Abstract
Purpose
A recidiva local é a principal manifestação do fracasso do tratamento em pacientes com câncer de laringe operável. fatores clinicopatológicos estabelecidas não é possível prever suficientemente pacientes que são susceptíveis de ocorrer após o tratamento. Ferramentas adicionais são, portanto, obrigados a identificar com precisão os pacientes com alto risco de recorrência. Este estudo tenta identificar e validar de forma independente modelos de expressão gênica, prognóstico de sobrevida livre de doença (DFS) no câncer de laringe operável.
Materiais e Métodos
Usando Affymetrix U133A Genechips, nós perfilado água doce tecidos tumorais congelados de 66 pacientes com câncer de laringe tratados localmente com a cirurgia. Aplicamos regressão de Cox modelagem de riscos proporcionais para identificar preditores multigênicas de recorrência. modelos de genes foram validados em duas coortes independentes de 54 e 187 pacientes (conjuntos de validação tecido fresco-congelados e fixados em formalina, respectivamente).
Resultados
Estamos focados em genes associados com univariada DFS (
p Art 0,01) no conjunto de treinamento. Entre os vários modelos que compreendem números diferentes de genes, um modelo conjunto de 30 sonda demonstrou um ótimo desempenho, tanto na formação (log-rank,
p Art 0,001) e 1
st validação (
p
= 0,010) define. Especificamente, no conjunto de validação 1
st, mediana DFS como previsto pelo modelo de conjunto de 30 sonda, foi de 34 e 80 meses para os pacientes de alto e de baixo risco, respectivamente. taxa de risco (HR) para a recorrência no grupo de alto risco foi de 3,87 (IC 95% 1,28-11,73, Wald da
p
= 0,017). Testando a expressão de genes seleccionados a partir do modelo acima no conjunto 2
ND validação, com qPCR, revelou associações significativas dos marcadores individuais, tais como a ACE2, FLOT1 e PRKD1, com o DFS paciente. Alta PRKD1 permaneceu como um marcador de prognóstico desfavorável na análise multivariada (HR = 2,00, 95% CI 1,28-3,14,
p
= 0,002), juntamente com o status nodal positivo.
Conclusões
Nós estabelecemos e validados modelos de genes que podem estratificar com sucesso pacientes com câncer de laringe, com base no seu risco de recorrência. Parece digno para validar prospectivamente expressão PRKD1 como um marcador de prognóstico do câncer de laringe, para aplicações clínicas de rotina
Citation:. Fountzilas E, Kotoula V, Angouridakis N, Karasmanis I, Wirtz RM, Eleftheraki AG, et al. (2013) Identificação e Validação de um MultiGene Predictor da recorrência no câncer de laringe primária. PLoS ONE 8 (8): e70429. doi: 10.1371 /journal.pone.0070429
Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América
Recebido: 11 de março de 2013; Aceito: 18 de junho de 2013; Publicação: 09 de agosto de 2013
Direitos de autor: © 2013 Fountzilas et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de investigação interna Helénica Cooperative Oncology Group (HeCOG) (HE R_5G). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações: No momento do estudo Ralph M. Wirtz e Elke Veltrup foram empregadas pela Siemens Healthcare Diagnostics. Em nome da Fundação Helénica para a Cancer Research, Atenas, Grécia, o autor sênior (GF) tem pedidos de patentes com Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY pendente. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.
