Abstract

A ineficiência de células geradoras induzidas pluripotentes somáticas (IPS) gerou dois modelos em disputa, ou seja, o modelo estocástico e modelo Elite. Embora o primeiro é mais favorável para explicar as ineficiências, pode ser falíveis para extrapolar o mesmo modelo de trabalho de reprogramação das células cancerosas. Com efeito, as células tumorais são conhecidos por serem inerentemente heterogénea no que diz respeito às características distintivas proporcionando assim uma plataforma apropriada para se testar se o processo de reprogramação das células cancerosas é tendenciosa. Aqui, nós relatamos as nossas observações de que todas as células cancerosas pluripotentes induzidas escolhidos aleatoriamente (IPCS) estabelecidos previamente não possuem mutações conhecidas na população dos pais. Esta observação imprevista é mais parcimoniosa explicada pelo modelo Elite, em que foram selecionados putativos progênies tumorais início durante a indução de pluripotência

Citation:. Lai J, Kong CM, Mahalingam D, Xie X, Wang X (2013) Elite modelo para a geração de células pluripotentes cancro induzido (iPCS). PLoS ONE 8 (2): e56702. doi: 10.1371 /journal.pone.0056702

editor: Rajasingh Johnson, da Universidade de Kansas Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de setembro de 2012; Aceito: 14 de janeiro de 2013; Publicação: 13 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Ministério da educação Fundo de Investigação Académica do Nível 1 subvenções, R-183-000-259-112 e R-183-000-295-112. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

induzidas células cancerosas pluripotentes (iPCS)

a indução de células cancerosas a pluripotência (iPCS) foi alcançado com sucesso em várias células cancerosas e mostraram resultados promissores de atenuar a sua tumorigenicidade [1] – [5 ]. No entanto, dado que cada colónia de células de cancro pluripotentes estabelecida é assumido ser clonal de uma única célula parental cancro, e que a população de células de cancro parental é provável heterogénea, será de interesse pungente para compreender se o processo de reprogramação nuclear é tendenciosa. Embora Yamanaka (2009) propôs que a geração de células estaminais pluripotentes induzidas (IPS) não é um processo enviesada (modelo estocástico) [6], é de facto falível extrapolar este modelo para a geração de PISQ, tendo em conta a heterogeneidade de células cancerosas .

intratumoral heterogeneidade

tumores individuais têm sido comumente observado para ser morfologicamente e por análise do cariótipo heterogênea [7] – [12], ocasionalmente, obscurecendo histopathologists para determinar com precisão o grau do tumor ao diagnóstico clínico. Além disso, um experimento de subclonagem clássico conduzido por Fidler, I.J. e Kripke, M. L. fornecida evidência convincente de que a heterogeneidade dentro de um tumor existente no que diz respeito à capacidade metastática [13]. Além disso, o avanço agressivo de sequenciamento de última geração (NGS) já introduziu a possibilidade de única sequenciamento núcleo, que propôs um modelo pontuado para a evolução do tumor [14].

Para testar se o modelo estocástico realiza em reprogramação de células, uma população heterogénea distinguíveis deve ser utilizado para observar se qualquer subpopulação é sobre-representados nas colônias reprogramadas. Na verdade, esta condição é preenchida por células cancerosas, que apresenta uma configuração experimental interessante. Hochedlinger

et ai.

(2004) observaram que os ratos reprogramadas células de melanoma compartilhar uma configuração cariótipo homogéneo, em contraste com a sua população celular parental que é heterogéneo [15]. Com efeito, se o modelo estocástico segura, o cariótipo da população de melanoma deve ser reprogramado heterogénea entre os clones. No entanto, um parâmetro critico para fundamentar totalmente a rejeição do modelo estocástico tem de ser determinado: a proporção de células parentais que possuem a mesma configuração cariótipo como as células reprogramadas. Se esta proporção é grande na anterior, estatisticamente, há pouca base para rejeitar o modelo estocástico neste caso. No entanto, se a proporção é suficientemente pequeno, é realmente perceptível a rejeitar o modelo estocástico

