Abstract

O 1B inibidor da quinase dependente da ciclina (p27Kip1) é uma proteína-chave na decisão entre a proliferação e sair do ciclo celular. As células quiescentes mostram p27Kip1 nucleares, mas esta proteína é exportada para o citoplasma em resposta aos sinais de proliferação. Nós informou recentemente que o tratamento catalase aumenta os níveis de p27Kip1

in vitro

e

in vivo

num modelo murino. A fim de caracterizar e ampliar estes resultados, avaliamos a regulação da p27Kip1 por peróxido de hidrogênio (H

2O

2) em células de melanoma humano e melanócitos. Observou-se uma elevada percentagem de núcleos p27KIP1 positivos em células de melanoma superexpressão ou tratados com catalase exógena, enquanto que os controlos não tratados mostraram uma localização citoplasmática de p27Kip1. Em seguida estudámos os níveis de p27Kip1 fosforilada (p27p) na serina 10 (S10) e na treonina 198 (T198), porque a fosforilação nestes locais permite a exportação nuclear desta proteína, conduzindo à acumulação e estabilização de p27pT198 no citoplasma. Foi demonstrado por western blot uma diminuição nos níveis p27pS10 e p27pT198 em resposta a H

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2 em células de melanoma de remoção, associado com p27Kip1 nuclear. Os melanócitos também exibiu p27Kip1 nuclear e níveis mais baixos de p27pS10 e p27pT198 do que as células de melanoma, que mostraram p27Kip1 citoplasmática. Também mostrou que a adição de H

2O

2 (0,1 uM) para as células de melanoma em G1 preso por privação de soro induz a proliferação e aumenta os níveis de p27pS10 p27pT198 e levando a localização citoplasmática de p27Kip1. A localização nuclear e modificações pós-translacionais de p27Kip1 também foram demonstrados por meio de tratamento da catalase do carcinoma colo-rectal e células de neuroblastoma, estendendo-se os nossos resultados para estes tipos de cancro humano. Em conclusão, mostramos no presente trabalho que H

2O

2 limpeza impede a exportação nuclear de p27Kip1, permitindo parada do ciclo celular, sugerindo que as células cancerosas tirar partido do seu estado pró-oxidante intrínseca para favorecer localização citoplasmática de p27Kip1 .

Citation: Ibañez IL, Bracalente C, Notcovich C, Tropper I, Molinari BL, Policastro LL, et al. (2012) fosforilação e subcelular Localização de p27Kip1 Regulamentado pela modulação Peróxido de hidrogênio em células cancerosas. PLoS ONE 7 (9): e44502. doi: 10.1371 /journal.pone.0044502

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Janeiro, 2012; Aceito: 08 de agosto de 2012; Publicação: 06 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Ibañez et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado por doações da Agência Nacional de Promoção Científica e Tecnológica (ANPCyT), Argentina (PICT 2007-01628 e PICT 05-14330) e a organização sem fins lucrativos Fundación Florencio Fiorini. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

vias de progressão do ciclo celular são o ponto final de cascatas de sinalização envolvidos no crescimento celular e proliferação celular. ciclo celular é fortemente coordenada por montagem sequencial e activação de complexos de proteína-quinase específica de fase [1], [2], formado por ciclinas e quinases dependentes de ciclina (CDK), as quais também são reguladas pelas proteínas INK4 e os inibidores de CDK ( CDKIs). Do tipo D ciclinas são expressas em todo o ciclo, em resposta ao mitogénio estimulação [2]. complexos de ciclina D-CDK4 e ciclina E-CDK2 são necessários para a passagem da fase G1 para a fase S. O CDKI 1B (CDKN1B), também conhecido como p27Kip1, foi pela primeira vez identificado como um regulador negativo crítica de CDK2 e G1 /S progressão do ciclo celular [2], [3]. Os níveis deste CDKI são ricos em células quiescentes, caem em resposta a estimulação mitogénica, permanecem em níveis de limiar nas células em proliferação, e aumenta novamente quando são retirados mitogénios [2].