Introdução
O câncer de laringe é o décimo primeiro tipo mais comum de câncer em homens em todo o mundo. Todos os anos, 52.000 casos foram recentemente diagnosticados na Europa e 10000 nos Estados Unidos [1], [2]. Apesar dos recentes avanços em técnicas de diagnóstico e terapêutica, a maioria dos pacientes ainda ocorrer após o tratamento [3]. fatores clinicopatológicos estabelecidas não é possível prever suficientemente pacientes que se repetem. Outros fatores são, portanto, obrigados a identificar com precisão os pacientes com mau prognóstico. Perfil de expressão tem sido utilizada com sucesso na estratificação de pacientes com câncer com prognóstico desfavorável [4], [5], [6], [7]. Estudos anteriores em pacientes com câncer de cabeça e pescoço têm ligado perfis de expressão gênica ao status nodal [8], [9], [10], metástases à distância [11], [12] e sobrevida livre de doença [13], [14], [15], [16]. Embora estes estudos dão muitas informações sobre a complexidade molecular de câncer de cabeça e pescoço que não identificou um perfil genético robusto. O uso clínico destes modelos tem sido limitado pelo grande número de genes, os conjuntos de dados de pequena dimensão e a falta de reprodutibilidade e de validação independente. Além disso, nenhum desses estudos focados exclusivamente no câncer de laringe.
No presente estudo, buscou-se identificar genes prognósticos de recorrência em pacientes com câncer de laringe primário. O ponto final da nossa análise foi sobrevida livre de doença (DFS). Nós perfilado amostras tumorais de duas coortes separadas de pacientes em uso de perfis de expressão gênica global. Usando o primeiro coorte como um conjunto de treino, foram identificados vários modelos de genes de prognóstico, que foram, em seguida, validados no segundo grupo de pacientes. A fim de validar ainda mais os nossos resultados, nós perfilado genes seleccionados dos nossos modelos para a expressão relativa quantitativa com reacção em cadeia de polimerase de tempo-real (qRT-PCR) numa coorte independente de pacientes.
Materiais e Métodos
população do estudo
Nosso estudo composta de 307 pacientes diagnosticados com cancinoma laringe células escamosas primário (conjunto de treinamento: 66, 1
conjunto de validação st: 54 e 2
nd conjunto de validação: 187 pacientes ), com seguimento médio de 52, 33 e 89 meses, respectivamente. Todos os pacientes foram submetidos a remoção cirúrgica do tumor no Departamento de Otorrinolaringologia do Hospital AHEPA em Thessaloniki, Grécia, entre 1985 e 2008. administração pós-operatória da terapia de radiação foi decidido pelo médico assistente e na maioria das vezes foi dado a pacientes com margens tumorais positivos, pacientes com tumores T4 ou aqueles com tumores supraglóticos T1 /T2 para quem uma linfadenectomia eletiva profilática não foi feito. Nenhum dos pacientes receberam terapia sistêmica, como parte de seu tratamento inicial. Este é o padrão atual de tratamento em muitos países europeus [17], no entanto, este pode não ser o caso em outros países, como os EUA, onde o foco principal é a preservação da laringe com quimioradioterapia concomitante, precedido em casos selecionados por indução quimioterapia [18]. Follow-up incluiu o exame físico, a cada três meses para os primeiros três anos e seis em seis meses. Os exames de imagem foram realizados, tal como indicado por sintomas e exame físico. demografia detalhadas e características clínicas dos pacientes com dados de genes válidos estão listados na Tabela 1, enquanto os dados individuais dos pacientes são mostrados como na Tabela S1.
espécimes tumorais
tumor fresco congelado amostras de tecido, de pacientes que compreendem a formação e 1
conjuntos de validação do st, foram coletados prospectivamente no momento da cirurgia, de 2004 a 2008, foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenadas em -80 ° C até o processamento. amostras (FFPE) de tecido tumoral embebidos em parafina fixadas em formalina, de pacientes que compreendem a 2
nd conjunto de validação, foram coletados retrospectivamente (pacientes tratados entre 1985 e 2008). Os últimos foram fixados em formol durante pelo menos 6 horas antes de serem embebidos em parafina. tumores de laringe foram histologicamente avaliadas e verificada em todos os casos, incluindo as amostras de tecido fresco congelado.