Aqui, nós relatamos observações semelhantes sobre a reprogramação de câncer de pulmão de células não-pequenas de duas células (NSCLC) -. H358 e H460 . O primeiro foi relatado para ser

TP53

homozigoto excluídos [16], esta última exercer homozigoto excluído

CDKN2A

[17] e mutante

CDKN2B

(dados não publicados). De forma bastante surpreendente, observou-se que PISQ gerado a partir destas células cancerosas, isto é, iPCH358 e iPCH460, não abrigam qualquer das deleções ou mutações conhecidas. Além disso,

TP53

observada em iPCH358 e

CDKN2A, CDKN2B

em iPCH460 foram observados para ser do tipo selvagem. Além disso, o parâmetro crítico acima mencionado foi determinada e sugere a rejeição do modelo estocástico; Os resultados experimentais sugerem que a reprogramação das células cancerosas segue o modelo Elite que tenha seleccionado uma subpopulação distinta de células a partir de uma população de células de cancro parental heterogénea.

Materiais e Métodos

linhas de células e cultura

As linhas de células utilizadas neste estudo são humano IMR90 de fibroblastos de pulmão fetal (sem. CCL-186 ATCC), HeLa (ATCC no. CCL-2), adenocarcinoma NCI-H358 (ATCC n. CRL-5807), de células grandes carcinoma NCI-H460 (ATCC no. HTB-177), bem como H1 células estaminais embrionárias humanas (não WiCell. WA01). NCI-H460 obtido a partir de laboratório do Dr. Koeffler também foi adquirida de ATCC. Todas as linhas de células foram mantidas numa incubadora humidificada mantida a 5% de CO

2 37 ° C e cultivadas em meios ATCC recomendado suplementado com 10% de FBS. A geração de PISQ foi descrito anteriormente [18]. Resumidamente, IPCS foram estabelecidos através do protocolo de Yamanaka com ligeira modificação [19]. Lentivírus e retrovírus foram produzidas por transfecção de células 293T e células Plat-E, respectivamente. Antes de infectar H358 e H460 células, os vírus foram filtradas através de um filtro de acetato de celulose sem agente tensioactivo de 0,45 um tamanho de poro (Sartorius). PISQ e células estaminais embrionárias humanas foram cultivadas em ratinho irradiado fibroblasto embrionário (iMEFs) banhado em meio DMEM /F12 (Invitrogen) suplementado com 20% de substituição KO soro (Invitrogen), 1 mM de L-glutamina (Invitrogen), 100 uM de aminoácidos não essenciais, 100 uM p -mercaptoetanol (Sigma-Aldrich) e 4 ng /mL factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) (Invitrogen). Antes da realização de experiências no PISQ e células estaminais embrionárias humanas, as células foram semeadas no Matrigel (BD Bioscience) e mantidas em mTeS®1 (StemCell Technologies).

ARN /ADN isolamento e transcrição reversa PCR (RT-PCR)

o ARN total foi extraído utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen) e usando Transcriptase reversa enzima (Promega), bem como iniciadores oligo dT (Promega) transcrito-reversa, de acordo com as instruções do fabricante. O DNA total foi extraído usando DNeasy Blood Kit de tecido (Qiagen).

Análise Microarray

dados de microarranjos para expressão gênica e metilação do DNA foram obtidos a partir GSE35913. As análises foram realizadas utilizando-R em lumi e ambientes methylumi [20]. mapa de calor foi gerado usando o pacote gplots.

PCR e sequenciamento

TP53

,

CDKN2A

e

CDKN2B

foram amplificados a partir de cDNA e ADN genómico de IMR90 (controlo positivo), H358, H460 e 10 escolhidos aleatoriamente colónias iPCH358 e iPCH460. Os iniciadores para amplificações podem ser encontrados na Tabela S1. Os produtos de PCR foram resolvidos por electroforese em gel e purificado com o QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) e sequenciado utilizando BigDye® Terminator v3.1 kit de ciclo de sequenciação (Applied Biosystems). O produto da PCR para

TP53

amplicon 2 para iPCH358 Col # 3 foi clonado em pGEM®-T vector (Promega) antes de seqüenciamento.

