

e

PTN

), todas com um papel no crescimento ou sobrevivência de células EOC, usando ensaios baseados em células

in vitro

. Os resultados mostram que as células tumorigénicas ovarianos, em média, são comparativamente mais vulnerável aos alvos candidatos em comparação com células não tumorigénicas sugerindo uma janela terapêutica possível de sensibilização. Todos os quatro genes tenham sido previamente reportado como bate em telas de interferência RNA. [28], [29], [30] Todo o código quatro alvos para proteínas passíveis de intervenção terapêutica e foram reportados anteriormente para participar nas vias do ciclo celular ou caminhos de sobrevivência em outros tipos de tumores. [31], [32], [33] Genómica dados do TCGA eo laboratório Birrer ainda apoiar a noção de que há pelo menos três dos alvos (

NDC80

,

NUF2

,

PTN

) deve haver vulnerabilidade seletiva para a terapêutica de células tumorais em relação a células normais, dado o significativo aumento da regulação em adenocarcinomas serosa. [34] No momento, os inibidores mais promissores de segmentação destes candidatos incluem INH11 [35] que tem como alvo a via NDC80 /NUF2, os anticorpos anti-PTN neutralizantes [36] que inibem funcionalmente o crescimento do tumor promovendo actividades do PTN, e galato de epigalocatequina que inibe HSPA5. [37] Além disso, os medicamentos à base de siRNA também provaram ser opções viáveis ​​para

in vivo

terapia [38], [39], [40] nos fornecer avenidas para prosseguir com estudos pré-clínicos para avaliar a eficácia de alcançar nossos quatro hits usando ortotópicos, mouse modelos de xenotransplante de cancro do ovário.

HSPA5

(Tabela 1) é um gene cujo produto é um regulador central para a homeostase retículo endoplasmático que é crítico para o sobrevivência de células eucarióticas. [41] HSPA5 é uma chaperona ER estresse indutível que é altamente induzida em uma ampla variedade de tumores por meio de factores como a hipoxia e acidose no microambiente de tumores pouco perfundidos. [41] Num estudo anterior, anticorpos dirigidos contra HSPA5 superfície celular de apoptose induzida em células SKOV3. [42] No presente estudo, o silenciamento de HSPA5 induzida apoptose significativa em células A2780 e mostrou uma paragem do ciclo celular significativa de células A1847 em fase G1. dados de expressão gênica de TCGA sugerem que a expressão reduzida é mais comum para este gene, o que é contraproducente para os nossos resultados do rastreio. análise mostra CNV que

HSPA5

é perdida em 41% das amostras e análise mutacional de shows de dados TCGA que

HSPA5

é mutado em menos de 1% das amostras. Dada a expressão reduzida, deleção do gene, e falta de mutações nas amostras tumorais de pacientes com câncer ovariano, estudos adicionais são necessários, a fim de obter uma melhor compreensão do mecanismo de ação eo significado clínico desta hit para câncer de ovário

de acordo com nossos dados de rastreio,

NDC80

e

NUF2 Quais são sobre-expressos em quase 100% das amostras e

PTN

é sobre-expresso em ~ 40% do para amostras independentes duas coortes de amostras de doentes. Os produtos de proteína de

NDC80

(

HEC1

,

KNTC2

) e

NUF2

(

CDCA1

) fazem parte de um mitótico complexo envolvido em interações cinetócoro e o ponto de verificação de montagem do fuso na mitose. [43] A mitose desregulação é uma causa comum na carcinogênese. [44] Em um estudo anterior, siRNA knockdown mediado contra

NDC80

e

NUF2

foi mostrado para causar a saída de mitose anormal e induzir a apoptose em câncer colorretal e linhas celulares de cancro gástrico. [32] Num outro estudo de silenciamento

NDC80

em uma linha de células de EOC, SKOV3.ip1, sugeriram que um aumento na morte celular relacionada com a apoptose. [45] Tanto o

NDC80

e

NUF2

foram mostrados para ser-se regulado no cérebro, fígado e câncer de mama. [46] Sobre-expressão de

NDC80

e

NUF2

tem sido relacionada com mau prognóstico clínico em doentes com cancros da mama e do pulmão de células não-pequenas [43], [47]. Perturbação de NDC80 NUF2 e a formação do complexo utilizando um inibidor de molécula pequena, INH1, foi mostrado para reduzir a proliferação de células no cancro da mama e reduzir o crescimento do tumor em um modelo de murganho de xenoenxerto. [35] componentes kinetochore, particularmente NDC80 e NUF2, têm sido propostas como potenciais alvos de cancro terapêutica. [48] ​​Nosso estudo representa o primeiro relatório sobre NDC80 e NUF2 como alvos potenciais da droga para o tratamento de câncer de ovário.

PTN

(pleiotrofina,

HARP

) é outro interessante gene identificado, cujo produto é um conhecido factor de crescimento para induzir a sobrevivência a jusante através de múltiplas vias de receptores a saber, ALK, SDC3, sdc1 e PTPRb /z sinalização. [49] Foi demonstrado desempenhar um papel crucial na tumorigénese em modelos pâncreas, do cérebro e do tumor da mama. [50] Ele está envolvido na transformação de células, crescimento, sobrevivência, migração e angiogênese. O

PTN

gene é altamente expressa durante a embriogênese, mas mostra a expressão muito limitada em tecidos adultos, onde é restrito ao cérebro. [51], [52], [53], [54] Nós mostramos usando ensaios de ELISA que os níveis PTN são significativamente elevados em meio condicionado das linhas de células de câncer de ovário examinados (G. Sethi e A. K. Godwin, dados não publicados).