Ética Declaração
amostras de tecido de tumor fresco congelado e FFPE foram coletados de acordo com protocolos aprovados pelo Institutional Review Board do Hospital “AHEPA” ea Comissão de Bioética da Universidade Aristóteles de Salónica, School of Medicine. consentimento informado por escrito para o uso científico de material biológico foi obtido de todos os pacientes que compreendem a formação e 1 conjuntos de validação
st e para os pacientes do
nd conjunto 2 de validação tratada depois de 2004. A renúncia do consentimento foi obtido a partir da Comissão de bioética para os doentes tratados antes de 2004 e para as quais as amostras de tecido tumoral FFPE precisava ser coletados retrospectivamente. Todas as investigações clínicas relacionadas com o presente estudo ter sido conduzido de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki.
isolamento de ARN a partir de tecido fresco congelado e de expressão gênica global de perfil
isolamento do RNA de fresco amostras de tumor congeladas foi realizada utilizando o protocolo RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha), como descrito anteriormente [19]. quantidade de ARN foi determinada medindo a absorvância de UV a 260 e 280 nm, enquanto a qualidade do ARN foi avaliada utilizando um kit de Bioanalyzer 6000 ARN LabChip da Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). O ARN foi transcrito de forma inversa, marcado e hibridado com Affymetrix (Santa Clara, CA) matrizes HG-U133A, como previamente descrito [19]. Experiências relativas à formação e 1
conjuntos de validação ST foram realizadas separadamente, em momentos diferentes, na Siemens Healthcare Products diagnóstico (Colónia, Alemanha). Os dados de expressão gênica foram depositados no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) e estão disponíveis através do número de acesso GEO Series GSE27020. O link a seguir foi criado para permitir a revisão de GSE27020: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=dxcdxksauqicizy acc=GSE27020
RNA isolamento do FFPE amostras de tecido tumoral e qRT-PCR
Todas as investigações envolvendo amostras de tecido FFPE foram realizados no Laboratório de Oncologia Molecular, Fundação Helénica para a Pesquisa do Câncer, da Universidade Aristóteles de Salónica School of Medicine. Para validar o valor prognóstico de genes derivados de nossa análise microarray, foi utilizada uma coorte separada de pacientes com material de tecido tumoral disponível. Este grupo amostra incluiu 187 amostras de tecido FFPE que foram macrodissected mediante avaliação histológica anterior para conter células tumorais 50%. O ARN foi isolado após a lise durante a noite tecido completo utilizando Trizol-LS (Life Technologies, Paisley, Reino Unido), conforme descrito anteriormente [20] e foi transcrito reversamente com Superscript III (Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante. Os ADNc foram normalizadas a 25 ng /ul e armazenado a -20 ° C até à sua utilização. a expressão de ARNm foi investigado com o gene TaqMan® Ensaios de Expressão marcado com FAM duplex em reacções envolvendo um ensaio de referência marcado com VIC limitados-iniciador para a beta glucuronidase (GUSB, ensaio # Hs00939627_m1), como um controlo molde endógeno. GUSB foi preferido relativamente a controlos endógenos geralmente aplicados porque não há pseudogenes tenham, ainda, sido relatados para este gene. Além disso, ele foi identificado como um entre os alvos de mRNA mais bem preservados em tecidos FFPE [21]. qPCR mRNA seleção de alvos incluíram avaliação das 30 sondas da assinatura U133A para duplicatas de genes, características genéticas (identidades genéticas válido, tipo de gene, variantes de processamento gravadas que não iria ser distinguidos pela sonda na matriz ou pelo ensaio qPCR), bem como um paramétrico
p -valor de
0,05 para a dobra-mudança na expressão do gene. Das 30 sondas de U133A, 23 manteve-se válida para aplicação qRT-PCR (Tabela 2). Para estes 23 alvos, temos procurado por ensaios pré-fabricados Gene TaqMan® Expressão (Applied Biosystems) que correspondem as sequências alvo detectadas pelas sondas correspondentes na matriz U133A. Foi possível recuperar 16 tais ensaios (Tabela 2). Duplex 10 reacções ul foram corridos em duplicado, cada uma contendo 50 ng de modelo, num sistema ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems /Life Technologies) em um bloco de 384 poços sob condições padrão envolvendo 45 ciclos de amplificação, juntamente com uma amostra de ARN de referência ( TaqMan® Controle de RNA total, cat. não 4307281, Applied Biosystems) e controles não-modelo. O RNA de referência foi usado como um controle de placa positiva e para a avaliação de desempenho do ensaio entre corridas (validação inter-run). Dois dos 16 ensaios selecionados apresentaram valores deltaRQ de 1,5 entre as diferentes corridas e, portanto, falha na validação inter-prazo e não foram ainda avaliadas (Tabela 2)