Western Blot

lisados ​​de células inteiras de H1, HeLa, H358, H460 e 10 escolhidos aleatoriamente colónias iPCH358 e iPCH460 cada foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. Foi utilizado anticorpo primário TP53 (Cell Signaling # 9282) para sondar presença de TP53 em H1, HeLa, H358 e todas as colônias iPCH358. anticorpo primário CDKN2A (Cell Signaling # 4824) foi utilizado para sondar a presença de CDKN2A em H1, HeLa, H460 e todas as colónias iPCH460.

ensaio de diluição em série

30 ng /mL de ADN genómico IMR90 diluiu-se em série de 10 vezes por mL de H460 de ADN 30 ng /genómico. 1 mL da mistura foi então utilizado como molde para a amplificação de

CDKN2B

.

tumores explantes

Cerca de 2 × 10

6 H358 e H460 células foram ressuspensas em 30% de Matrigel e injectadas subcutaneamente em ratinhos imunodeficientes combinados graves (SCID) ou ratinhos nus (Tabela S2). Os tumores foram deixados crescer durante três a quatro semanas. Os ratinhos foram sacrificados antes de a excisão de tumores. Os experimentos com animais foram realizados sob aprovado IACUC (The National University of Singapore Animal Care Institucional e Comitê de Uso) protocolos de 117/09.

Metaphase espalhar

Metaphase se espalha de pais e pós-iPC foi realizada como descrito por Jeppesen [21]. Resumidamente, as células foram cultivadas até 70% de confluência e foram tratados com 0,1 ug /ml de solução demecolcina (Sigma) durante 7 horas. As células foram, então, dissociadas com tripsina e tratados com 75 mM de KCl, a 37 ° C durante 10 minutos. 5 × 10

3 células (em 100-500 ul de KCl) foram centrifugadas a 1000 rpm para as lâminas citocentrífugas durante 5 minutos. As lâminas foram então lavadas com KCM (KCl 120 mM, 20 mM de NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, EDTA 0,5 mM, 0,1% de Triton X-100) durante 5 minutos, bloqueadas com BSA a 10% (diluído em KCM) para 45 minutos. Isto é seguido por incubação com anticorpos primários durante duas horas e, em seguida, anticorpos secundários conjugados com fluorescência para-uma hora. Após lavagem das lâminas com KCM, os diferenciais foram fixadas com formaldeído a 4% durante 15 minutos. Finalmente, as lâminas foram lavadas com água destilada, secas ao ar e montadas com meio de montagem contendo DAPI (Vector Laboratories). Todas as imagens foram capturadas usando Olympus Fluoview FV1000 microscópio. Os anticorpos primários utilizados foram

CENPA

(Abcam) e

TRF2

(BD Transduction Laboratories).

números

adesão

Todos os dados de sequenciamento de

TP53

,

CDKN2A

e

CDKN2B

foram enviados para GenBank com os números de adesão JQ694043-51and JX391994.

resultados

Presença de

TP53

observada em iPCH358

O sucesso da criação iPCH358 e iPCH460 em nosso laboratório foi relatado anteriormente [18]. dados de microarray de expressão de genes revelaram que a detecção de

expressão TP53

em H358 foi semelhante aos níveis de ruído de fundo para todas as três repetições biológicas, mas regulado positivamente em iPCH358, que foi inteiramente inesperado (Figura 1A). Para descartar microarray artefato,

TP53

em 10 escolhidos aleatoriamente colónias iPCH358 foi interrogado por PCR e Western Blot. Para nossa surpresa, estes ensaios concordam por unanimidade com os dados de microarranjos (Figura 1B). Além disso, sequenciado região codificadora do

TP53

e descobriu que ele seja do tipo selvagem em três colônias escolhidos aleatoriamente de iPCH358 (GenBank: JQ694049-JQ694051).