Nos últimos anos, foi encontrado p27Kip1 que está envolvido na regulação de outros processos, tais como a migração celular [4], juntamente com a proliferação celular, a diferenciação e a apoptose [5]. Curiosamente, esta proteína pode exercer funções tanto positivos como negativos nestes processos [5]. As actividades de p27Kip1 são controladas pelo seu estado de concentração, localização subcelular e fosforilação [5]. Por exemplo, a fosforilação de p27Kip1 na serina 10 (S10) medeia p27Kip1 exportação para o citoplasma [6] – [9], a fosforilação na treonina 198 (T198) estabiliza a proteína no citoplasma e aumenta a motilidade celular dependente de p27Kip1 [4 ] e a fosforilação de treonina 187 (T187) aponta p27Kip1 como um alvo para proteólise por polyubiquitination [9] – [11]. A fosforilação de outros locais da proteína prejudica a importação nuclear de p27Kip1 e aumenta o conjunto de ciclina D1-CDK4 complexo [9], [12] – [15] ou inicia a transição de p27Kip1 de inibidor de ciclina E-CDK2 para substrato para proteólise [16], [17]. Alterações na fosforilação p27Kip1 pode levar a perda de estabilidade, a função aberrante ou mislocalization da proteína que, por sua vez, pode contribuir para a oncogénese [5], [9]. Neste sentido, tanto a perda de p27Kip1 nuclear e sua localização citoplasmática foram propostos como marcador prognóstico para a progressão do melanoma e pior evolução clínica [18].

Extracelular Ambiente pode iniciar Divisão ciclo celular ou a detenção, ativando ou desativando ciclina -CDK Complexos por diferentes caminhos

espécies reativas de oxigênio (ROS) são capazes de exercer diferentes efeitos sobre as células de acordo com a sua natureza, localização e níveis [19]. Particularmente, muitos tipos de células de mamíferos podem aumentar o seu crescimento quando exposta a níveis moderados de peróxido de hidrogénio (H

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2) e podem induzir a apoptose [20], a diferenciação terminal [21] ou de citotoxicidade [20], se forem expostos a altos níveis de H

2O

2. Eliminadora de H

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2 em células tumorais, quer tratado com catalase exógeno transfectadas ou expressando catalase inibe a proliferação de células [22] – [25]. Está bem documentado que o H

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2 está envolvida nas vias de transdução de sinal [26], [27], v.g. aumento dos níveis de H

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2 induzir sinais mitogénicos, tais como os relacionados com quinases reguladas por sinais RAS /extracelular sinais 1 e 2 (ERK1 /2) via e estresse-responsivos, como aqueles relacionados à c -jun quinases N-terminais (JNK) e vias p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) [26] – [28]. Além disso, ROS, e, em particular, H

2O

2, foram também implicados na modulação de tirosina-quinases receptoras (RTK) [29] e fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /AKT [30] vias.

tem sido relatado que as flutuações observadas no estado redox intracelular durante a progressão do ciclo celular pode ligar os processos metabólicos oxidativos para regulação do ciclo celular [31], [32]. H

2O

2 flutuações ao longo do ciclo celular foram associados com a regulação da expressão da ciclina D1 [33]. Em contraste, a remoção de endógena H

2O

2 por sobre-expressão de catalase e peroxidase de glutationa induz a paragem do G0 /G1 [25] e diminui a síntese de ADN de células [34]. Um estudo recente do nosso laboratório apresentaram níveis aumentados de p27Kip1 em resposta ao tratamento catalase num modelo murino de carcinoma de células escamosas

in vitro

e

in vivo

[35]. No entanto, os mecanismos envolvidos nessa regulação das proteínas do ciclo celular por H

2O

2 não foram totalmente compreendidos. Considerando que p27Kip1 foi proposto como um biomarcador de prognóstico para o melanoma humano [18], e que estes tumores exibiram um comportamento pró-oxidante, devido a um desequilíbrio no sistema antioxidante [36], [37] e para a desregulamentação melanina [38], humano células de melanoma se tornar um modelo interessante, a fim de alargar os nossos resultados anteriores sobre H

2O

2 regulação da p27Kip1.

o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da modulação da H

2O

2 andares no G1 /S de transição e, em particular, sobre a regulação da proteína CDKI, p27Kip1, no melanoma humano e linhas de células de melanócito. Nós demonstramos a relocalização intracelular de p27Kip1 depois de catalase ou H