limiares ciclo (CT, correspondente. a CQ em orientações MIQE) para cada alvo e da referência endógena foram automaticamente obtido em condições padrão e quantificação relativa (RQ) foi calculada de um modo linear [22] por subtracção de (45-AVG deltaCT), através do qual 45 foi a amplificação total de número do ciclo e DCT = [(alvo CT) – (CT GUSB)] média avg para duplicatas. critérios de elegibilidade para uma avaliação mais aprofundada amostra incluiu valores GUSB CT de 38 para cada reação e deltaRQ para cada duplicar (variação intra-corrida) de 0,8. Para 3 ensaios sem curvas de amplificação foram obtidos para o FFPE e as amostras de ARNm de referência, enquanto que para um ensaio adicional foram observadas diferenças intra-correr de elevado valor de RQ em 87% das amostras (Tabela 2). Com base nas etapas de filtragem acima para o ensaio ea elegibilidade da amostra, foi finalmente possível para avaliar os resultados RQ por apenas 10 genes.
Ao aplicar os critérios acima para a elegibilidade de exemplo, o seguinte número de amostras informativas foi obtido por mRNA -alvo (ensaios informativos apenas): ACE2, 159; DHTKD1 171; FLOT1, 178; MAP4K1, 169; Nek2, 156; SFRS8, 184; PRKD1, 162; TBC1D4, 165; TGOLN2, 183 e YTHDC2, 176.
A análise estatística
modelos de expressão gênica prognóstico foram desenvolvidos exclusivamente no conjunto de treinamento. DFS foi medido a partir do momento do diagnóstico até progressão da doença ou morte Verificado. pacientes vivos sem progressão da doença verificada foram censurados na data do último contato. Genes selecionados tiveram que ser univariada associado com DFS (
p Art 0,01, Cox modelo de riscos proporcionais). O algoritmo se adapta modelos de riscos proporcionais de relacionar o DFS para cada gene, um gene de cada vez, e fornece um
valor de p para cada gene, testar a hipótese de que o DFS é independente do nível de expressão do gene particular. Genes encontrados para ser associado com DFS no conjunto de treino foram, então, classificados de acordo com seu valor de taxa de risco absoluto, fornecido pelo algoritmo. modelos de genes de prognóstico, compreendendo diferentes números de genes de topo do ranking, foram desenvolvidos usando o algoritmo de sobrevivência componente principal supervisionada [23]. O algoritmo calcula os componentes principais e executa a análise de regressão de Cox de risco proporcional para calcular um coeficiente de regressão (peso) para cada componente principal. Um principal modelo de componente supervisionado é desenvolvido para fornecer um índice prognóstico para cada paciente do estudo. Um índice prognóstico alta corresponde a um valor elevado de perigo de reincidência. Para avaliar o valor preditivo deste método, utilizou-se leave-one-out-validação cruzada, onde cada caso é omitido e toda a análise é realizada utilizando o resto das amostras. A fim de aplicar directamente esses modelos ao 1
st conjunto de validação, normalizamos a formação e os conjuntos de validação 1
st, usando o método empírico Bayes (EB) [24]. O método usa um algoritmo concebido para ajustar a variação experimental não-biológico ( “efeito lote”) entre diferentes conjuntos de dados. Ele reduz a variação inter-laboratorial, bem como as diferenças técnicas, devido à utilização de diferentes plataformas e abordagens metodológicas. Após a normalização, foi aplicado diretamente os modelos de genes para o 1
st conjunto de validação sem qualquer modificação.
curvas de Kaplan-Meier e Log-Rank testes foram utilizados para estimar e comparar as distribuições de sobrevivência em pacientes com alto – e de baixo risco de recorrência. Todos os
P valores
relatados são de dois lados. Cox análise de risco proporcional foi usado para análise uni e multivariada para ajuste de fatores prognósticos conhecidos. A análise estatística foi realizada utilizando os BRB-ArrayTools desenvolvidos pelo Dr. Richard Simon ea equipe de desenvolvimento BRB-ArrayTools eo pacote estatístico SPSS, versão 18.0, (IBM Corporation, Armonk, NY).