(A) log- leituras transformadas intensidade do Illumina HumanHT-12, indicando um aumento significativo (FDR-ajustado P 0,05) regulação positiva de

TP53

transcrição em iPCH358 comparação com H358. Isto é inesperado, uma vez H358 é conhecido por ser

TP53

– /-. (B) PCR (painel superior) e Western Blot (painel inferior) ensaios confirmando a expressão de

TP53

em várias colónias escolhidas aleatoriamente de iPCH358. A região codificadora do

TP53

no Col # 1, Col # 3 e Col # 11 são do tipo selvagem (GenBank: JQ694049-JQ694051). (C) por PCR (painel da esquerda) e Western Blot (painel da direita) em ensaios de colónias iPCH358 de 20 passagens revelou que número de passagens é não informativo para o resultado destes ensaios. Os resultados de experiências realizadas em ocasiões separadas ou cortada a partir da mesma imagem são marcados por uma linha quebrada; imagens originais podem ser encontrados em Apresentação S1, que inclui documentação detalhada do número de passagens.

CDKN2A

e

CDKN2B

não mutado em iPCH460

este resultado motivou-nos a determinar se uma ocorrência similar foi observado em H460. conjuntos de sondas (de metilação do DNA microarray) para o promotor de

CDKN2A

(

P16

) e

CDKN2B

(

P15

) não foram capazes de produzir confiável sinais biológicos para todos os replicados (n = 3) de H460, o que é provavelmente devido a mutações no locus interrogados. No entanto, o mesmo não pode ser dito para iPCH460 (Figura 2A). Para validar esta observação, pares de primers desenhado por Shan,

et al.

(2004), que não irá produzir quaisquer produtos de PCR a partir do modelo de ADN genómico H460, foram utilizados [22]. Surpreendentemente, o mesmo par de iniciadores foi capaz de produzir produtos de PCR a partir de 10 colónias escolhidas ao acaso de iPCH460 molde de ADN genómico (Figura 2B). De modo semelhante, os pares de iniciadores concebidos para amplificar a região de codificação de ambos

CDKN2A

e

CDKN2B

ARNm não deu quaisquer produtos de PCR de H460, mas todos os 10 iPCH460 colónias produziram produtos de PCR sob as mesmas condições (Figura 2B). Além disso, os resultados de sequenciamento das regiões codificadoras de ambos

CDKN2A

e

CDKN2B

mRNA de três escolhidos aleatoriamente colónias iPCH460 foram observados para ser do tipo selvagem (GenBank: JQ694043-JQ694048). Além disso,

CDKN2A

que é conhecido para ser eliminada no H460 é expresso e é detectável por Western Blot nos iPCH460 (Figura 2B). Apesar de não terem produtos de PCR de amplificação

CDKN2B

em H460 foram observados, proteína CDKN2B é expressa activamente no H460 e assim permaneceu em iPCH460 (Figura S1). Nosso laboratório descobriu que em vez de deleção do gene inteiro, pequenas mutações putativas no loci circundante de métodos de PCR

CDKN2B

em H460 prestados estabelecidos para falhar. Isso foi verificado com fontes independentes H460 células de laboratório do Dr. Koeffler (Figura S2).

(A) sondas de matriz mapa de calor indicando metilação (linhas) não ter hibridizam com

CDKN2A Comprar e

CDKN2B

promotores em H460 (barras vazias), mas não é assim no iPCH460. (B) PCR (painel superior) ensaio mostrando

CDKN2A

e

CDKN2B Quais são detectáveis ​​em iPCH460 enquanto ensaio de Western Blot (painel inferior), mostrando

CDKN2A

, que é homozigoto excluído em H460, é detectável no iPCH460. (C) por PCR (painel superior) e Western Blot (painel inferior) em ensaios de colónias iPCH460 de 20 passagens revelou que número de passagens é não informativo para o resultado destes ensaios. Os resultados de experiências realizadas em ocasiões separadas ou cortada a partir da mesma imagem são marcados por uma linha quebrada; imagens originais podem ser encontrados em Apresentação S1, que inclui documentação detalhada do número de passagens.