2O

2 tratamentos. Isto foi associado com variações nos níveis de p27Kip1 fosforilado em S10 (p27pS10) e T198 (p27pT198), que desempenham um papel importante na regulação da localização subcelular desta proteína. Os resultados sobre a modulação p27Kip1 foram estendidas para outros tipos de células humanas de câncer, o carcinoma colorretal e células de neuroblastoma. Nossas descobertas podem fornecer uma pista para compreender o efeito do H

2O

2 na modulação de uma proteína reguladora-chave do G1 /S de transição com o consequente efeito sobre o ciclo celular e proliferação celular.

resultados

a catalase Tratamento Inibe a proliferação em melanoma celular G1 Arrest

tem sido sugerido que as células com um deslocamento oxidativo permanente no estado redox podem sofrer proliferação contínua que poderia, por sua vez, ser uma importante evento no aparecimento do fenótipo maligno [23], [39]. Neste sentido, a produção de grandes quantidades de ROS e, em particular, H

2O

2, foi relatado em linhas celulares de tumores [23], [40]. Catalase é uma enzima antioxidante que se decompõe H

2O

2 em água e oxigênio. Tendo em conta que o H

2O

2 podem difundir através de membranas, a adição de catalase ao meio de cultura pode produzir um decréscimo no nível intracelular de H

2O

2 atingir um estado de equilíbrio inferior correspondente concentração dentro e fora da célula [26], [33], [35]. Nós validado o nosso modelo de células de melanoma tratadas com catalase adicionada ao meio de cultura por medição da diminuição dos níveis de ROS através de 2 ‘, 7’-diacetato de ensaio dichlorodihydro-fluoresceína (DCFH-DA) (Figuras 1A e 1B). Esta redução nos níveis de ROS induzidas pela catalase resultou numa inibição significativa (p 0,01) da proliferação das células (Figura 2A). Além disso, as células A375 que sobre-expressam a catalase (CAT-A375-E9) exibido baixa taxa de proliferação de células, em comparação com células de controlo (Figura 2B). Este clone, A375-CAT-E9, mostraram os níveis mais baixos intracelular ROS dos clones estáveis ​​geneticina resistente gerados (Figura S1A) e uma diminuição significativa nestes níveis, em comparação com células transfectadas com um plasmídeo vazio (A375-pcDNA3) ou não -transfected (controle A375) (Figuras 1C e 1D). Estes resultados concordam com os níveis mais elevados de expressão catalase e da atividade observada no A375-CAT-E9, em comparação com células de controlo (Figura s1b e s1c).

(A-D) níveis intracelular ROS diminuiu em células de melanoma quer quando tratada com catalase, ou quando sobre-expressando-o. (A) histogramas representativos de DCF fluorescência de células de melanoma tratadas com 500 (linha azul) e 1000 (linha laranja) U /ml de catalase ou deixada sem tratamento (linha verde) durante 24 h. As células de controlo não exposto à DCFH-DA (linha preta) e as células controle tratados com catalase pouco antes DCFH-DA incubação (linha vermelha). (B) DCF fluorescência média (unidades arbitrárias) vs. catalase (CAT) dose. Os dados são expressos como média ± DP. ** P 0,01 vs células não tratadas (0 U /ml de catalase). (C) histogramas representativos de DCF fluorescência de células de melanoma com superexpressão da catalase (A375-CAT-E9) e seus controles (A375-pcDNA3 e células A375 não tratados). As células de controlo não expostos à DCFH-DA (linha preta), células de controlo tratadas com catalase pouco antes DCFH-DA incubação (linha vermelha) e as células incubadas com DCFH-DA (linha verde). (D) DCF média de fluorescência (unidades arbitrárias) de A375-CAT-E9, células A375-pcDNA3 e controle A375. Os dados são expressos como média ± DP. ** P 0,01 vs. controlo A375. (E-F) células de melanoma (A375) apresentaram níveis mais elevados de ROS intracelulares do que suas contrapartes não-tumoral (Porco-1 melanócitos). (E) histogramas representativos de DCF fluorescência das células de porco-1 e A375: células de controlo não expostas a DCFH-DA (linhas pretas), as células de controlo tratadas com catalase pouco antes DCFH-DA incubação (linha vermelha) e as células incubadas com DCFH- DA (linha verde). (F) DCF fluorescência média (unidades arbitrárias) da PIG-1 melanócitos e células de melanoma A375. Os dados são expressos como média ± DP. ** P 0,01 vs. PIG-1