Foi utilizado o sem supervisão “subclasse Mapping” (submapa) método [25] para avaliar a correspondência molecular de pacientes com prognóstico favorável e desfavorável entre o conjunto de treinamento ea 1
st conjunto de validação. Este método bi-direcional avalia a associação de subtipos predefinidos em vários conjuntos de dados independentes, apesar de sua variação técnica. O algoritmo fornece o cálculo de um
valor p
para demonstrar a probabilidade de similaridade molecular entre as diferentes subclasses, é implementado no software GenePattern (Versão 3.0, Broad Institute, Cambridge, MA) e pode ser acessado no https://www.broad.mit.edu/genepattern/
análise set gene (GSA) foi utilizado para detectar rede gene desregulamentação característico de grupos de pacientes com bom ou mau prognóstico [26]. Usando dados publicamente disponíveis, então, previu status de ativação da via oncogénica em cada paciente do treinamento e 1
conjuntos de validação st. Aplicou-se os modelos de expressão de genes, anteriormente desenvolvido e validado in vitro, para estimar a probabilidade de activação da via em cada amostra [27]. Finalmente, usando modelos de regressão probit Bayesian nós atribuído a cada paciente uma probabilidade de ativação da via.
Resultados
Identificação e validação de classificadores prognósticos utilizando perfil de expressão gênica
O fluxograma de nosso estudo é mostrado na Figura 1 (diagrama cônjuge). Analisamos tumores de laringe primárias de 66 pacientes (conjunto de treinamento) e 54 pacientes (1
st conjunto de validação), utilizando perfis de expressão gênica global. Depois de avaliar a qualidade dos dados microarray, foram excluídos os 7 e 4 de outliers técnicas dos dois conjuntos, respectivamente. Para alguns dos genes, a expressão foi avaliada utilizando dois conjuntos de sondas diferentes. modelos conjunto de sonda prognósticos foram identificados exclusivamente no conjunto de treinamento. Depois de excluir um quarto dos genes menos variantes, nós nos concentramos em genes associados com DFS (Wald da
p Art 0,01). Nós, então, classificou os 253 conjuntos de sondas encontrados para ser significativamente associada com DFS, com base em seu coeficiente de regressão de Cox. Foram identificados vários modelos de prognóstico conjunto de sonda que consistem em tantos quanto 250 a apenas 20 conjuntos de sondas, que realizou igualmente bem no conjunto de treinamento.
Em seguida, aplicamos esses preditores multigênicas diretamente para o 1
st conjunto de validação. O modelo de conjunto de 30 sonda tiveram o melhor desempenho no conjunto de validação (o modelo com os genes menor número que demonstram a maior diferença estatística na DFS entre os pacientes de risco alto e baixo). Median DFS para os grupos de pacientes com prognóstico desfavorável e favorável, como previsto pelo modelo de conjunto de 30 sonda, foi de 34 e 80 meses, respectivamente (log-rank,
p
= 0,010). A taxa de risco (HR) para a recorrência no grupo de alto risco versus o grupo de baixo risco foi de 3,87 (IC 95% 1,28-11,73, Wald da
p
= 0,017). As curvas de Kaplan-Meier para todos os modelos de conjunto de sonda na formação e 1 conjuntos de validação
st podem ser encontrados em S1 Arquivo. A concordância entre as atribuições de risco tanto para a formação e 1
conjuntos de validação st com base nos diferentes classificadores foi alta, 81-87% (Cramer V test = 0,62-0,75).