A expressão de genes suprimidos persistir através de passagens tardias de iPC colônias

Chin e seus colegas relataram que as primeiras passagens ( ≤ 10 passagens) de colônias iPS comportado de forma diferente de seus passagens tardias ( 20 passagens) homólogos [23]. Em nossos testes anteriores (Figura 1B e Figura 2B), nossas amostras eram predominantemente ≤20 passagens. Assim, procedeu-se a caracterizar se o número passagem irá modificar o comportamento expressão de

TP53

em iPCH358, bem como

CDKN2A

e

CDKN2B

em iPCH460. Curiosamente, não observamos nenhuma mudança no comportamento de expressão no final de passagem IPCs (Figura 1C, figura 2C e Apresentação S1).

Um possível fator de confusão para a nossa observação, até agora, é a presença de contaminação de fibroblastos normais nestes câncer linhas de celular. Portanto, para descartar a possibilidade de que esses IPCs resultantes foram derivadas de contaminar fibroblastos normais, metaphase spread foi realizado em células pós-IPC (espontaneamente diferenciadas colônias IPC via formação do corpo embryoid). Observou-se que as células pós-IPC permanecem aneuploidia e, assim, concluir que as colônias IPC estabelecidos não foram derivados de contaminar fibroblastos normais (Figura S3). Nós também descartou a contaminação de células de células 293T e Plat-E porque ambos lentivírus e retrovírus foram filtrados através de um filtro de 0,45 um poro de tamanho antes de infectar H358 e H460. Além disso, verificou-se que os vetores de controle de GFP não desempenhou nenhum papel na expressão dos genes mutantes, tanto H358 e H460 (Figura 1B e Figura 2B).

Em conjunto, temos aqui duas hipóteses complementando a explicar porque

TP53

células H358 nulos expressa TP53 mediante reprogramação (da mesma forma,

CDKN2A

células H460 nulos CDKN2A mediante reprogramação expressos): 1) reprogramação induz um mecanismo de recuperação gene; 2) reprogramação, numa população heterogénea, enriquecido uma subpopulação de células com o estado mutacional diferente do que a maioria da população. Na verdade, a última hipótese fornece a explicação mais parcimoniosa (ver discussão).

modelo Elite de reprogramação prevê nossas observações

Dado que H358 e H460 são heterogêneos em relação ao estado de mutação de genes, pedimos , “Qual é a probabilidade de que pegou tudo aleatoriamente colónias iPCs são derivadas da subpopulação menor sem mutação conhecida que caracteriza a maioria da população, se reprogramação segue o modelo estocástico” Nós primeiro estabeleceu um parâmetro: a proporção estimada da subpopulação menor (por simplicidade, esta subpopulação será referida como a subpopulação “isento de mutação ‘). Para estimar que, IMR90 genoma foi diluída em série com o genoma H460 e avaliou a eficácia para amplificar

CDKN2B

por PCR. Nós escolhemos para amplificar

CDKN2B

devido à sua eficiência de amplificação em comparação com

CDKN2A

ou

TP53

(Figura S4). Em nosso ensaio, estimou-se que a proporção máxima de células H460 sem mutante

CDKN2B

é 1:5000 (Figura 3A). Com esta estimativa, calculamos a probabilidade de observar todas as colónias escolhidas aleatoriamente, que foram derivadas da subpopulação “isento de mutação”. Para ambos iPCH358 e iPCH460, a probabilidade de observar todos os 10 colônias escolhidas aleatoriamente para ser “livre de mutação ‘é 1 × 10

-37 (Figura 3B). Além disso, a menor proporção possível para resultar numa probabilidade de 0,05 ou mais, neste modelo de probabilidade é de 0,75 (

10C

10 × 0,75

10 × 0,25

0 0,05), isto é, se o começando população não tinha menos de três células “sem mutação ‘para cada quatro células. Esta proporção não é em qualquer lugar perto de 0,25, que é o mais pobre proporção estimada a partir da amplificação menos eficiente dos ensaios de diluição em série (Figura S4A). Assim, rejeitamos a hipótese nula e concluir que a reprogramação de células cancerosas segue o modelo Elite.

(A) ensaio de diluição de série mostrando que a 10

3,7 vezes a diluição,

CDKN2B

em IMR90 é detectável em níveis basais. Portanto, no máximo, 1 em 5000 H460 células são “livre de mutação”. (B) O modelo de probabilidade para testar a hipótese nula: “Geração de CPIs segue o modelo estocástico”. entrada posterior dos parâmetros determinados em (A) sugere a rejeição do modelo estocástico na reprogramação da H358 e H460.