taxa de proliferação (A) celular de células de melanoma tratadas com catalase, durante 24 h, em relação ao controlo, as células avaliadas pelo ensaio de MTT.. Os dados são expressos como média ± DP. ** P 0,01 vs. controlo. (B) taxa de proliferação no A375-CAT-E9, células A375-pcDNA3 e controle A375. Os dados são expressos como média ± DP. * P 0,05 vs. controlo A375. (C) a taxa de proliferação de não-tumoral (PIG-1) e células tumorais (A375). Os dados são expressos como média ± DP. ** P 0,01 vs. A375. Análise (D-I) ciclo celular avaliada por citometria de fluxo, após coloração com iodeto de propídio. (D) histogramas representativos de conteúdo de ADN de células A375 de melanoma tratadas com 1000 U /ml de catalase (CAT) durante 24 h e as células de controlo A375. (E) Percentagem de células de melanoma nas diferentes fases do ciclo celular em resposta ao tratamento de CAT. FBS células famintas foram utilizados como controle da prisão G1. (D) As células de controlo não tratadas, () 500 U /ml e (■) 1000 U /CAT ml e) células (FBS esfomeados. Os dados são expressos como média ± DP. * P 0,05 e ** P 0,01 vs controlo não tratado. (F) histogramas representativos de conteúdo de DNA de A375-CAT-E9, células A375-pcDNA3 e controle A375. (L) Percentagem de A375-CAT-E9 (■), A375-pcDNA3 () e as células de controlo A375 (D) em diferentes fases do ciclo celular. Os dados são expressos como média ± DP. ** P 0,01 vs. controlo A375. (H) histogramas representativos de conteúdo de DNA de PIG-1 melanócitos e células A375 de melanoma. (I) Percentagem de (■) não tumoral (PIG-1) e as células nas diferentes fases do ciclo celular tumoral (□) (A375). Os dados são expressos como média ± DP. ** P . 0,01 vs. células PIG-1

A fim de avaliar as células tumorais não-tumor e em associação com os seus níveis de ROS intracelulares, analisamos melanócitos contra células de melanoma. A Figura 2C mostra a taxa de proliferação de melanócitos PIG-1 em comparação com células de melanoma A375. Nós confirmamos que as células tumorais apresentaram níveis intracelulares mais elevados de ROS do que suas contrapartes não-tumorais neste melanoma /modelo melanócito (Figuras 1E e 1F). Não foram observadas diferenças significativas nos níveis de ROS e na taxa de proliferação (Figura S2) entre as células não tratadas e inativado pelo calor tratados catalase no modelo de melanoma. Assim, inactivado pelo calor a catalase foi utilizado como controlo.

Uma prisão significativa do ciclo celular G1 foi encontrada associada com a inibição da proliferação celular em células de melanoma tratadas com catalase, durante 24 h (Figuras 2D e 2E). Resultados análogos foram observados para A375-CAT-E9 vs. células controle A375 (Figuras 2F e 2G) A375-pcDNA3 ou. Melanócitos apresentaram maior porcentagem de células em fase G1 e uma menor percentagem na fase S de células de melanoma (Figuras 2 horas e 2I).

Em relação aos níveis das ciclinas e CDKs envolvidos na transição G1 /S, ciclina D1, ciclina e, CDK4 e CDK2, avaliadas por western blot, foi observada uma diminuição significativa nos níveis de ciclina D1 após H

2O

2 remoção por tratamento catalase ou catalase superexpressão (Figura S3), de acordo com os achados anteriores [35 ], [41].

Além disso, o sinal de ciclina D1 foi detectada por imunofluorescência extremamente baixo no núcleo de células tratadas com catalase e uma redução significativa da percentagem de núcleos positivos foi encontrado nestas células em comparação com células de controlo (Figura S4). células de melanoma apresentaram maior quantidade de ambos os níveis de ciclina D1 e a percentagem de núcleos positivos para ciclina D1, avaliadas por western blot e imunofluorescência do que suas contrapartes não-tumor PIG-1 (Figura S3 e S4), que estaria relacionada com os níveis aumentados de ROS e a percentagem de células na fase S A375. Não houve diferenças significativas em E ciclina, foram observados níveis de CDK2 e CDK4 entre catalase-tratadas e as células de controlo e entre as células de tumor (Figura S3) não tumoral e. Assim, a diminuição nos níveis de ciclina D1 observadas estariam envolvidos em G1 /S de captura induzida pela catalase em células A375.