Anotações de todos os 30 sonda conjuntos incluídos no nosso modelo estão apresentados na Tabela 3, enquanto que uma representação gráfica dos padrões de o modelo de conjunto de 30-sonda nos pacientes de alto e baixo risco de expressão do gene é mostrado na Figura 2a. Observou-se que, neste modelo, dois genes (ACE2 e MAP4K1) foram representados por dois conjuntos de sondas. A fim de evitar o efeito da ponderação, estes dois genes duas vezes mais em comparação com cada um dos outros conjuntos de sondas individuais, o que representa um único gene, por isso re nosso modelo na formação e 1
conjuntos de validação st utilizando uma única sonda marcada para cada gene. No conjunto de treinamento, a significância estatística no modelo 28-gene permaneceu idêntico (-rank teste log,
p Art 0,001, Figura 3a) com um baseado no modelo de conjunto de 30 sonda. Median DFS no conjunto de validação 1
st, como previsto pelo modelo 28-gene, foi de 34 e 80 meses, respectivamente (log-rank,
p
= 0,029, Figura 3b). A taxa de risco (HR) para a recorrência no grupo de alto risco versus o grupo de baixo risco foi de 4,38 (95% CI 1,06-7,01,
p = 0,036
de Wald).
Representação gráfica dos padrões de 30 sonda modelo de conjunto de expressão em pacientes com prognóstico favorável e desfavorável é mostrado no painel a. A cor vermelha indica a superexpressão e verde subexpressão cor dos respectivos genes. similaridade molecular de pacientes com prognóstico favorável e desfavorável na formação e 1
conjuntos de validação da rua, usando submapa, é mostrado no painel b. A barra abaixo indica a relação entre cor e Bonferonni corrigido
valores p
. A cor vermelha representa alta de confiança para a homogeneidade molecular entre os respectivos grupos, enquanto a cor azul representa a falta de confiança dos mesmos.
estimativas de sobrevivência de Kaplan-Meier para pacientes de alto e de baixo risco com base no 28-gene previsões de risco modelo no conjunto de treino (a) e 1
st conjunto de validação (b).
Para validar ainda mais o significado prognóstico destes perfis, nós aplicamos o nosso 28-gene modelo a uma coorte à disposição do público de pacientes com câncer em estágio precoce da laringe [28]. Devido à variação técnica entre os dois conjuntos de dados, 23 dos 28 genes do nosso modelo foram usadas para estratificar os pacientes com base em seu risco de recorrência. Apesar das limitações técnicas e biológicas (diferentes plataformas, número diferente de genes, no início vs all-estágio da doença) nosso modelo manteve o seu significado prognóstico. Median DFS para os grupos de pacientes com prognóstico desfavorável e favorável, como previsto pelo modelo 23-gene, foi de 118 e 161 meses, respectivamente (log-rank,
p
= 0,011, figura S1). O HR para a recorrência no grupo de alto risco versus o grupo de baixo risco foi de 4,37 (IC 95% 1,24-15,34, do Wald
p
= 0,022).
homologia molecular de pacientes com favorável e prognóstico desfavorável na formação e 1
conjuntos de validação st
Nosso perfil de 28-gene parece não ser apenas uma coleção de genes prognósticos mas para realmente capturar a biologia subjacente dos tumores. Para demonstrar a homogeneidade molecular de tumores de alto risco, foi utilizado mapeamento subclasse (submap), um método que avalia a semelhança molecular de grupos predefinidos pertencentes a diferentes conjuntos de dados. Nós fato ilustrado que grupos de pacientes com prognóstico pobre e boa na quota conjunto de treinamento os mesmos padrões biológicos com os respectivos grupos no conjunto de validação, acima e além da expressão de genes específicos. Gráficos exibindo bom “jogo molecular” dos pacientes de alto e de baixo risco são mostrados na Figura 2b.