Definir a subpopulação “isento de mutação ‘

Enquanto o modelo Elite neste experimento reprogramação afirma que o processo está inclinado para a subpopulação “isento de mutação”, o enriquecimento desta subpopulação evasivo em seu estado nativo é tecnicamente desafiador. No entanto, Hochedlinger

et ai.

(2004) mostraram previamente que a configuração do cariótipo da célula cancerosa reprogramado é semelhante ao do tumor explante [15], sugerindo que a inoculação de linha celular de cancro em ratinhos SCID foi seleccionado uma subpopulação tumorigénica com recurso citogenética semelhante à da célula cancerosa reprogramado. Além disso, foi apontado que Chang

et al.

(2003) observaram que linhagens de células tumorais foram tipicamente heterogêneo em contraste com seus tumores de explantes derivados [24]. Assim, quatro tumores de explantes de H358 e H460 foram gerados cada (Tabela S2). No entanto, apenas um tumor explante de H358 (H358-2) produziu detectável

TP53

no seu ADN genómico (Figura 4A). Por outro lado, nenhum dos explantes de tumores H460 produziram detectável

CDKN2A

ou

CDKN2B

(Figura 4B). Portanto, inoculação de linhagem de células cancerosas em ratos SCID fracamente emula a seletividade de reprogramação nuclear.

(A) Um em cada quatro H358 explante tumor gerado presença demonstração de

TP53

no genoma, indicando enriquecimento da subpopulação evasivo “livre mutação”. (B) Nenhum dos tumores de explantes H460 foram observados para ser enriquecido para subpopulação “isento de mutação”. O ADN genómico de cauda de ratinhos SCID foi usada para controlar a contaminação de ADN de ratinhos em tumores de explante. Informações de tumores de explantes podem ser encontrados na Tabela S2.

Discussão

Reprogramação discrimina população de células de câncer heterogêneo

Os dados aqui apresentados mostram que os difere estado de mutação genética entre a população de células de cancro dos pais e a contraparte reprogramado. Enquanto não temos dados experimentais para mostrar a homogeneidade ou heterogeneidade da H358 e H460 populações de células cancerosas diretamente, a fim de explicar esta observação intrigante, propusemos duas hipóteses que complementam: 1) A população inicial é homogênea e reprogramação assim nuclear inadvertidamente corrige certa mutações; 2) A população inicial é heterogênea e reprogramação nuclear enriquece uma subpopulação menor. A primeira hipótese dobradiças no pressuposto de uma célula em que é capaz de recuperar um gene mutado. No entanto, é claro que tal mecanismo não existe porque estabelecimento de iPS a partir de

INK4 /Arf

knock-out fibroblastos de rato embrionárias

p53, Terc Comprar e [25], [26], não viu a recuperação desses genes. Por outro lado, a segunda hipótese assume um cenário em que a reprogramação discrimina entre a população de células de cancro heterogénea de diferentes graus de insulto genética. Esta suposição se assemelha à observação Hochedlinger e colegas fizeram em que o cariótipo heterogênea do melanoma ratos torna-se homogénea de pós-reprogramação [15]. Portanto, a segunda hipótese é favorecida para explicar a discrepância entre o estado de mutação nas células antes e após a reprogramação.

Se as populações a partir de H358 e H460 são heterogêneos, e existe uma subpopulação “isento de mutação ‘ , por que PCR ou Southern-Blot [16] não detectar esses genes? Propomos que a proporção de subpopulação “isento de mutação” é demasiado pequena para proporcionar molde suficiente para amplificações por PCR para produzir produtos suficientes para detecção com brometo de etídio. Na verdade, nós mostramos isso na diluição de IMR90 DNA genómico de pelo menos 5000 vezes irá mascarar a detecção de

CDKN2B

amplicon. Com base nesta análise, estimamos que há no máximo uma célula “isento de mutação” para cada 5000 células H358 ou H460. Portanto, para atingir IPCs derivadas desta subpopulação “isento de mutação ‘evasivo é altamente improvável, se o processo de reprogramação é estocástica. Por isso, propomos que a reprogramação de células cancerosas segue o modelo Elite.