A catalase tratamento induziu Nuclear Localization de p27Kip1

Considerando a paragem em G1 induzido pela catalase e a importância da localização subcelular da proteína inibidora p27Kip1 para a sua actividade reguladora, o efeito de H

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2 eliminadora sobre a localização desta proteína foi estudada por imunofluorescência. Notavelmente, p27Kip1 foi localizada primeiramente no interior do núcleo em células de melanoma tratadas com ou sobre-expressam catalase em comparação com os controlos, em que a distribuição p27Kip1 foi predominantemente citoplasmática (Figuras 3A-3D). Além disso, os melanócitos exibiram uma percentagem mais elevada de células positivas p27kip1 do que a de células de melanoma A375 (Figuras 3E e 3F). Esta proteína foi localizada principalmente no núcleo em células não tumorais e no citoplasma de células de tumor (Figuras 3E e 3F).

(A-F) Localização subcelular de p27Kip1 avaliada por immunocytofluorescence. células de melanoma (A-B) tratou-se com 500 e 1000 U /ml de catalase (CAT), por períodos de 6 ou 24 h, ou deixadas sem tratamento. FBS células famintas foram utilizados como controle da prisão G1. (C-D) modelo de superexpressão da catalase (células A375-CAT-E9) vs. controles (A375-pcDNA3 e células de controlo A375). (E-F) não tumoral (PIG-1) versus células tumorais (A375). (A, C e E) Imagens representativas de p27Kip1 immunocytofluorescence mostrando a localização subcelular da proteína. DAPI: a coloração do ADN nuclear; p27Kip1: FITC coloração de proteína p27Kip1. (B, D e F) Percentagem de (□) citoplasmas positivas e positivas (■) núcleos para p27Kip1 relativos ao número total de células contadas. Os dados são expressos como média ± DP. (B) ** p 0,01 vs controlo. (D) * P 0,05 e ** P 0,01 vs. controlo A375. (F) * p 0,05 e ** P 0,01 vs. células não tumorais. (L-H) A expressão aumentada de p27Kip1 nuclear em células A375 depois de mil tratamento U /ml de catalase (CAT), em comparação com células de controlo A375 (tratados com 1000 U /ml de catalase inactivado pelo calor, EM-CAT) durante 24 h, detectada por western blot de extractos nucleares e citosólicos (ver Métodos). (G) imagens immunoblot representativos são mostrados. C: extractos citoplasmáticos; N: extractos nucleares. valores actina e Ku-70 densitométricos foram usadas para normalizar para a carga de proteína citoplasmática e nuclear, respectivamente. (H) Os valores densitométricos relativas de (□) () ■ níveis p27kip1 nucleares e citoplasmático. Os resultados são referidos com células de controlo. Os dados são expressos como média ± DP. * P . 0,05 vs. controlo

A fim de confirmar os efeitos do H

2O

2 de eliminação na localização p27Kip1 observado por imunofluorescência, os níveis desta proteína em nuclear e citosólica extractos de células de melanoma tratadas com catalase foram avaliadas por transferência de western. Foi demonstrado um aumento significativo dos níveis de p27kip1 em extractos nucleares de células tratadas com catalase em comparação com o controlo (Figura 3G e 3H).

Estes resultados demonstram a modulação da localização intracelular de p27Kip1 na regulação da proliferação celular por catalase e confirmar nossos resultados anteriores [35], estendendo-se os resultados para células A375 humanas. A persistência de p27Kip1 no núcleo induzida por H

2O

2 remoção favoreceria o bloqueio do ciclo celular na transição G1 /S.