significado prognóstico independente do modelo 28-gene
Estávamos interessados em demonstrar a independência significado prognóstico do nosso preditor multigênica. Foram incluídos na fase de análise e grau, os únicos fatores prognósticos conhecidos, para as quais estavam disponíveis para os pacientes do nosso estudo de dados. Incluímos também terapia de radiação, uma vez que é conhecida para reduzir significativamente a recorrência local. Na análise multivariada, o nosso modelo de 28 gene mantida significado prognóstico limítrofe no conjunto de validação 1
st. HR para a recorrência no grupo de alto risco foi de 2,67 (95% CI 0,99-7,22, Wald da
p
= 0,05) (detalhes são apresentados na Tabela 4).
análise Pathway nos grupos de alto e baixo risco
a fim de ganhar alguns esclarecimentos adicionais sobre os processos biológicos em pacientes com prognóstico favorável e desfavorável, foi realizada Gene Set Analysis (GSA). Nós exploramos redes de genes e temas biológicos, como descrito pela Enciclopédia Kyoto de genes e genomas (KEGG) Caminho base de dados. Nós, de fato identificou uma grande variedade de caminhos, diferencialmente expressos entre os dois grupos de pacientes (teste global da GSA Goeman
valores p Art 0,01). Estamos focados em vias desreguladas, tanto na formação e nos conjuntos de validação 1
st. A Tabela 5 apresenta vias seleccionado de interesse, enquanto a lista completa das vias pode ser encontrado como na Tabela S2. Várias destas vias de ter sido previamente demonstrado que desempenham um papel importante na progressão do cancro da cabeça e pescoço. Curiosamente, observou-se que os genes de adesão focal (FA) via [29], demonstrou ser prognóstico em nosso conjunto de dados, bem como no câncer de cabeça e pescoço, estratificada com sucesso nossos pacientes com base no seu risco de recorrência (detalhes na Figura 4 )
estimativas de sobrevivência livre de doença de Kaplan-Meier para os pacientes de alto e de baixo risco, como definido pelos genes da via de adesão focal (log-rank,
p
. 0,005).
padrões de ativação via oncogênicos em pacientes individuais
Além dos resultados da análise via acima mencionados que derivados de avaliar grupos de pacientes, procuramos explorar ativação da via em pacientes individuais . Nós utilizados anteriormente desenvolvida e validada “in vitro” a expressão do gene “read-outs” para identificar ativação de vias oncogênicas conhecidos em cada paciente do treinamento e 1
conjuntos de validação st. Investigou-se a Src, Ras, p-catenina e E2F3 vias, que foram mostrados anteriormente para ser associado com a sobrevivência em outros tipos de cancro [27]. Curiosamente, foi demonstrado que pacientes com mau prognóstico mais frequentemente tinham tumores caracterizada pela ativação da via Ras, odds ratio (OR) = 2,92 (95% CI 1,33-6,39, de Wald
p Art 0,01), enquanto os pacientes com bom prognóstico tumores mais frequentemente tiveram expositoras Src e ativação da via β-catenina, OR = 4,54 (IC 95% 1,64-12,50,
p
= 0,003) e 2,63 (95% CI 1,16-5,88,
p
= 0,03), respectivamente. Além disso, foi realizada Cox proporcional de regressão de riscos sobrevivência e observou que a ativação da via Ras foi encontrado para ser associado com mau prognóstico, HR = 2,55 (IC 95% 1,19-5,45,
p
= 0,020). Os Src, p-catenina e E2F3 vias não pareceu estar associada com o DFS em pacientes com cancro da laringe. Correspondentes curvas de Kaplan-Meier são mostrados na Figura 5. Finalmente, foi realizada uma análise multivariada, incluindo o modelo de 28-gene e a via de Ras e descobriram que o preditor mantido o seu significado prognóstico independente (de Wald
P
= 0,001) , assim como a via oncogénica (Tabela 6).