progênies de tumores iniciais podem definir a competência no sentido de reprogramação

Uma vez que o processo de reprogramação discrimina uma população de células de câncer heterogêneo, buscou-se delinear a características subjacentes nas células cancerosas que determina a competência no sentido de reprogramação. Estudos anteriores indicaram que fatores de reprogramação ativar vários senescência e mecanismos tumor-supressora (isto é,

TP53

e

CDKN2A

) que agem como barreiras no sentido de reprogramação [25] – [27]. Surpreendentemente, apesar de deleções de genes somáticos destas barreiras na maioria das células H358 e H460, nenhuma das colónias escolhidas aleatoriamente foram nulos para estes genes. Além disso, observou-se que o potencial tumorigénico (determinada pela inoculação SCID) fracamente emula o enriquecimento do processo de reprogramação. Por outro lado, os nossos dados sugerem que os derivados destes são PISQ putativos primeiros progênies da população tumoral.

catraca de Muller declara que mutações em organismos que se reproduzem assexuadamente são irreversíveis e acumula-se ao longo de gerações [28]. Da mesma forma, as células cancerosas “reproduzir”, através de mitose e genéticos danos são irreversíveis e se acumulam ao longo de vários ciclos celulares. Em outras palavras, isso implica que os derivados de iPCH358 e iPCH460 são células dos estágios iniciais da tumorigênese. Além disso, dado que os genes mutantes em questão (

TP53

,

CDKN2A

e

CDKN2B

) são importantes para a integridade do genoma, é provável que estes “mutação células -free ‘têm um menor grau de insultos de nível genético. Paradoxalmente, no entanto, estas células são aneuploidia e exibir mais ampla disseminação de contagem de cromossomos que suas células parentais (Figura S2), plausivelmente corroborando a teoria de que a aneuploidia promove a instabilidade do genoma [29]. Concordando com esta teoria, Navin e colegas observaram semelhante que copiar amplificação número de

KRAS

, um oncogene importante, é exclusivo para população tumor aneuplóide [14]. Portanto, propomos uma hipótese orientadora que a reprogramação seleciona células cancerosas de progênies anteriores do tumorigênese, onde insultos de nível genético são baixos mas manifestamente aneuploidia (Figura 5). Com efeito, a integridade genética mantidas por

TP53

e

CDKN2A

, entre outros, pode ser necessário, a fim de preservar o circuito pluripotência fortemente regulada para assegurar o sucesso reprogramação [30] – [32]. Além de explicar por que IPCs gerados a partir de H358 e H460 não eram

TP53

nula e

CDKN2A

nulo, respectivamente, isso pode responder a uma pergunta intrigante representada por Zhang e seus colegas a respeito de como uma célula de sarcoma reprogramado com danos a nível genético múltipla ainda poderia alcançar pluripotência [5]. experiências futuras, tais como Flow-FISH (citometria de fluxo de fluorescência

in situ

hibridação) para resolver a subpopulação “isento de mutação», seguido única sequenciamento núcleo irá fornecer evidências para corroborar ou falsificar essa hipótese. . Além disso, novos estudos sobre o genoma do tumor explante H358-2 será de interesse em abordar esta hipótese

A partir dos nossos dados, observou-se que os derivados de nosso IPCS: 1) não tinha chave mutação genética (s) ; 2) aneuploid; 3) menor subpopulação. Dadas estas características observadas, é seguro assumir que estes derivados eram progênies precoces da população tumor (representado em verde). Assim, aneuploidia é possivelmente primeira adquirido antes mutações críticas para conduzir mutações ainda mais vantajosas (demarcadas em cinza), de acordo com a observação por Navin et al (2011). Juntamente com o entendimento de que o circuito regulador pluripotência é rigidamente controlado e complexo, menos insultos de nível genético nas células (círculos falta “X” vermelho) irá garantir a integridade do circuito e daí o sucesso do estabelecimento de iPC (representada em roxo) que pode ser diferenciadas para múltiplas linhagens (representado em azul).