H

2O

2 Modulação leva a Modificações pós-tradução de p27Kip1

também demonstrou um aumento significativo nos níveis totais de p27Kip1 em resposta ao tratamento ou a sobre-expressão de catalase avaliada por western blot (Figura 4). Isto poderia estar relacionada com os elevados níveis de p27Kip1 observados no núcleo das células tratadas catalase (Figura 3E). Além disso as células de melanoma apresentaram níveis mais baixos desta proteína inibidora, em comparação com os melanócitos (Figura 4). No que diz respeito Western blot (Figura 4) e imunofluorescência (Figura 3) Os resultados e tendo em conta que p27Kip1 níveis, função e localização são regulados por fosfolarização, os níveis de p27Kip1 fosforilado em S10 (p27pS10), T198 (p27pT198) e T187 (p27pT187) em resposta a H ​​

2O

2 de eliminação foram avaliadas por transferência de western. A fosforilação de p27Kip1 em S10 e T198 é um evento chave para a exportação nuclear desta proteína e progressão do ciclo celular e que demonstrou uma queda significativa nos níveis de p27pS10 e p27pT198 em células que sobre-expressam ou tratados com catalase em comparação com os controlos (Figura 4 ). Além disso, PIG-1 melanócitos revelou níveis inferiores de p27pS10 e p27pT198 do que a sua contraparte de tumores (Figura 4).

A expressão de p27Kip1 e p27Kip1 fosforilado em S10 (p27pS10) e T198 (p27pT198) foi analisada por? Western blot? . (A-B) células de melanoma A375 tratadas com catalase (CAT) de 6 e 24 h. FBS células famintas foram utilizados como controle da prisão G1. (C-D) modelo de superexpressão da catalase (células A375-CAT-E9) vs. controles (A375-pcDNA3 e células de controlo A375). (E-F) não tumoral (PIG-1) versus células tumorais (A375). (A, C e E) imagens immunoblot representativos. (B, D e F) valores densitométricos relativas de () níveis p27Kip1, (□) p27pS10 e (■) p27pT198. valores densitométricos de actina foram usadas para padronizar a carga de proteína. Os resultados são referidos para controlar sem tratamento (em B e D) e de células em (F) não tumoral (PIG-1). Os dados são expressos como média ± DP. (B) * p 0,05 e ** P 0,01 vs controlo não tratado. (D) ** p 0,01 vs. controlo A375. (F) ** p . 0,01 vs. células não tumorais

Estas descobertas sugerem que níveis reduzidos de H

2O

2 por catalase impedir a fosforilação de locais específicos de p27Kip1 evitando assim a exportação nuclear da proteína e que conduz a paragem do ciclo celular através da acumulação de p27Kip1 no núcleo. Além disso, a fosforilação de p27Kip1 no T187, que está envolvida no desencadear proteólise desta proteína, foi avaliado em células de melanoma tratadas com catalase e não há diferenças significativas foram observadas versus os controlos não tratados (Figura S5).

Considerando que os factores de crescimento desencadear H

2O

2 de produção que conduz à activação de vias de sinalização regulam a proliferação celular [27], foi avaliada como H

2O

2 está envolvido na modulação da p27Kip1 em G1 células A375 presos por FBS fome incubadas com diferentes níveis de H

2O

2 para 24 h. 5A figura mostra o aumento dos níveis intracelulares de ROS de uma maneira dependente da dose nas células tratadas com 0,1-10 ^ M H

2O

2 em comparação com células de FBS em jejum. Foi relatado anteriormente que a aplicação de 0,1-7 uM H

2O

2 para células cultivadas em resultados intracelular H

2O

2 níveis de cerca de 0,01-0,07 uM e directamente estimula a proliferação celular. Por outro lado, quantidades crescentes de morte celular ocorre com concentrações aplicadas de H

2O

2≥10 uM [revisto em 26]. No nosso modelo celular, a incubação de células de FBS fome com 0,1 ^ M H

2O

2 induziu um aumento na taxa de proliferação em comparação com células não tratadas de FBS em jejum. Por outro lado, não se observou qualquer efeito na proliferação celular com as outras doses de H

2O

2 utilizado (Figura 5B). As células tratadas com 0,1 fiM H

2O

2 exibiu uma distribuição p27Kip1 predominantemente citoplasmática; semelhante a células incubadas com FBS a 10%, enquanto p27Kip1 foi encontrado principalmente no núcleo em células de FBS em jejum não tratados (Figuras 5C e 5D). A localização subcelular desta proteína nas células tratadas com 0,01? M de H

2O

2 foi comparável ao padrão observado nas células de FBS em jejum e a adição de 1-10 uM de H