valores RQ foram combinados como variáveis binárias para obter perfis de 3-escala de acordo com os dados de matriz. Os marcadores, tal como indicado. curvas azuis e vermelhas correspondem aos modelos prognósticos esperados obtidos no modelo 28-gene para os genes particulares. curvas Grey: pacientes não classificados (escala intermediária)
validação qPCR de um subconjunto de genes a partir do 28-gene preditor
As análises acima mencionadas foram realizadas utilizando fresco congelado. amostras de tecido. No entanto, esta abordagem tem algumas limitações metodológicas quando se trata de prática clínica diária. Assim, buscou-se validar o nosso preditor multigênica usando qPCR em amostras de tecido tumoral FFPE, uma metodologia mais facilmente aplicável. Tal como descrito na secção Materiais e Métodos, no entanto, foi possível investigar de forma fiável na nossa série de amostras FFPE a expressão de apenas 10 dos 28 genes na preditor originais. As características descritivas dos valores RQ obtidos a partir das amostras informativos por ensaio estão descritos na Tabela 7 (meio, medianas, SD, min, max). Na primeira, buscou-se agrupar valores RQ contínuas para todos estes genes. No entanto, o agrupamento hierárquico não deu resultados comparáveis aos do preditor 28-gene de uma forma significativa, com a maioria dos valores de alta e baixa RQ agrupados no sentido oposto (Figuras 6a e b). Este foi nenhuma surpresa, porque apenas examinou 1/3 dos genes sondadas na assinatura matriz, enquanto dobra-alterações na expressão destes genes foi muito estreito e pode ser facilmente invertida com um método diferente (qPCR vs hibridação matriz ) ou um tipo diferente de material (FFPE versus tecidos fresco congelado). abordagens analíticas e estatísticas detalhadas para o comportamento de cada ensaio qPCR vs. a sonda matriz em FFPE combinado vs. amostras fresco congelado seria necessário para o esclarecimento desta discrepância, porém tal análise em profundidade foi além do escopo do presente estude. Portanto, o próximo aplicada pré-determinado perfil para a investigação de possíveis efeitos dos genes testados com qPCR no paciente DFS. Para este efeito, transformamos valores RQ contínuas em parâmetros binários (alta /baixa expressão). Com base na estreita dobra-mudança de expressão de genes entre os bons e maus grupos de prognóstico no preditor de 28 gene, utilizou-se valores RQ medianos para classificar alta e baixa expressão para os 10 genes avaliáveis. Log-rank de testes para estes genes como marcadores individuais produziu associações com resultados semelhantes aos observados para os genes correspondentes a assinatura U133A (altas /baixas padrões comparáveis com ascendente e descendente-regulação da expressão de genes, respectivamente, para a 6 de 10 genes), alguns dos quais foram significativas (PRKD1) ou mostraram uma tendência para significância (ACE2, FLOT1) (Tabela 8). agrupamento hierárquico de valores RQ contínuas para os últimos três genes produziu dois grupos de pacientes com significativamente diferente DFS (Figuras 6c e d). O padrão de expressão gênica espera estava presente no contexto correto com o resultado, mas estava ausente na maioria dos casos.
agrupamento hierárquico de valores RQ dos genes testados no
nd conjunto de validação 2 (amostras de FFPE ). Em painéis a e b, foram avaliados os valores de RQ dos 10 genes aplicáveis. Foram identificados dois grupos principais (A) que foram mostrados para ter um efeito significativo sobre o DFS paciente (b). O grupo 1 foi associada a um melhor prognóstico em relação ao agrupamento 2. No entanto, a maioria destes genes foram agrupados no sentido oposto do que o esperado a partir do classificador 28 para o gene. Em painéis c e d, o agrupamento dos 3 genes com associações individualmente significativos rendeu 2 grupos de pacientes com resultados distintos; em comparação com o classificador 28 do gene inicial, os padrões correctos de expressão do gene estavam presentes nos correspondentes grupos bons e maus prognósticos. cores verdes em painéis de um vermelho e e c denota alta e baixa expressão, respectivamente.
A aplicação dos elevados padrões de expressão gênica bom prognóstico /baixa para os valores RQ binárias transformado reveladas nenhum tumor único com o padrão esperado para todos os 10 genes.