Observações finais

neste estudo, nós utilizamos linhas celulares de cancro que são inerentemente heterogêneo, o que nos permite observar qual variável ( s) preconceitos em relação a geração bem-sucedida de iPCs. Na verdade, as nossas observações de que as subpopulações ‘livre de mutação’ foram selecionadas contra a maioria sugerem que a reprogramação de células cancerosas segue o modelo Elite. Esta conclusão não falsificar a proposta anterior que a geração de iPS segue o modelo estocástico, em virtude de que as células somáticas normais e células cancerosas são diferentes. Além disso, os nossos dados conduz a uma hipótese de orientação que foram seleccionados putativos progênies precoces da população do tumor durante o processo de reprogramação. Futuro elucidação de características associadas à subpopulação “isento de mutação ‘sugerido por nossos dados seria de grande utilidade para a compreensão ainda mais a reprogramação de processo de células cancerosas para desvendar o subjacente heterogêneo make-up de tumores, que será a chave para anti-câncer estratégias terapêuticas.

Informações de Apoio

Figura S1.

expressão da proteína CDKN2B em H460 e iPCH460.

CDKN2B

é mutado em H460 que torna todos os ensaios de PCR para falhar, mas não perturbar a sua expressão da proteína

doi:. 10.1371 /journal.pone.0056702.s001

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Figura S2.

Presença de

CDKN2B

em H460 células do nosso laboratório e laboratório do Dr. Koeffler (Klab). (A) CDKN2B proteína pode ser detectada em células H460 do nosso laboratório e KLAB. (B) um pares de primers alternativos que projetamos (Tabela S1) foram capazes de amplificar

CDKN2B

tanto em DNA genômico e cDNA de H460. Nós sequenciado região codificante deste gene e descobriu que ele seja do tipo selvagem (GenBank: JX391994)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0056702.s002

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Figura S3.

Metaphase propagação mostra que o pós-IPCs (piPCs) são aneuploidia. (A) os spreads metáfase representativos de H358, H460, piPCH358 e piPCH460. (B) Quadro resumindo as contagens de cromossomos de pelo menos oito propagações independentes por amostra. Blue – cromossomos DAPI manchado; verde – TRF2; . Vermelho – CENPA

doi: 10.1371 /journal.pone.0056702.s003

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Figura S4. Página 2 vezes diluição em série de IMR90 genoma para amplificação do

TP53

e

CDKN2A

. (A) IMR90 ADN genómico foi 2 vezes diluída em série com o ADN genómico H358 como molde para amplificar

TP53

. Observou-se que a diluição de 4 vezes, banda de PCR correspondente a

TP53

é ligeiramente visível. Isso nos dá uma estimativa de que para cada quatro H358 células, um é “isento de mutação”. (B) Similarmente, IMR90 ADN genómico foi 2 vezes diluída em série, mas em vez disso com H460 ADN genómico. eficiência de amplificação de

CDKN2A

foi igualmente posta em causa por produtos não específicos; na diluição de 32 vezes, a banda PCR foi marginalmente significativa dando assim uma estimativa de que para cada 32 H460 células, um é “isento de mutação”. Independentemente disso, a análise de qualquer um destes parâmetros para o modelo de probabilidade na Figura 3 irá resultar em uma probabilidade muito menor do que 0,05

doi:. 10.1371 /journal.pone.0056702.s004

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Apresentação S1 .

imagens originais usadas na Figura 1 e Figura 2.

doi: 10.1371 /journal.pone.0056702.s005

(PDF)

Tabela S1.

Primer Sequências

doi: 10.1371. /journal.pone.0056702.s006

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Tabela S2.

explantes Tumor de dados

doi: 10.1371. /journal.pone.0056702.s007

(XLSX)

Reconhecimentos

Chiou Mee Kong é um beneficiário de bolsas de investigação a partir de Yong Loo Escola Lin of Medicine, NUHS, NUS, Singapore. Agradecemos ao Dr. Patrick Tan por comentários perspicazes, bem como Dr. Phillip Koeffler para sua espécie de presente de células H460.