2O

2 a A375 células famintas FBS resultaram em uma porcentagem similar de p27Kip1 nuclear e citoplasmática (Figuras 5C e 5D). As transferências de Western mostraram uma diminuição dos níveis de p27Kip1 em células tratadas com 0,01? M de H

2O

2, em comparação com células de FBS em jejum e para as células tratadas com 0,1-10 jiM de H

2O

2 (Figuras 5E e 5F). Os níveis de p27pS10 e p27pT198 em células tratadas com 0,1 jiM de H

2O

2 aumentou como em células incubadas com FBS a 10%, enquanto as células FBS esfomeados mostraram níveis baixos de p27pS10 e p27pT198 (Figuras 5E e 5F). Pelo contrário, não foram observadas diferenças significativas nos níveis de p27pT187 em células tratadas com exógeno H

2O

2 (0,1 e 10 uM) em comparação com ambas as células de controlo de FBS em jejum e 10% de FBS incubadas (Figura S5 ). Estes achados sugerem que H

2O

2 em um nível mitogênica de 0,1 mM para o nosso modelo celular regula a fosforilação p27Kip1 levando a localização citoplasmática desta proteína e favorecendo a proliferação celular.

Melanoma células (A375) cultivadas em meio completo com 10% de FBS foram presos pela inanição de FBS (0% de FBS) durante um período de 24 horas e depois as células foram incubadas com diferentes concentrações de H

2O

2 (0,01-10? M) ou 10% de FBS. níveis (A) intracelular ROS medidos por ensaio DCFH-DA. (B) taxa de proliferação celular avaliada pelo ensaio de MTT. (C) Imagens representativas de p27Kip1 immunocytofluorescence mostrando a localização subcelular da proteína. DAPI: a coloração do ADN nuclear; p27Kip1: FITC coloração de proteína p27Kip1. (D) Percentagem de (□) citoplasmas positivos e (■) núcleos positivos para p27Kip1 relativos ao número total de células contadas. (E) A expressão de p27Kip1, p27pS10 p27pT198 e analisados ​​por Western blot. (F) Os valores relativos densitométricos de níveis p27kip1 (), (□) p27pS10 e (■) p27pT198. valores densitométricos de actina foram usadas para padronizar a carga de proteína. Os resultados são referidos de controlo incubadas com 10% de FBS. (A, B, D e F) Os dados são expressos como média ± DP. * P 0,05, ** p 0,01 e *** p 0,001 vs. células incubadas com 10% de FBS;

# p 0,05,

## p 0,01 e

### p 0,001 vs. células FBS-esfomeados não-expostos ao H

2O

2

Assim, demonstramos que H

2O

2 seria implicado na modulação da chave modificações pós-traducionais de regulação de proteína p27Kip1 em células de melanoma.

catalase também modula a proliferação celular e subcelular de localização de p27Kip1 no carcinoma colorectal e neuroblastoma células

a fim de alargar os resultados observados para células de melanoma tratados com catalase a outros tipos de células cancerosas humanas, avaliou-se a proliferação celular, ciclo celular e distribuição intracelular p27Kip1 em colorectal o carcinoma (LoVo) e células de neuroblastoma (Paju). A caracterização dos nossos modelos celulares a nível ROS mostraram que as células LoVo apresentaram menores níveis de ROS intracelulares que Paju e células A375 (Figura S6). Curiosamente, foi observada uma taxa de proliferação baixo (p 0,01) para ambas as células Paju (Figura 6) LoVo e em resposta aos níveis reduzidos de ROS induzidas pela adição de catalase, a culturas de células (Figura 6). células LoVo e Paju tratados com catalase durante 24 h exibiu uma paragem do ciclo celular G1 significativa (Figura 6) associada a uma diminuição dos níveis de ciclina D1 (Figura S7). Em concordância com estes resultados, o sinal para a ciclina D1 detectado por imunofluorescência foi extremamente baixo no núcleo de células tratadas com catalase e uma redução significativa da percentagem de núcleos positivos foi encontrado nestas células em comparação com células de controlo (Figura S8). Não houve diferenças significativas em ciclina E, foram observados níveis CDK2 e CDK4 entre as células catalase-tratados e não-tratados (Figura S7).

células LoVo e Paju foram tratados com 0-1000 U /ml catalase (CAT) durante 24 h. (A-B) os níveis intracelulares ROS determinado por ensaio de DCFH-DA. (A) histogramas representativos de DCF fluorescência das células tratadas com 500 (linha azul) e 1000 (linha laranja) U /ml de catalase ou deixada sem tratamento (linha verde) durante 24 h. As células de controlo não exposto à DCFH-DA (linha preta) e as células controle tratados com catalase pouco antes DCFH-DA incubação (linha vermelha). (B) DCF fluorescência média (unidades arbitrárias) vs. dose de catalase. taxa de proliferação (C) celular de células LoVo e Paju tratados com catalase, durante 24 h, em relação às células de controlo, avaliada pelo ensaio de MTT. (D-E) análise do ciclo celular avaliada por citometria de fluxo, após coloração com iodeto de propídio. (D) histogramas representativos de células de conteúdo de ADN tratadas com catalase (CAT). (E) percentagem de células nas diferentes fases do ciclo celular em resposta ao tratamento de CAT. FBS células famintas foram utilizados como controle da prisão G1. (D) As células de controlo não tratadas, () 500 U /ml e (■) 1000 U /CAT ml e) células (FBS esfomeados. (B, C e E) Os dados são expressos como média ± DP. * P 0,05 e ** p . 0,01 vs. controlo

(A e B) A localização nuclear de p27Kip1 com catalase (CAT) foi detectada por immunocytofluorescence. (A) Imagens representativas de p27Kip1 immunocytofluorescence mostrando a localização subcelular da proteína. DAPI: a coloração do ADN nuclear; p27Kip1: FITC coloração de proteína p27Kip1. (B) Percentagem de positivos citoplasmas (D) e de núcleos positivos (■) para p27Kip1 relativos ao número total de células contadas. (C e D) Aumento dos níveis de p27Kip1 e diminuição de p27Kip1 fosforilado em S10 (p27pS10) e T198 (p27pT198) em resposta a H

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2 de eliminação, analisado por western blot. (C) imagens immunoblot representativos. (D) Os valores densitométricos relativas de () níveis p27KIP1, (□) p27pS10 e (■) p27pT198. valores densitométricos de actina foram usadas para padronizar a carga de proteína. Os resultados são referidos para controlar sem tratamento. (B e D) Os dados são expressos como média ± DP. * P 0,05 e ** P 0,01 vs controlo não tratado. (A-D) FBS células famintos foram utilizados como controle da prisão G1.

carcinoma e de neuroblastoma células colorretais tratados com catalase também mostrou p27Kip1 localizada principalmente no núcleo, em comparação com os controles, em que a distribuição p27Kip1 foi predominantemente citoplasmática (Figuras 7A e 7B mostram os tratamentos durante 24 h e as Figuras S9A e ​​S9B mostrar tratamentos durante 6h). Além disso, foi demonstrado por western blot um aumento significativo nos níveis de p27Kip1 em resposta ao tratamento com catalase para ambos LoVo e Paju células (Figuras tratamentos 7C e 7D para 24 h e as Figuras tratamentos S9C S9D e durante 6 h). Finalmente, reproduzida uma diminuição significativa nos níveis de p27pS10 e p27pT198 em células de carcinoma colorectal e de neuroblastoma tratadas com catalase em comparação com controlos (Figuras 7C e 7D tratamentos para 24 h e as Figuras tratamentos S9C S9D e durante 6 h).

Estes resultados confirmaram e ampliaram nossas descobertas anteriores. Sugerimos que as ROS diminuição de células cancerosas humanas diferentes pela catalase regula a localização subcelular de p27Kip1 evitar a fosforilação da proteína em locais chave (S10 e T198) que conduz à acumulação de p27Kip1 no núcleo que favorece a paragem do ciclo celular.

Discussão

neste estudo, foi demonstrada uma alteração na localização subcelular de p27Kip1 mediada por alterações na fosforilação de resíduos específicos desta proteína em resposta a H

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2 variações de nível . Os dados são expressos como média ± DP. Os dados são expressos como média ± DP. Os dados são expressos como média ± DP. Os dados são expressos como média ± DP. Os dados são expressos como média ± DP. Os dados são expressos como média ± DP.